重组酶FLP在弱氧化葡糖杆菌中的表达及应用

刘静文，李天明，杜红燕，冯惠勇*

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050000）

摘 要：本实验借助宽宿主载体pBBR1MCS-5，构建在弱氧化葡糖杆菌（Gluconobacter suboxydans）中表达FLP重组酶的表达载体，转化弱氧化葡糖杆菌，获得阳性转化子；采用两步法RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）验证，结果表明：flp基因在宿主细胞中转录表达；将pBBR1MCS-psldh-flp重组质粒转化至带有四环抗性的突变菌株JGDH－，PCR验证表明带有FTR位点的抗性标记得到有效删除。重组酶FLP在Gluconobacter suboxydans的表达提供了一种循环使用选择标记基因进行多个位点基因敲除或置换的方法。

关键词：弱氧化葡糖杆菌；FLP/FRT；位点特异性重组；启动子；基因敲除

Expression and Application of Recombinase FLP in Gluconobacter suboxydans

LIU Jing-wen, LI Tian-ming, DU Hong-yan, FENG Hui-yong*

(College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050000, China)

Abstract: In this paper, the broad-host vector pBB1MCS-5 was used to construct an expression vector for flippase recombination enzyme (FLP). The expression vector was transformed into Gluconobacter suboxydans, and the positive transformants were screened. The results of validation using a two-step RT-PCR method showed that flp was transcribed and expressed in the host cell. The pBBR1MCS-psldh-flp recombinant plasmid was transformed into tetracyclic-resistant JGDH－ mutant strains, and PCR verification showed that the sites with FTR resistance marker had been effectively removed. Recombination FLP expression in Gluconobacter suboxydans provides a method that circularly uses the selectable marker gene to knock out or replace multiple locus genes.

Key words: Gluconobacter suboxydans; FLP/FRT; site-specific recombination; promoter; gene knock-out

中图分类号：Q789 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）11-0204-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201411041

重组酶近年来成为非常普及的现代分子生物学理论研究与基因工程技术开发的重要工具，最常用的重组酶包括细菌来源的Cre和酵母来源的FLP[1]。FLP重组酶（flippase recombination enzyme）又称转位蛋白，其基因来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2μ质粒，编码422个氨基酸，是一个大小约48kD的多肽单体蛋白。该蛋白作用于34bp的FRT位点（flippaserecognition targets）[2]，根据FRT识别位点的位置与方向，FLP重组酶以特定方式结合到FRT两端的对称序列上，诱使FRT位点产生弯曲、断裂，从而引发完成FRT位点间基因的删除、倒置、交换等修饰，实现DNA序列的删除、倒位、插入和重排等反应，因此被广泛应用于微生物、植物及动物的基因组的修饰[2-9]。弱氧化葡糖杆菌（Gluconobacter suboxydans）具有丰富的周知空间氧化还原酶类，如葡萄糖脱氢酶[10]、山梨醇脱氢酶[11]，甘油脱氢酶[12]等，可催化葡萄糖、山梨醇、甘油等生成葡萄糖酸、山梨糖和二氢丙酮等化工产品，是一类重要的工业菌[13-16]，对其进行菌种改造，获得可产业化显示的遗传资源具有重要意义。但是由于其遗传背景知识相对缺乏、有多样的内源性质粒和广泛的抗性谱等因素，给遗传实验操作带来很大的难度。在Gluconobacter suboxydans遗传操作体系以及对其基因组DNA进行修饰改造的技术手段等方面的研究，国内外还基本处于空白。本实验借助宽宿主载体pBBR1MCS-5，先获得插入终止子的重组质粒pBBR1MCS-5-ter，在此基础上，再构建不同来源启动子调控的flp的表达载体。

通过重组酶FLP在Gluconobacter suboxydans中的转录表达，同时引发FRT-FLP位点特异性重组，可以有效地去除葡萄糖脱氢酶缺失突变菌株的四环素抗性标记，提供了一种循环使用选择标记基因进行多个位点基因敲除或置换的方法[9,17-21]，为快速、高效、方便、稳定地进行基因的修饰改造提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Trizol 美国Invitrogen公司；焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC） 生工生物工程（上海）股份有限公司；EasyScript反转录试剂盒、FastPfu DNA聚合酶、Hifi DNA聚合酶 北京全式金生物技术有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇等常规试剂均为国产分析纯。

培养基：2 g/100 mL葡萄糖、1.0 g/100 mL玉米浆、0.1 g/100 mL KH2PO4、0.4 g/100 mL硫酸铵、0.02 g/100 mL硫酸镁、0.01 g/100 mL碳酸钙，pH值调制6.4～6.7，121 ℃灭菌20 min；如需固体培养基，加入2.0%的琼脂，121 ℃灭菌20 min。

实验所用菌株，质粒以及相关引物的详细信息如表1所示。

1.2 仪器与设备

Bio-Rad My CyclerTM 梯度PCR仪、Bio-Rad Gel DOCXR System凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；Gene Pulser XcellTM电转仪 美国Bio-Rad公司；Neofuge23R冷冻离心机 河南兄弟仪器设备有限公司；DYY-6C电泳仪 北京市六一厂；HWS型培养箱 宁波江南仪器厂；DZKW-D水浴锅 河北黄骅航天仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 重组质粒pBBR1MCS-5-ter宽宿主载体的构建

以G. suboxydans基因组DNA为模板，利用PCR扩增出具有终止子作用的ter基因片段，PCR反应程序为：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，退火（Tm值不同）30s，72 ℃、25 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min。将目的基因ter和载体pBBR1MCS-5进行Hind Ⅲ和SalⅠ双酶切，电泳验证后回收，T4连接酶反应过夜，热激转化至大肠杆菌DH5α中，挑取单菌落，将转化子经菌液PCR验证正确后保菌备用，并由Invitrogen公司测序。

1.3.2 flp基因片段与3种启动子融合的overlapping PCR

以pEASY-flp、pEASY-sldh、pBBR1MCS-5为模板，tufB利用长引物融合，均用PCR分别扩增出flp、psldh、ptufB和庆大（pgen）基因片段，得到的片段作为下一次PCR的反应模板，PCR反应程序参考1.3.1节。再利用重叠延伸PCR技术，选用正确引物，调整两个模版的物质的量比，分别将sldh、tufB、gen基因启动子片段分别作为模版1，flp基因作为模版2，二者进行搭接，克隆出带有3种启动子的flp基因片段，PCR反应程序参考1.3.1节。

1.3.3 flp基因重组表达质粒的构建

将目的基因和测序正确的载体pBBR1MCS-5-ter进行BamHⅠ和Pst Ⅰ双酶切，37 ℃反应过夜，酶切产物经电泳验证正确后使用超薄产物纯化试剂盒回收后，将酶切后的融合了启动子的flp基因分别与载体用T4连接酶16 ℃过夜连接，后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中，挑取单菌落，将转化子经菌液PCR验证正确后保菌备用，并由Invitrogen公司测序。

1.3.4 弱氧化葡糖杆菌的转化及转化子验证

将构建成功并测序正确的载体pBBR1MCS-psldh-flp、
pBBR1MCS-ptufB-flp、pBBR1MCS-pgen-flp利用电穿孔转化法分别转入到受体细胞弱氧化醋酸杆菌中，具体方法：将10 μL打靶片段和50 μL感受态细胞轻轻混合，冰浴5 min，转入事先冷却的电击杯；设置不同的电压分别为1.25、1.5、1.8 kV/cm，固定电阻为250 Ω，电容为25 μF，电击；电击完后立刻向电击杯中加入1 mL事先冷却的种子培养基，冲洗转移至离心管中，30 ℃、200 r/min振荡培养5 h，收集细胞，涂于平板中。优化转化条件，待48～72 h后出现转化子，按照菌落PCR的方法进行验证。

1.3.5 RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）验证目的基因的转录表达

将3种载体转入弱氧化葡糖杆菌的转化子扩培24～48 h后，采取Trizol试剂一步法提取总RNA，具体操作参照Trizol试剂说明书。

利用北京全式金公司的EasyScript反转录试剂盒，两步法进行PCR扩增。首先合成cDNA，按照说明书体系，轻轻混匀试剂，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育30 min，然后85 ℃加热5 min，使EasyScript RT失活。取2～4 μL反转录产生的cDNA作为PCR模版，进行PCR扩增，PCR反应过程参考1.3.1节。

1.3.6 去除JGDH－菌株的抗性基因

JGDH－菌是野生型中编码GDH的基因gdh被两端带有FRT识别位点的四环素表达盒所替代的突变菌株。参见1.3.4节的转化方法，将pBBR1MCS-psldh-flp重组质粒转入受体细胞JGDH－菌中，孵育培养10h，涂布于固体培养基上，待出现菌落后，挑取菌落分别培养在含有四环素及不含四环素的培养基的微孔板中，测定菌液OD600 nm值，根据生长情况筛选除去抗性的菌株。再通过菌落PCR进行验证四环抗性的去除。

2 结果与分析

2.1 终止子ter基因扩增

M. DNA 2k Marker；1～4. ter基因PCR。

图 1 ter基因PCR产物

Fig.1 PCR amplified products of ter gene

实验以G. suboxydans基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得有终止子作用的ter基因片段，如图1所示，目的条带大小与已知序列相同，说明终止基因ter扩增成功。

2.2 重组质粒pBBR1MCS-5-ter的构建

将目的基因ter和载体pBBR1MCS-5进行Hind Ⅲ和Sal Ⅰ
双酶切，电泳验证后回收，经过酶切连接转化，挑选阳性转化子，进行质粒PCR验证，验证结果如图2所示，条带位置与上述PCR扩增片段大小一致，说明目的基因ter已插入载体pBBR1MCS-5中，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，比对测序结果正确，说明构建成功。

M.DNA 2k Marker；1. pBBR1MCS-5质粒PCR；
2. pBBR1MCS-5-ter PCR；3. ter基因PCR。

图 2 质粒PCR验证ter基因的插入

Fig.2 PCR validation of insertion of the ter gene

2.3 重叠延伸PCR融合启动子与flp基因

M1.DNA 2k Marker；1. psldh启动子基因；2. flp基因（FLPSLF引物扩增）；3. pgen启动子基因；4. flp基因（FLPGEF引物扩增）；5～7. flp基因（FLPTUF引物扩增）；M2.DNA 5k Marker。

图 3 3种启动子基因与flp基因PCR产物

Fig.3 PCR amplified products of three promoter genes and flp gene

实验采用重叠延伸PCR技术，选择相应的引物和模版，tufB利用长引物融合，另外分别扩增出flp、psldh、ptufB和pgen基因片段，如图3所示。其中，启动子psldh基因片段大小为191 bp，启动子pgen基因大小为276 bp，不同引物扩增的flp基因大小为1 300 bp左右，与已知序列大小相同。

以上一步PCR扩增的结果为模版，等量混匀后，利用Hifi DNA聚合酶分别用各自引物进行PCR搭接，获得各自的目的片段，如图4所示。

M.DNA 2k Marker；1～3. psldh-flp基因搭接；4～6. pgen-flp基因搭接；7～8. ptufB-flp基因搭接。

图 4 3种启动子与flp基因PCR搭接结果

Fig.4 PCR overlap products from three promoter genes and flp gene

2.4 融合启动子基因psldh、ptufB、pgen的flp基因重组质粒的构建

将搭接成功的3种基因片段利用超薄琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，与空质粒pBBR1MCS-5-ter经过酶切连接转化，挑选阳性转化子，提质粒后分别利用引物SLDHF/FLPR、TUFBF/FLPR、GENF/FLPR验证构建好的载体pBBR1MCS-psldh-flp、pBBR1MCS-ptufB-flp、pBBR1MCS-pgen-flp，验证结果如图5所示，条带位置与设计一致，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，比对测序结果正确，说明构建成功。

M. DNA 15k Marker；1. pBBR1MCS-5-ter质粒PCR；2. pBBR1MCS-ptufB-flp PCR；3～4. pBBR1MCS-pgen-flp PCR；5～6. pBBR1MCS-psldh-flp PCR。

图 5 3种质粒的PCR验证

Fig.5 PCR validation of three plasmids

2.5 flp基因在弱氧化葡糖杆菌中的转录表达及RT-PCR验证

分别将成功构建的质粒pBBR1MCS-psldh-flp、pBBR1MCS-ptufB-flp、pBBR1MCS-pgen-flp利用电转化转入到目的菌株弱氧化葡糖杆菌中，经过48～72h后长出单菌落。菌落PCR验证筛选出阳性转化子。为验证3种启动子控制的flp基因在宿主中的转录表达情况，利用Trizol法提取含有3种弱氧化醋酸杆菌阳性克隆的RNA，利用电泳验证所提RNA的完整性，28S和18S条带清晰可见，进行RT-PCR结果如图6所示，PCR所得片段分别与阳性对照位置相同，并且弱氧化葡糖杆菌本身RNA并没有扩增相应条带，说明sldh、tufB、gen启动子都可被弱氧化葡糖杆菌识别，有效启动flp基因的转录表达。

M. DNA 2k Marker；1.弱氧化葡糖杆菌；2. sldh-flp基因的PCR阳性对照；3. sldh-flp基因；4. tufB-flp基因的PCR阳性对照；
5. tufB-flp基因；6. gen-flp基因的PCR阳性对照；7. gen-flp基因。

图 6 含3种质粒的弱氧化葡糖杆菌RT-PCR验证

Fig.6 RT-PCR validation of Gluconobacter suboxydans with three plasmids

2.6 利用flp在弱氧化葡糖杆菌的表达去除JGDH－菌株的抗性基因

将pBBR1MCS-psldh-flp重组质粒转入受体细胞JGDH－菌中。由于四环素抗性基因两端的FRT位点同向，FLP在JGDH-菌中表达后，将FRT位点间的四环素抗性基因删除，FLP/FRT删除JGDH-菌株的四环抗性基因的作用机理，如图7所示。

图 7 FLP/FRT的作用机理

Fig.7 The action mechanism of FLP/FRT

挑取转化子单菌落扩培，将其分别接入无抗培养基和含四环抗性的培养基中，培养一段时间后，测定菌液OD值，该菌在无四环抗性培养基中生长，在四环抗性培养基中不生长。挑取上述已初步验证的无抗性基因的单菌落，利用引物TETYF/TETYR进行菌落PCR验证，结果如图8所示，只有没有转化pBB1MCS-psldh-flp的JGDH－菌株有1 100 bp左右的条带（四环抗性基因），进一步说明pBB1MCS-psldh-flp转入JGDH－菌株后，FLP有效表达，在FLP/FRT重组系统作用下四环抗性标记被删除。并通过多次在无抗性的培养基上传代，去除pBBR1MCS-psldh-flp质粒，得到稳定的无任何抗性标记的JGDH－菌株。

M.DNA 2k Marker；1.对照JGDH－菌的PCR；2.质粒pBB1MCS-psldh-flp转入JGDH－菌的PCR。

图 8 抗性标记去除的PCR验证

Fig.8 PCR validation of the removal of resistance markers

3 讨 论

宽宿主载体pBBR1MCS-5可在多种宿主中克隆表达，具有其特有的优越性；而目前Gluconobacter suboxydans适用基因操作的工具有限，肖苏珂等[22]发现该质粒在Gluconobacter suboxydans中能够很好地克隆表达。本实验利用该质粒的优点，同时为其插入具有终止作用的ter基因，构建了适用于Gluconobacter suboxydans的表达载体pBBR1MCS-5-ter。

通过重叠延伸PCR技术分别获得含有sldh、tufB、gen基因启动子片段的flp基因，与改造的宽宿主载体pBBR1MCS-5-ter连接、转化获得重组质粒，再电转化至弱氧化葡糖杆菌中。有研究发现[18]，经分离得到多个具有启动子功能的DNA片段上具有典型的细菌启动子保守序列（－35和－10区），被命名为Lhp启动子，该启动子可被Gluconobacter suboxydans识别；本实验受控于sldh、tufB、gen启动子的重组质粒可被Gluconobacter suboxydans识别，并都能有效启动flp基因的转录表达，拓展了Gluconobacter suboxydans遗传操作系统的调控原件。

FLP是来自酿酒酵母2μ质粒编码的特异性重组酶，盖颖[23]、刘香利[24]、单晓昳[9]等已发现FLP重组酶通过FLP/FRT重组系统在原核大肠杆菌及植物中能有效识别并删除重组位点FRT之间的基因。本实验借助构建的Gluconobacter suboxydans的表达载体，通过FLP重组酶在Gluconobacter suboxydans中转录表达，可以将葡萄糖脱氢酶缺失突变菌株的四环素抗性标记去除，这样既能够改善该系统去除选择标记的效率和稳定性，同时能够循环使用选择标记基因进行敲除或置换多个位点基因，为快速、高效、方便、稳定地进行Gluconobacter suboxydans基因的修饰提供了有效工具，同时为Gluconobacter suboxydans基因改造方面的进一步研究提供参考，这方面的研究还未见报道。

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