5-氨基乙酰丙酸对苹果幼果多酚含量、苯丙氨酸解氨酶活性及其基因表达的影响

陈 磊,郭玉蓉,刘永峰*,米瑞芳,窦 娇

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西 西安 710062)

 

摘 要:探究5-氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid,ALA)处理对苹果幼果酚类物质、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonia-lyase,PAL)活性及其基因表达量的影响。在苹果疏果期前,利用不同质量浓度ALA处理苹果幼果,采用紫外分光光度法测定ALA处理后12 d内苹果多酚和PAL活性,利用荧光定量法测定苹果幼果PAL基因表达量。结果表明:ALA处理质量浓度在300 mg/L以内,随着质量浓度提高,苹果多酚含量、PAL酶活性及其基因表达量均升高,到400 mg/L时各项指标均表现出下降趋势;相同质量浓度ALA处理苹果幼果后,幼果的上述3 项指标均随时间延长而明显提高,在第9天时达到最高值,12 d后开始下降。为提高苹果疏果多酚含量,实现疏果的最大利用率,生产中需要选择适宜的ALA处理浓度和时间采集幼果。

关键词:苹果幼果;多酚;苯丙氨酸解氨酶;基因表达

 

Effect of 5-Aminolevulinic Acid on Polyphenol Content, PAL Activity and PAL Gene Expression in Young Apple Fruits

 

CHEN Lei, GUO Yu-rong, LIU Yong-feng*, MI Rui-fang, DOU Jiao

(College of Food Engineering and Nutritional Sciences, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

 

Abstract: The purpose of this study was to find out the effect of 5-aminolevulinic acid (ALA) application on phenolic substances and phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity and PAL gene expression in young apple fruits. Apple fruits were treated with various concentrations of ALA before thinning, and then over a subsequent period of 12 days, total phenolic contents and PAL activity were measured by UV spectrophotometry and the expression of PAL gene by fluorescent quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The experiment results indicated that as the ALA concentration increased up to 300 mg/L, the PAL activity, total phenolic content and PAL gene expression levels all showed an increasing trend, while the opposite pattern was observed for these three parameters when the ALA concentration was further raised to 400 mg/L. At identical ALA concentrations, all these parameters became significantly higher with prolonged treatment time, reaching the maximum levels on the 9th day, and began to fall on the 12th day. Thus, it can be concluded that treatment of young apple fruits with ALA at concentrations around 300 mg/L may result in a variety of desired physiological changes, such as markedly increasing phenolic substances and improving the activity level and gene expression of PAL.

Key words: young apple fruits; polyphenols; phenylalanine ammonia lyase; gene expression

中图分类号: S131.1 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)11-0135-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201411027

多酚类物质是苹果果实重要功能成分之一,具有抑菌、抗过敏、抗衰老、清除自由基、抗氧化等多种功能[1]。据报道苹果幼果多酚含量是成熟果的10 倍,含量高达110~357 mg/100 g新鲜幼果[2]。而苹果疏果工作是解决座果过量、克服大小年、提高果品质量、实现持续均衡丰产的必要技术措施。在中国每年有约160t的苹果疏果腐烂在果园里,造成资源的大量浪费[3]。因此,从苹果幼果中提取苹果多酚对于充分利用苹果疏果资源具有重要意义。

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)不仅是生物体内合成卟啉化合物的第一个关键前体[4],还参与植物生长发育的调节过程。低质量浓度ALA(<500 mg/L)能通过刺激苯丙烷代谢系统而提高植物多酚含量[5-6],也可以增强植物抗逆性[7]。苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine ammonia-1yase,PAL)普遍存在于高等植物中,是苯丙烷类代谢的关键酶[8]。相关报道指出PAL活性不仅与植物多酚含量成正比[9],还与植物果实着色[10]、褐变[11-12]及抗逆性[13-14]等密切相关。因此,本实验拟通过ALA处理苹果疏果期前期的幼果,研究苹果幼果多酚含量的变化与PAL活性的关系,从影响苹果PAL基因表达层面探究苹果幼果多酚的变化规律,从而提高苹果疏果中多酚的利用率。

1 材料与方法

1.1 材料

选择陕西省咸阳市礼泉县苹果综合实验站的10年生“长富2号”苹果树,在苹果疏果期前20 d(2013年4月15 日),挑选5 株10 年生、树势接近的果树作为实验树。分别用质量浓度为100、200、300、400 mg/L的ALA喷洒幼果,喷洒处理后3、6、9、12 d采摘幼果,每株实验树(其中1株为对照)每次取幼果20 个,6 个新鲜幼果用来测定多酚,6 个新鲜幼果用来测定PAL酶活性,剩余8 个幼果经液氮速冻后置于-80 ℃保存备用。

1.2 试剂与仪器

StepOne RT-PCR仪 美国ABI公司;RT-PCR试
剂盒 南京金斯瑞生物技术有限公司;反转录cDNA试剂盒和荧光染料SYBR 日本TaKaRa公司;其他试剂为国产分析纯或化学纯;PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

UNICO PC2102型紫外-可见光分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司;TGL-16G高速低温离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 幼果总多酚含量的测定

参照任文霞等[15]的方法。蒸馏水洗净6 个新鲜幼果,滤纸吸干表面水分,粉碎后取1.0 g幼果果肉,加入20 mL 70%乙醇,55 ℃超声辅助提取4次,定容至100 mL。取1.0 mL提取液加入12 mL饱和NaCO3和1.0 mL福林酚,定容至25 mL。避光反应1 h后,检测OD765 nm值,多酚含量直接用OD765 nm表示。

1.4 PAL酶活力的测定

参照林植芳等[16]的方法。蒸馏水洗净6个新鲜幼果,用滤纸吸干表面水分,粉碎后取0.5 g幼果果肉,加入5 mL 0.05 mol/L pH 8.8的硼酸缓冲液(含0.005 mol/L
β-巯基乙醇),然后加入0.1 g 聚乙烯吡咯烷酮和少许石英砂,冰浴下研磨成匀浆,4 ℃、12 000 r/min离心20 min,上清液为酶液,用来测定酶活力。

酶活力测定反应体系:0.02 mol/L L-苯丙氨酸(用0.1 mol/L、pH 8.8的硼酸缓冲液配制)1.0 mL,0.05 mol/L
硼酸缓冲液2.0 mL,1.0 mL酶液,30 ℃水浴30 min,测定OD290 nm值。每克鲜质量每分钟所引起吸光度变化 0.00l为1个酶活力单位(U/(min•g))[17]。

1.5 提取苹果果实总RNA及其反转录

取冻存的苹果幼果,采用改良的CTAB-LiCl法[18]提取苹果幼果总RNA,用微量紫外分光光度计对RNA的浓度及纯度进行检测。利用TaKaRa公司提供的cDNA试剂盒将不同浓度处理及不同时间点的苹果幼果总RNA反转录成单链cDNA,并将质量浓度统一稀释至50 ng/mL。

1.6 基因表达分析

苹果PAL基因引物参照Harb等[19]的引物序列,以苹果管家基因β-actin为内参,引物序列如表1所示,委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。荧光定量PCR以SYBR为荧光染料,采用20 µL体系,包括:10.0 µL SYBR® Premix Ex TaqTM (2×)反应液、0.4 µL RcxDag(2×)、上下游引物各0.8 µL、cDNA模版2 µL、加ddH2O补至20 µL。混匀、离心,放入PCR仪扩增。反应程序为:95 ℃变性30 s;95 ℃、5 s,60 ℃、34 s,40 个循环。反应中设置空白对照,使用双蒸水为模版,每个样品重复3 次。反应结束后记录Ct值,采用2-△△Ct法[20]进行数据分析。

表 1 荧光定量引物序列

Table 1 Sequences of primers targeting PLA and b-actin used for quantitative RT-PCR

基因名称

引物序列5’→3’

苯丙氨酸解氨酶(PAL)

F:TGCACTGTGCCAAGCTATTGA

R:TCAACAACCCTGAGGAGGTCT

苹果内参(β-actin

F:ATCGTGGTCATTGGCCATGT

R:AGCCTGTGAGGTTCCAGTAATCAT

 

2 结果与分析

2.1 幼果总多酚含量的变化

658730.jpg 

同质量浓度下小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同。

图 1 不同质量浓度ALA对苹果幼果总酚含量的影响

Fig.1 Impact of different concentrations of ALA on total phenol content in young apple fruit

由图1可知,300 mg/L以内总酚含量随ALA质量浓度升高而升高,400 mg/L时总酚含量开始有所下降,300 mg/L为最佳处理质量浓度。在不同处理时间条件下,苹果幼果总酚含量随着时间延长而升高,处理后12 d达到最佳。

在不同处理质量浓度不同处理时间条件下,相同处理时间内不同质量浓度ALA处理幼果后,前9 d苹果幼果总酚含量表现出增长趋势;第12天时,除300 mg/L外,其余组多酚质量浓度均开始下降;前9 d同一质量浓度不同处理时间总酚的含量也表现出显著性差异,第12天时除300 mg/L外,其余组则无显著性差异,尤其是在300 mg/L时,多酚含量增长速率最快(第6天时最高比对照高出33.33%),其含量在12 d时达到最高,比对照组高14.29%。ALA处理幼果后,苹果幼果总酚含量总体上表现出增长趋势,并在ALA质量浓度为300 mg/L处理第9天时表现出最佳,这与汪良驹等[21]的研究结果相同。

2.2 PAL酶活力测定

表 2 不同质量浓度ALA对苹果幼果PAL活性的影响

Table 2 Impact of different concentrations of ALA on PAL activity in young apple fruit

U/(ming)

ALA质量浓度/(mg/L)

处理时间/d

3

6

9

12

0

9.36±0.0503a

10.82±0.0557a

16.11±0.0551a

13.18±0.0458a

100

10.32±0.0351b

11.07±0.0603b

16.63±0.0557b

14.30±0.0404b

200

9.19±0.0551c

10.87±0.0458c

18.03±0.0651c

13.89±0.0451c

300

11.06±0.0755d

14.52±0.0702d

21.31±0.0802d

15.31±0.0651d

400

9.87±0.0603e

11.47±0.0551e

17.66±0.0503e

14.88±0.0404e

 

注:小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同。

 

由表2可知,在不同ALA质量浓度条件下,PAL活性变化不显著,但在300 mg/L时PAL活性表现出最大。幼果处理后,随着处理时间的变化,PAL活性有显著性变化,其中第9天酶活力最高,12d时活力开始降低。从时间上来看,处理后9 d以前PAL活性在任意质量浓度下均表现出升高趋势,并在第9天各质量浓度的酶活力均达到最大,处理后第12天时酶活力均开始显著下降;从ALA不同质量浓度上来说:300 mg/L以下酶活力均表现出上升趋势,到300 mg/L时酶活力均达到最大,400 mg/L时酶活力开始降低。ALA处理后PAL活性总体上表现出上升的趋势,并在300 mg/L 时表现出最大增长趋势且最高(第9天)和最低(第3天)相比增幅达到92.68%,这与Xie li等[22]的研究结果相同。

2.3 PAL基因荧光定量检测

用荧光定量方法研究了苹果幼果体内PAL基因在不同处理时间、ALA不同质量浓度条件下表达量的变化。

由图2可知,ALA质量浓度在300 mg/L以前,PAL基因表达变化不大;质量浓度为300 mg/L时PAL基因表现出最大表达量;400 mg/L时PAL基因表达量开始有所下降,但总体上表现为上调趋势。在不同处理时间条件下,PAL基因表达量在处理后3~6 d期间表达量变化显著,6~9 d变化不大,第9天时表达量最高,12 d时表达量开始降低。在不同处理质量浓度不同处理时间条件下,不同质量浓度处理9 d以前,PAL基因相对表达量均有所上升;而在第12 天时,表达量又相对下降。300 mg/L
和400 mg/L处理时PAL基因表达量波动较大,特别是300 mg/L处理后第9天与第12天相比,该基因上调表达是对照的2.64倍。因此,ALA处理苹果幼果的最佳质量浓度为300 mg/L,最佳采集幼果时间为喷洒后9 d。

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图 2 各处理PAL基因表达变化量

Fig.2 Impact of different concentrations of ALA on PAL gene expression in young apple fruit

3 结论与讨论

不同质量浓度ALA处理幼果后,苹果幼果体内多酚含量、PAL活性及其基因表达量均变化显著,且呈现出类似的规律,即质量浓度从100~300 mg/L期间各项指标均明显递增,400 mg/L时开始出现下降趋势。苹果幼果多酚总体上表现出明显的上升趋势,并在300 mg/L处理组第9天达到最大。不同质量浓度ALA对幼果的各项指标作用表现出先增后减的现象,这一现象可再次证明ALA在低质量浓度下能够促进植物代谢,高质量浓度会抑制植物代谢[23]。同一质量浓度不同时间内ALA处理幼果后,幼果体内多酚、PAL活性及其基因表达量在3~9d内递增;第12天时PAL酶活力及其基因表达量与第9天相比时均表现出大幅度下降,而多酚含量变化不大,这是由于幼果体内多酚积累,但其递增速率明显下降。上述现象可能是因为ALA被完全吸收或损耗,不能持续刺激苯丙烷代谢系统。这一现象说明ALA的最佳效果期为处理后6~9 d。因此建议在现实生产中,尽量在疏果期前6~9d,选用300 mg/L的ALA处理幼果,才能达到疏果中多酚的最大含量。

另外,随着ALA处理质量浓度的增加,幼果多酚的变化规律、PAL酶活性变化规律和PAL基因表达变化规律三者相吻合这一现象,也与前人的研究规律相同[3-4,19],并再次验证了“基因控制酶的合成,酶控制产物的合成”这一生物学规律。ALA刺激了苹果体内苯丙烷代谢途径,增加关键酶PAL的基因表达量,进而提高PAL酶活性,调控酚类物质的代谢,促进多酚物质的生物合成[24]。

ALA的处理质量浓度在300 mg/L以内,随着质量浓度提高,PAL酶活性与多酚含量、相对基因表达量均升高,到400 mg/L时各项指标均表现出下降趋势;ALA处理后3 项指标明显提高,并在处理后第9天达到最高值,12 d开始下降。在现实生产中,为提高苹果幼果中多酚的提取率,尽量在疏果期前6~9 d,选用300 mg/L的ALA处理幼果,才能达到疏果中多酚的最大含量,实现利用苹果疏果提取多酚的最佳效果。

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收稿日期:2013-07-11

基金项目:国家现代农业(苹果)产业技术体系建设专项(CARS-28苹果产业体系)

作者简介:陈磊(1988—),男,硕士研究生,研究方向为食品生物技术与食品贮藏。E-mail:chen122148@163.com

*通信作者:刘永峰(1981—),男,副教授,博士,研究方向为食品生物技术及营养学。E-mail:yongfen200@126.com