抗性淀粉对SD大鼠的胃损伤预防效果研究

骞 宇，赵 欣*

（重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆 400067）

摘 要：以抗性淀粉（RS2）为研究对象，构建动物模型，通过酶联免疫法、逆转录-聚合酶链式反应等方法研究其对HCl-乙醇诱导SD大鼠胃损伤的预防效果。结果表明：10% RS2、15% RS2和20% RS2均能降低大鼠的血清IL-6和TNF-α水平，大鼠的胃损伤程度，显著提高胃损伤的抑制率，均能减少胃液分泌量、增加胃液pH值，表现出一定的胃损伤预防效果。其中20% RS2对胃损伤预防效果最佳。

关键词：抗性淀粉；胃损伤；HCl-乙醇诱导；血清IL-6细胞因子；血清TNF-α细胞因子

Preventive Effect of Resistant Starch on Gastric Lesions in Rats

QIAN Yu, ZHAO Xin*

(Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China)

Abstract: Rats were fed on a basal diet supplemented different levels of high-amylose corn starch (Hylon Ⅶ) to explore the effect of resistant starch on hydrochloric acid/ethanol-induced gastric lesions in rats using ELISA and reverse transcription-PCR (RT-PCR). The results showed that 10% RS2, 15% RS2 and 20% RS2 groups could reduce serum IL-6 and TNF-α levels and gastric lesion area, and significantly increase the inhibition rate of gastric lesions when compared with the stomach injury control group. In addition, these three concentrations of RS2 could decrease the secretion of gastric juice, and increase gastric pH. These results suggest that RS2 at the three concentration levels has a significant preventive effect on hydrochloric acid/ethanol-induced gastric lesions in rats and 20% RS2 is the most effective level.

Key words: resistant starch; gastric lesions; hydrochloric acid/ethanol-induced; serum IL-6; serum TNF-α

中图分类号：TS201.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）11-0241-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201411048

根据“欧洲抗性淀粉研究协作网（European Flair Concerted Action on Resistant Starch，EURESTA）”和Englyst[1]的研究结果，联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO）对抗性淀粉做出定义，即“在健康者小肠中不被吸收的淀粉及其降解产物的总称”[2]。目前，根据酶解抗性和淀粉来源等条件将抗性淀粉主要分为4类[3]，即RS1物理包埋淀粉、RS2抗性淀粉颗粒、RS3老化淀粉、RS4化学改性淀粉。在这4类抗性淀粉中，RS2是目前研究的重点，是最主要的抗性淀粉，具有极大的开发潜力和商业价值。含有丰富的抗性淀粉的食品具有控制体质量、降低血糖血脂、预防结、直肠癌等多种功能，吸引了众多学者的研究兴趣，成为近年来国际食品研究的新兴领域[4-6]。目前对抗性淀粉的研究主要集中在测定方法及制备技术的改进、物理化学性质与生理功能的关系、体内外消化水平以及在食品中的应用等多方面，但其对胃损伤方面的影响还缺乏研究数据。

本实验构建胃损伤SD大鼠模型，研究10%、15%和20%这3个添加量的RS2对HCl-乙醇诱导引起的胃损伤的预防、治疗作用，为预防治疗乙醇对胃组织损伤提供实验数据，以期为进一步研究开发富含RS2的保健品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

HylonⅦ（含53% RS2）来源于高直链玉米淀粉 美国国民淀粉公司；预糊化玉米淀粉 浙江欣欣生化科技有限公司。

无水乙醇、盐酸、37%福尔马林、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠 成都市科龙化工试剂厂；细胞因子TNF-α、细胞因子IL-6 Biolegend公司；Trizol总RNA抽提剂 美国Invitrogen公司；脱氧核糖核酸酶 瑞士Roche公司；RNeasy 德国Qiagen公司；逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）引物 德国Eppendorf公司。

DU-70型紫外分光光度计 美国Beckman公司； ServenEasy pH计 瑞士Mettler-Toledo公司；低温离心机 德国Sigma公司；T100 PCR仪 美国Bio-Rad公司；
JS-Power 600电泳仪、JS-680D凝胶成像分析仪 上海培清科技有限公司。

1.2 动物

SPF级SD大鼠，体质量160～180 g，雄性，6 周龄，共30 只，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号为：SYXK（渝）2012-0001。大鼠喂养5d适应基础饲料后，按照体质量将大鼠随机分为5组，分别为：正常组、胃损伤对照组、10% RS2组、15% RS2和20% RS2组，每组6 只，单只饲养在不锈钢笼中，在相对湿度（50±10）%，室温（24±2）℃，12 h明暗轮换
（8：00—20：00照明）条件下饲养。

1.3 方法

1.3.1 动物实验

实验期间，正常组和胃损伤对照组大鼠喂食不含RS的基础饲料，RS组大鼠自由采食含有10% RS2、15% RS2和20% RS2的饲料。实验期间各组大鼠自由摄食和饮水，实验期4周。饲料每3 d配1 次，置4 ℃冰箱保存。

实验最后1 d所有大鼠禁食12 h，保持大鼠自由饮水，然后除正常组外所有大鼠进行口腔灌胃1 mL的150 mmol/L HCl-乙醇（V（HCl）∶V（乙醇）=2∶3）诱导剂，建立胃损伤大鼠模型。1h后处死所有大鼠并解剖。

1.3.2 大鼠饲料配方

以美国AIN-93G标准配制实验的基础饲料[7]，并作为对照组饲料，对照组饲料中的淀粉使用预糊化玉米淀粉。分别用RS2替代基础饲料中相应量的预糊化玉米淀粉，使RS2在整个饲料中所占的比例为10%、15%和20%，饲料其他成分与对照组的饲料相同。各组饲料具体配方见表1。

表 1 实验饲料的组成

Table 1 Ingredients of experimental diets

g/kg

1.3.3 指标测定

1.3.3.1 血清中细胞因子IL-6和TNF-α测定[8]

采用酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定。大鼠用乙醚麻醉后断头处死，从颈部取2 mL血，装在有抗凝剂的采血管中，置于冰上，并在4 ℃、4 000 r/min离心15 min，取上层血清于2 mL离心管中，采用定量酶联检测试剂盒，按说明操作。用紫外分光光度计在450 nm波长处检测血清中细胞因子IL-6和 TNF-α水平。

1.3.3.2 胃损伤程度测定[9]

将大鼠的胃组织取出，用10%福尔马林溶液固定，相机拍照后用软件Image J计算各组大鼠胃组织胃黏膜损伤面积。

1.3.3.3 胃液量和胃液pH值测定

取出大鼠胃组织中的胃液，用量筒测定胃液量，pH计测定pH值。

1.3.3.4 RT-PCR分析胃组织炎症因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平

用TRIzol总RNA抽提剂制备胃组织总RNA。定量分离到RNA后，以Oligo dT为引物，在AMV逆转录酶作用下制备ss cDNA，然后以该cDNA为模板，RT-PCR法扩增一氧化氮合酶（iNOS）、环氧化酶-2（COX-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）基因。持家基因glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（GAPDH）作为内参照物（表2）[10]。

表 2 RT-PCR引物序列

Table 2 Primers of RT-PCR

1.4 实验数据分析

采用IBM SPSS 19.0版本软件，实验数据均表示为

±s，正常组和胃损伤对照组应采用t检验，而胃损伤对照组和其他RS2组采用One-Way ANOVA进行显著性分析，
P＜0.05表示数据具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 RS2对胃损伤大鼠血清细胞因子IL-6和TNF-α水平的影响

小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。

图 1 RS2对HCl-乙醇诱导胃损伤大鼠血清细胞因子IL-6 （A）和TNF-α（B）水平的影响

Fig.1 Effect of RS2 on serum IL-6 (A) and TNF-α (B) levels in rats with HCl-ethanol-induced gastric injury

在实验最后1d大鼠用乙醚麻醉后断头，取血清测定IL-6和TNF-α水平，乙醚作为一种麻醉剂在动物实验中已经被证明具有安全可靠性，对血液中各项指标不会产生影响[11]，适于本实验。已经有研究表明酒精灌胃后在短时间内能对动物血液中指标产生影响，包括IL-6和TNF-α水平[12-13]，胃损伤诱导剂HCl-乙醇对大鼠灌胃后能通过测定血清中IL-6和TNF-α水平来观察炎症程度，由此可确定胃损伤情况。由图1可知，相对于正常组，胃损伤对照组的细胞因子IL-6和TNF-α水平极显著增加
（P＜0.01）；而10% RS2、15% RS2和20% RS2组均能不同程度的降低血清IL-6和TNF-α水平，其中20% RS2组达显著水平（P＜0.05）。

肠道在受到严重创伤或应激状态的情况下，会导致机体免疫力下降，肠道吸收内毒素的能力超过机体自身清除内毒素能力；肠道内大量的内毒素进入血液；释放出TNF-α、IL-1、血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、IL-6等一系列毒性介质，而这些毒性介质会使组织细胞供氧受到破坏，使肠黏膜的循环受到影响，最后引起胃组织损伤[14-15]。IL-6和TNF-α炎症细胞因子水平降低表示炎症程度降低[16]。在临床上常用测定IL-6和TNF-α这两种常见的炎性细胞因子水平来判定胃炎的程度[10,17]。本实验发现3种添加量的RS2组均能不同程度的降低血清IL-6和TNF-α水平，降低胃损伤程度，其中20% RS2组的效果最显著。

2.2 RS2对胃损伤大鼠胃损伤水平的影响

A

B

C

D

E

A.正常组；B.胃损伤对照组；C.10% RS2组；D.15% RS2组；E. 20% RS2组。

图 2 RS2对HCl-乙醇诱导胃黏膜损伤大鼠的胃外观观察

Fig.2 Effect of RS2 treatment on stomach appearance of rats with HCl-ethanol-induced gastric injury

由图2可知，相对于正常组，胃损伤对照组大鼠的胃部黏膜可见明显的条状出血和糜烂，而10% RS2、15% RS2和20% RS2组大鼠胃部黏膜的条状出血和糜烂面积均明显小于胃损伤对照组，其中20% RS2组大鼠胃部黏膜损伤最小。

表 3 RS2治疗HCl-乙醇诱导胃损伤大鼠的胃损伤程度

Table 3 Gastric injury levels of HCl-ethanol-induced gastric injury in rats with RS2 treatment

注：同列字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

由表3可知，胃损伤对照组大鼠的胃损伤程度明显高于各RS2组，达显著水平（P＜0.05）。各RS2组大鼠的胃损伤程度均显著低于胃损伤对照组（P＜0.05），而抑制率显著高于胃损伤对照组大鼠（P＜0.05），其中20% RS2组效果达极显著水平（P＜0.01）。可能是由于在HCl-乙醇诱导SD大鼠胃损伤前，已经喂食不同含量的RS2才使得各RS2组大鼠的胃损伤程度相对于胃损伤对照组均有一定程度下降。由此可知，RS2对胃损伤具有一定的预防作用，其中20% RS2组效果最显著。

2.3 RS2对胃损伤大鼠的胃液量和胃液pH值的影响

胃损伤出现时，胃液分泌量会增加，同时胃液正常pH值也会降低[18]。由图3A可知，相对于正常组，胃损伤对照组的胃液分泌量极显著增加（P＜0.01）。10% RS2、
15% RS2和20% RS2组大鼠的胃液分泌量均低于胃损伤对照组，其中20% RS2组达显著水平（P＜0.05）。由图3B可知，相对于正常组，胃损伤对照组的胃液pH值极显著降低（P＜0.01）。10% RS2、15% RS2和20% RS2组均均能增加胃液pH值，其中20% RS2组达显著水平
（P＜0.05），由此可知RS2对胃损伤具有一定的预防作用，其中20% RS2对胃损伤的预防作用最强。

图 3 RS2对HCl-乙醇诱导大鼠的胃液量（A）和胃液pH值（B）的影响

Fig.3 Effect of RS2 treatment on gastric secretion volume (A) and gastric juice pH (B) in HCl/ethanol-induced gastric injury model rats

2.4 RS2对胃损伤大鼠的胃组织炎症因子iNOS、COX-2、
TNF-α和IL-1β mRNA表达的影响

图 4 RS2对HCl-乙醇诱导大鼠胃组织的iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β mRNA表达的影响

Fig.4 Effect of RS2 treatment on mRNA expression levels of iNOS, COX-2, TNF-α and IL-1β in the stomach tissues of HCl-ethanol-induced gastric injury model rats

急性酒精灌胃后能对大鼠的胃黏膜造成明显的损伤，损伤会在短时间内产生炎症的反应，由此动物组织中的炎症表达产生变化，是胃损伤效应的标志之一[19]，HCl-乙醇诱导剂能增强影响作用[20]。由图4可知，在化学试剂诱导SD大鼠胃损伤前，喂食10% RS2、15% RS2和20% RS2组大鼠的胃组织的炎症因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的mRNA表达均明显低于胃损伤对照组大鼠，其中20% RS2组大鼠胃组织的炎症因子iNOS、COX-2、
TNF-α和IL-1β的mRNA表达最接近正常组大鼠，对胃损伤具有最好的预防效果。

一氧化氮合酶（iNOS）是钙离子和钙调蛋白非依赖性酶，仅在炎症时表达。有研究发现溃疡性结肠炎患者炎症部位肠黏膜细胞出现iNOS表达，而非炎症部位肠黏膜无iNOS表达[21]。当细胞受到炎症等刺激时COX-2可大量表达，与机体的发热、疼痛、损伤及肿瘤等关系密切，是炎症介导的细胞毒性重要的决定因素之一[22]。TNF-α、IL-1β是促炎细胞因子，IL-1β含量和活性的增加快，而且持续炎症的整个过程，TNF-α偏重组织的损伤[23]。有研究表明，在胃损伤动物实验中，随着胃损伤程度的增加，iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β表达均明显增强[24]。本研究也得到相似的结论，在所有5组大鼠中，胃损伤对照组大鼠的iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β炎症表达最强，10% RS2、15% RS2和20% RS2组大鼠的炎症表达均弱于胃损伤对照组，其中20% RS2组降低效果最明显，说明RS2在化学剂诱导大鼠胃损伤的发生、发展过程中能降低TNF-α、IL-1β表达强度，对减轻胃损伤起重要作用。

3 结 论

从大鼠的血清细胞因子水平、胃损伤程度、胃液分泌量、胃液pH值和胃组织炎症因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的mRNA表达一系列指标得出结论，10% RS2、15% RS2和20% RS2组均对化学诱导的SD大鼠的胃损伤具有一定的预防、改善效果，其中20% RS2效果最明显。

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