响应面法优化豆乳链球菌增殖培养基

刘丽莎1,2，陶国琴2，郭 宏1,2，吕晓莲3，贾建会1,2，彭义交1,2

（1.北京市食品研究所，北京 100162；2.北京食品科学研究院，北京 100068；

3.北京二商集团有限责任公司，北京 100053）

摘 要：针对优良酸豆乳发酵菌株豆乳链球菌（Streptococcus sojalactis）SY1.1增殖培养基进行优化，研究碳氮源对豆乳链球菌生长的影响，并采用响应面法优化豆乳链球菌SY1.1的增殖培养基配方。结果表明：以AST为基础培养基，优选大豆蛋白胨和蔗糖为最适氮源和碳源，质量比为1∶2，采用Plackett-Burman设计对11 种促乳酸菌生长因子进行评价，利用中心旋转组合设计和响应面分析确定增殖培养基的配方为：蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨20 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、番茄汁85.8 mL/L、胡萝卜汁109 mL/L、玉米浆6 g/L，pH 6.8。SY1.1以接种量2%，在37℃培养12h时，活菌数可达（8.9±0.2）×108 CFU/mL，较初始豆浆培养基的活菌数（1.03×108 CFU/mL）提高了7.64 倍。

关键词：豆乳链球菌；增殖培养基；Plackett-Burman设计；响应面法优化

Optimization of Culture Medium for Streptococcus sojalactis SY1.1 Using Response Surface Methodology

LIU Li-sha1,2, TAO Guo-qin2, GUO Hong1,2, LÜ Xiao-lian3, JIA Jian-hui1,2, PENG Yi-jiao1,2

(1. Beijing Food Research Institute, Beijing 100162, China; 2. Beijing Academy of Food Sciences, Beijing 100068, China;

3. Beijing Er Shang Group Co. Ltd., Beijing 100053, China)

Abstract: In this paper, response surface methodology was used to optimize the composition of AST-based culture medium for Streptococcus sojalactis SY1.1 to obtain high density of bacteria. Through single-factor experiments, the optimum carbon source and nitrogen source were found to be sucrose and soy peptone, respectively. The major medium components for SY1.1 were screened by Plackett-Burman design. Then, the optimum culture medium was determined to consist of 10 g/L
sucrose, 20 g/L soy peptone, 2 g/L dipotassium phosphate, 85.8 mL/L tomato juice, 109 mL/L carrot juice and 6 g/L corn steep liquor at pH 6.8 by central composite design and response surface analysis. The cell production of SY1.1 cultured in the optimized medium for 12 h at 37 ℃ was (8.9±0.2) ×108 CFU/mL, which was 8.64 times higher than that (1.03×108 CFU/mL)
observed with soymilk as initial medium.

Key words: Streptococcus sojalactis; optimum culture medium; Plackett-Burman; response surface optimization

中图分类号：TS214 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）11-0124-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201411025

酸豆奶是以大豆为原料，经乳酸菌发酵制成的乳状食、饮两栖型产品。微生物作用能消除大豆的抗营养因子和有害物质[1-2]，产生多种多肽、氨基酸和具有香味的有机酸、醇、酯[3]，还具有抗肿瘤、抗氧化、降低胆固醇等保健功能[4]。此外大豆不含胆固醇和乳糖，是一种优质植物蛋白发酵原料[5]。

目前对酸豆乳发酵工艺研究较多，研究人员利用乳酸乳球菌[6]、嗜热链球菌[7]、干酪乳杆菌[8]、双歧杆菌[9]等发酵酸豆乳。但乳酸菌在豆乳中的生长不及牛乳，存在发酵风味不佳、乳清析出和质地粗糙等问题[10]，开发酸豆乳优良菌株及发酵剂非常重要。本项目组从豆浆中分离到天然菌株——豆乳链球菌（Streptococcus sojalactis）SY1.1，产酸快，凝乳时间小于3 h，产生浓郁的酸豆乳清香，是理想的酸豆乳发酵菌种。优良的发酵剂增殖培养基是制备发酵剂的前提，应具备以下特点：目标菌株生长良好、菌体易分离、成本低廉。研究证明Plackett-Burman试验和响应面设计相结合可筛选适合菌株增殖的因素，建立连续变量曲面模型，研究各因素水平及交互作用的影响，能大幅降低劳动强度缩短实验时间，已应用于不同种类培养基成分的快速筛选及复配[11]。

本实验对适合豆乳链球菌增殖的基础培养基进行筛选，优化其碳源和氮源，并采用Plackett-Burman设计和响应面法筛选优化豆乳链球菌的生长强化因子 [12]，提高菌体密度，为酸豆乳发酵剂的开发提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

菌种：豆乳链球菌（Streptococcus sojalactis）SY1.1，分离自中国传统食品豆浆，由北京市食品研究所食品微生物学实验室选育保藏。

1.1.2 培养基

豆浆培养基：大豆→清洗→浸泡（10 h）→打浆（豆、水质量比1∶8）→过滤→灭菌（115 ℃、10 min），用于豆乳链球菌菌种活化。

TJA固体培养基[13]：用于豆乳链球菌活菌计数。

TSB培养基、基础培养基、AST培养基、营养肉汤、MSA培养基按《微生物培养基的制造与应用》[14]配制。

番茄汁、胡萝卜汁和玉米汁：市售新鲜番茄、胡萝卜和玉米→清洗→热烫（90～95 ℃、3 min）→榨汁→过滤→调配（1 kg果蔬调配成2 L果汁）→灭菌备用。

1.1.3 试剂

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米浆 北京蓝弋化工产品有限责任公司；牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、酪蛋白 北京奥博星生物技术有限公司。

1.1.4 仪器设备

SCL-1300型垂直流洁净工作台 北京赛伯乐实验仪器有限公司；PHS-25型酸度计（数显） 上海精密科学仪器有限公司；722型可见分光光度计 上海光谱仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

将SY1.1接种于豆浆培养基中，37 ℃培养至凝乳，传代活化3 次至菌种活力恢复至3.5 h内凝乳。

1.2.2 活菌数测定

采用倾注平板TJA平板法，37 ℃培养48 h计数。

1.2.3 生物量测定

采用分光光度计于波长600 nm处测定菌液OD600 nm，以相应未接菌培养液为空白对照。

1.2.4 SY1.1生长基础培养基的确定

豆乳链球菌SY1.1活化后以 2%（约106 CFU/mL）接种量分别接入适合乳酸菌增殖的培养基（MRS、AST、M17、TSB、MSA和营养肉汤培养基）中，于37 ℃培养12 h，测定增殖期间生物量（OD600nm）的变化，选择最适的基础培养基。

1.2.5 碳源对SY1.1增殖的影响

在AST中以葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖等分别替代碳源（质量浓度10 g/L），接种2%（约106 CFU/mL）SY1.1，于37 ℃培养12 h，测定生物量（OD600 nm）变化，研究不同碳源对豆乳链球菌生长的影响。

1.2.6 氮源对SY1.1增殖的影响

在基础培养基中按相同含氮量（1.7 g/L）以多价胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏和酪蛋白胨，替代AST中氮源，接种2%（约106 CFU/mL）SY1.1，于37 ℃培养12 h，研究不同氮源对豆乳链球菌生长的影响。

1.2.7 碳氮比对SY1.1增殖的影响

按碳氮质量比1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3配制不同培养基，接种2%（约106 CFU/mL）SY1.1，于37 ℃培养12 h，研究碳氮比对豆乳链球菌生长的影响。

1.2.8 Plackett-Burman试验研究生长因子对SY1.1增殖的影响

根据相关文献[15-19]报道的能促进乳酸菌增殖的生长因子，在培养基中添加11种生长因子：番茄汁（0～100 mL/L）、胡萝卜汁（0～100 mL/L）、玉米汁（0～100 mL/L）、啤酒汁（0～100 mL/L）、玉米浆（0～50 g/L）、蜂蜜（0～10 g/L）、硫酸镁（0～0.2 g/L）、
硫酸锰（0～0.15 g/L）、氯化钙（0～0.2 g/L）、硫酸亚铁（0～0.1 g/L）、吐温-80（0～1 mL/L）。采用Plackett-Burman设计筛选豆乳链球菌SY1.1生长强化因子，试验设计及数据分析等采用Design Expert软件完成。

1.2.9 响应面法优化生长因子添加量

筛选出影响豆乳链球菌SY1.1增殖的关键影响因素，采用旋转中心组合设计（Central Composite Rotatable Design，CCRD）法，优化该菌增殖的最佳培养基配方。试验设计及数据分析等采用Design Expert软件完成。

2 结果与分析

2.1 SY1.1生长基础培养基的确定

对几种适合于乳酸菌增殖的培养基进行研究，豆乳链球菌的增殖情况如图1所示。

图 1 菌株SY1.1基础培养基筛选

Fig.1 Screening of basic medium for strain SY1.1

以OD600 nm为指标考察SY1.1在6种培养基中的增殖情况，由图1可知，菌株SY1.1在AST培养基中生长良好，显著高于MRS培养基（P＜0.01）。AST培养基成分较简单、配制方便、溶液澄清无沉淀，便于在后期进行菌体富集浓缩，因此选择AST培养基作为基础培养基进行优化。

2.2 碳源对SY1.1增殖的影响

以AST培养基作为基础培养基，以葡萄糖、乳糖、淀粉分别替代蔗糖，豆乳链球菌培养12h后的增殖情况如图2所示。

图 2 碳源对菌株SY1.1增殖的影响

Fig.2 Screening of carbon source for strain SY1.1

由图2可知，菌株SY1.1可以代谢葡萄糖、乳糖、蔗糖进行增殖，其中蔗糖的效果最佳，因此将蔗糖作为SY1.1增殖培养基的碳源。

2.3 氮源对SY1.1增殖的影响

在AST中分别添加8种有机氮源替代AST中氮源，豆乳链球菌培养12h后的增殖情况如图3所示。

1.多价胨；2.胰蛋白胨；3.大豆蛋白胨；4.酵母膏；5.蛋白胨；6.酵母浸粉；7.牛肉膏；8.酪蛋白胨；9. AST 初始培养基。

图 3 氮源对菌株SY1.1增殖的影响

Fig.3 Screening of nitrogen source for strain SY1.1

由图3可知，大豆蛋白胨和酵母浸粉较AST培养基能够显著提高豆乳链球菌的增殖（P＜0.01），大豆蛋白胨效果最佳，其余氮源的增殖效果较差，其中酪蛋白胨不能作为氮源被豆乳链球菌利用。豆乳链球菌SY1.1分离自传统豆浆中，大豆蛋白胨的氨基酸组成可能更接近SY1.1原生长环境——豆浆，适合豆乳链球菌的增殖。因此，选择大豆蛋白胨作为豆乳链球菌SY1.1的氮源。

2.4 碳氮比对SY1.1增殖的影响

改变蔗糖和大豆蛋白胨的添加比例（质量百分比），豆乳链球菌培养12 h后的增殖情况如图4所示。碳氮比对菌株生长有重要作用，直接影响其生长和发酵产物的积累。有报道表明碳氮比在2～0.5时，菌体生长情况良好，菌体密度较高[19]。当碳氮比小于1∶2时，豆乳链球菌的生物量随碳氮比增高而增加，超过1∶2后，豆乳链球菌的生物量保持相对稳定，无明显的增长。因此，将培养基中碳氮比确定为1∶2。

图 4 碳氮比对菌株SY1.1增殖的影响

Fig.4 Screening of C/N ratio for strain SY1.1

2.5 影响豆乳链球菌SY1.1增殖的关键生长因子的确定

通过Plackett-Burman试验（结果未列出）从11 种已报道的乳酸菌生长因子中筛选出影响豆乳链球菌SY1.1增殖的关键生长因子。番茄汁（P＝0.030 8）、胡萝卜汁（P＝0.034 1）和玉米浆（P＝0.012 7）在95%概率水平差异显著，其余因子均不显著，因此选择番茄汁、胡萝卜汁和玉米浆作为豆乳链球菌SY1.1的生长强化因子，通过响应面优化进一步考察对SY1.1增殖的影响。乳酸菌是生长因子异养型微生物，需要额外提供维生素等多种生长因子，保证菌株的正常代谢，促进其生长。研究表明，多种果蔬汁可促进乳酸菌的生长，番茄汁和胡萝卜汁含有丰富的维生素和矿物质离子，能满足乳酸菌对营养的需求[20]。

2.6 响应面分析优化SY1.1增殖培养基

通过Plackett-Burman设计选出SY1.1的关键生长因子：番茄汁、胡萝卜汁和玉米浆，按三因素三水平旋转中心组合设计添加至优化后的基础培养基，试验设计及结果如表1所示。

表 1 旋转中心组合设计及结果

Table 1 CCRD design with experimental and predicted cell
population of SY1.1

Box-Behnken设计数据采用Design Expert 8.0.7.1软件响应面分析程序进行二次多项回归拟合，获得3种关键生长因子与菌体的二次多项式回归模型方程：

Y＝85.80－3.14A＋3.86B＋2.00C－5.00AB－1.75AC＋
2.08BC－7.41A2－15.26B2－13.67C2

由该方程得到的预测值如表1所示，二次回归方程及各项方差分析结果如表2所示。

表 2 活菌数二次多项模型及各项的方差分析

Table 2 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由表2方差分析结果可知，模型P＜0.000 1表明模型极显著，失拟项P＝0.108＞0.05，在α＝0.05水平上不显著；相关系数R2＝0.979 7，表明模型相关性良好；
R2Adj＝0.980 2，表明98%的响应面变化可以通过该模型解释，与实际情况拟合良好，可用于SY1.1的生长增殖情况预测。

图 5 各因素及其相互作用对SY1.1活菌数影响的响应面及等高线图

Fig.5 Response surface and contour plots showing the effect of medium components on the growth of SY1.1

除AC项外，其余因素对SY1.1活菌数的影响均显著，AB、BC交互影响显著，AC交互作用不显著。由二次多项方程得到的响应面三维立体图及等高线图如图5所示，直接反映出各因素及其交互作用对响应值的影响，等高线稀疏显示响应面曲面图的平陡。

SY1.1的活菌数在各因素设定范围内都有最大值，采用Optimization对模型求导得出极值点，当各因素添加量为番茄汁8.58 mL/100mL、胡萝卜汁10.90 mL/100mL、玉米浆0.60 g/100mL时，模型预测最大响应值为
8.7×108 CFU/mL。在上述优化后的培养基中，按2%接种SY1.1，37℃培养12 h，SY1.1实际活菌数为（8.9±0.2）×108
CFU/mL，可见该模型能较好预测SY1.1的菌体生长情况。

3 结 论

本实验通过Plackett-Burman设计从11种生长强化因子中筛选出番茄汁、胡萝卜汁和玉米浆为影响SY1.1增殖的关键因素。通过响应面法获得适合豆乳链球菌SY1.1增殖的最佳培养基：蔗糖1 g/100 mL、大豆蛋白胨2 g/100 mL、磷酸氢二钾0.2 g/100 mL、番茄汁8.58 mL/100 mL、胡萝卜汁10.90 mL/100 mL、玉米浆0.60 g/100 mL，pH 6.8。豆乳链球菌在此培养基中经37 ℃培养12 h，活菌数达（8.9±0.2）×108 CFU/mL，比优化前（1.03×108 CFU/mL）提高了近7.64 倍，且培养基黏度较小、无沉淀、菌体易分离，为开发直投式酸豆乳发酵剂提供了理论参考。

在后续实验中，还需对SY1.1培养条件及方式进行研究，如采用分批补料培养、细胞循环培养等方式[21-22]进一步提高活菌数，并对其冷冻干燥工艺及保护剂进行研究，以获得高密度菌体，完成酸豆乳直投式发酵剂的制备工艺。

参考文献：

[1] HSIEH M L, CHOU C C. Mutagenicity and antimutagenic effect of soymilk fermented with lactic acid bacteria and Bifidobacteria[J]. International Journal of Food Microbiology, 2006, 111(1): 43-47.

[2] WANG Y C, YU R C, CHOU C C. Antioxidative activities of soymilk fermented with lactic acid bacteria and Bifidobacteria[J]. Food Microbiology, 2006, 23(2): 128-135.

[3] 张佳, 马永昆, 崔凤杰, 等. 乳酸菌发酵酸豆乳香气成分分析及评价[J]. 食品科学, 2010, 31(20): 298-302.

[4] JOSE A M, MONICA A N, GRACIELA S G, et al. Enhancement of the antioxidant capacity of soymilk by fermentation with Lactobacillus rhamnosus[J]. Journal of Functional Foods, 2012, 4(3): 594-601.

[5] LIU J R, LIN C W. Production of kefir from soymilk with or without added glucose, lactose, or sucrose[J]. Journal of Food Science, 2000, 65(4): 716-719.

[6] BEASLEY S, TUORILA H, SARIS P E J. Fermented soymilk with a monoculture of Lactococcus lactis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 80(2): 159-162.

[7] 贾建会, 吕晓莲, 郭宏, 等. 核桃酸豆乳发酵工艺研究[J]. 中国酿造, 2012, 31(4): 186-190.

[8] 王永强, 王海凤, 王洪军. 干酪乳杆菌发酵酸豆乳的工艺研究[J]. 食品研究与开发, 2008, 29(1): 67-70.

[9] WANG Y C, YU R C, YANG H Y, et al. Sugar and acid contents in soymilk fermented with lactic acid bacteria alone or simultaneously with Bifidobacteria[J]. Food Microbiology, 2003, 20(3): 333-338.

[10] 孟岳成, 林海知, 陈洁. 不同增稠剂对凝固型发酵酸豆乳质构的影响[J]. 中国乳品工业, 2010, 38(4): 38-41.

[11] 刘海燕, 李应彪, 徐幸莲, 等. 德式乳杆菌增殖培养基的优化研究[J]. 现代食品科技, 2008, 24(11): 1160-1163.

[12] 徐向宏, 何明珠. 试验设计与Design-Expert、SPSS应用[M]. 北京: 科学出版社, 2010: 194-203.

[13] 刘力, 王洋, 李平兰. 嗜热链球菌的筛选及其高活性菌粉制备[J]. 食品科技, 2012, 37(2): 6-10.

[14] 陈天寿. 微生物培养基的制造与应用[M]. 北京: 中国农业出版社, 1995: 250-299.

[15] 张晓琼. 肉用葡萄球菌优良菌株的筛选及高活性发酵剂的制备[D]. 北京: 中国农业大学, 2012.

[16] 陈卫, 陆英, 田丰伟, 等. 干酪乳杆菌LC-15的增菌培养基设计及生长动力学研究[J]. 食品与发酵工业, 2008, 34(8): 1-6.

[17] 叶雪飞, 阮辉, 冯石开, 等. 发酵乳杆菌增殖培养基营养因子优化研究[J]. 食品科学, 2010, 31(5): 194-196.

[18] 田洪涛, 贾英民, 马雯, 等. 嗜热链球菌促生长物质研究及增殖培养基优化筛选[J]. 食品科学, 2002, 23(5): 60-62.

[19] 邓鹏超. 乳酸菌的高密度培养及酸奶冻干发酵剂的研究[D]. 武汉: 华中农业大学, 2008.

[20] 岳佳, 张青, 薛建岗, 等. 一株瑞士乳杆菌增殖培养基的优化分析[J]. 中国乳品工业, 2011, 39(9): 8-12.

[21] 孙欣, 祝清俊, 王文亮, 等. 直投式酸奶发酵剂制备关键技术[J]. 中国酿造, 2011, 30(10): 17-19.

[22] 李家鹏, 张学刚, 乔晓玲, 等. 响应面法优化植物乳杆菌冷冻干燥保护剂配方的研究[J]. 食品科学, 2008, 29(6): 146-150.