总状蕨藻多糖体外抗肿瘤作用

邵海艳，吉宏武*

（广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，

广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088）

摘 要：以总状蕨藻为原料，采用热水与蛋白酶酶解相结合浸提得到总状蕨藻多糖提取液，经Sevag法和透析法等步骤纯化后得到总状蕨藻粗多糖（Caulerpa racemosa polysaccharide，CRP）。紫外扫描结果表明CRP中含有少量蛋白质。红外光谱分析CRP有一般糖类物质的特征吸收峰，含硫酸基团，是一种酸性多糖。采用噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）法研究了CRP对HeLa、K562、CNE-2z细胞的抑制作用，结果表明CRP对3 种肿瘤细胞都有一定的抑制作用，在24～72 h内，随着时间的延长，抑制率逐渐增强，在0.0625～4 mg/mL质量浓度范围内，随着质量浓度的增加，抑制率逐渐增强，对HeLa、K562和CNE-2z细胞的抑制率最大分别达到61.7%、85.9%和90.3%。

关键词：总状蕨藻；多糖；体外抗肿瘤

Antitumor Activity in vitro of a Polysaccharide from Caulerpa racemosa

SHAO Hai-yan, JI Hong-wu*

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety, Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution, College of Food Science and Technology,
Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

Abstract: A crude polysaccharide fraction from Caulerpa racemosa (CRP) was obtained through hot water extraction coupled with enzymatic proteolysis, deproteinization by Sevag method and dialysis. Ultraviolet spectroscopy showed CRP to contain a little amount of protein. Infrared spectroscopy revealed that CRP had characteristic polysaccharide absorption peaks and was an acidic polysaccharide containing sulfate groups. The polysaccharide exhibited an antitumor activity against HeLa, K562 and CNE-2z cells, with maximum inhibitory rates of 61.7%, 85.9% and 90.3%, respectively, as determined by MTT assay. This antitumor effect was positively dependent on both exposure time in the range of 24 to 72 h and concentration in the range of 0.062 5 to 4 mg/mL.

Key words: Caulerpa racemosa; polysaccharide; antitumor activity in vitro

中图分类号：R73-36 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）11-0251-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201411050

总状蕨藻（Caulerpa racemosa）是绿藻门，蕨藻属的一种大型可食用绿藻，主要分布于热带与亚热带地区海域中，长可达1 m以上，直立枝条，具有两列以上的小枝，小枝末端膨胀，形成棍棒状或园球状，具有明显的柄部。在我国的海南、广东、广西、东沙、西沙群岛、台湾等地广泛分布，《新华本草纲要》记载其有行气止痛、镇惊安神之功效。中国台湾省兰屿居民常采取总状蕨藻食用。目前国内外对总状蕨藻多糖（Caulerpa racemosa polysaccharide，CRP）的研究相对较少，Chattopadhyay等[1]为研究其多糖结构和抗病毒之间的关系，对其多糖进行了纯化并对其结构进行了初步分析；Wang Hui等[2]报道从总状蕨藻中提取的硫酸甘油糖脂（sulfoquinovosyl diacylglycerol，SQDG）对HSV2有良好的抑制活性；Ghosh等[3]从总状蕨藻中提取得到的硫酸多糖HWE，硫酸基含量为9%，主要由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖组成，在胞外具有抗疱疹活性；马夏军等[4]对其中的脂肪酸、甾醇进行了分析。本课题组前期对总状蕨藻的基本营养成分[5]、其硫酸多糖提取工艺[6]、分离纯化[7]、抗肿瘤与免疫活性[8]及其水溶性成分的抗氧化活性进行了初步的研究[9]，结果表明总状蕨藻中含有丰富的硫酸多糖，对小鼠体内S180和H22均有较好的抑制作用，能直接或协同有丝分裂原ConA促进小鼠脾淋巴细胞增殖，还能够有效地促进小鼠腹腔巨噬细胞MФ吞噬中性红和分泌NO的数量。

本实验在以前工作基础上通过光谱分析对CRP的结构进行初步分析，并对其体外抗肿瘤活性进行进一步研究，以期为CRP的开发利用奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

总状蕨藻（Caulerpa racemosa） 湛江徐闻县琼州海峡。

K562细胞（人白血病细胞株）、HeLa细胞（宫颈癌细胞株）、CNE-2Z细胞（人低分化鼻咽癌细胞株） 广东医学院药理实验室惠赠。

胎牛血清 杭州四季青公司；DMEM和 RPMI 1640 美国Gibco公司；噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS） 美国Sigma公司；中性蛋白酶 丹麦诺维信公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

CO2培养箱 美国Shellab公司；倒置显微镜 日本Olympus公司；DG-5031型酶联免疫检测仪 国营华东电子管厂；超净工作台 北京昌平长城净化公司；
UV-2102PC型紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；96 孔细胞培养板 美国Gibco公司。

1.3 方法

1.3.1 CRP的制备[6]

称取一定量的总状蕨藻粉末按固液比l∶10（m/V）添加蒸馏水，并按136.5 U/g加入中性蛋白酶，60 ℃提取2.5 h后，再将固液比调至1∶20，将温度升至95 ℃，再继续提取2.5 h，冷却后，提取液用纱布过滤。提取液经粗滤后上清液在80 ℃条件下真空浓缩至1/4体积，浓缩液离心，取上清液。多糖提取液经Sevag试剂去蛋白质后通过10 000 D透析袋透析，加入3 倍体积的95%乙醇，离心收集沉淀，所得沉淀冷冻干燥，即得CRP，其得率为6.7%。

1.3.2 CRP的理化性质检测

1.3.2.1 定性实验

溶解实验：取少量CRP分别加入水、95%乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等溶剂，观察CRP在这些溶剂中的溶解情况；Molish反应[10]；Fehling试剂反应[10]；硫酸基定性实验[11]；双缩脲反应[10]。

1.3.2.2 定量实验

总糖含量测定[12]：采用苯酚-硫酸比色法；硫酸基含量测定[11]：采用硫酸钡比浊法；蛋白质含量测定[10]：采用考马斯亮蓝法；糖醛酸含量测定[10]：采用硫酸-咔唑法。

1.3.3 紫外扫描光谱分析

称取一定量CRP配制成一定质量浓度的多糖溶液，在波长200～400 nm区间扫描，观察其在该波长范围内的吸收情况。

1.3.4 红外光谱分析

取适量CRP经KBr压片，4000～400 cm－1红外波数范围内扫描。

1.3.5 CRP的体外抗肿瘤活性

1.3.5.1 细胞培养

在37℃、体积分数为5%的CO2孵箱中对HeLa、K562和CNE-2Z肿瘤细胞在含10 g/100 mL灭活胎牛血清、1×105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的培养液（HeLa在DMEM培养液中，K562和CNE-2Z分别用RPMI 1640 培养）中常规培养，隔天传代，调整细胞生长状态，取对数生长期、生长良好的细胞，再调整细胞密度为1×106 个/mL进行实验。

1.3.5.2 多糖溶液的配制

称取CRP 24 mg，加入6 mL细胞培养液溶解配成4 mg/mL的多糖溶液，过滤除菌，然后用培养液分别稀释成不同质量浓度梯度的多糖溶液。

1.3.5.3 CRP体外对肿瘤细胞的抑制作用

采用MTT比色法，收集对数期生长的K562、HeLa和CNE-2Z细胞接种于96 孔培养板，每孔90 µL细胞悬液（含1.0×104 个细胞）培养24 h，加入不同质量浓度的CRP溶液10 µL，对照组（0 mg/mL CRP溶液）加入同等体积相应的细胞培养液，每组设3 个平行孔，充分混匀后，继续培养24、48 h和72 h。每孔加入MTT 20 µL（5 g/L磷酸盐缓冲溶液），再培养5 h，每孔加入1 g/100 mL SDS-5%异丁醇-0.012 mol/L HCl的三联液100 µL，37 ℃放置过夜后，用酶标仪测定各孔OD570 nm值，调零孔则用细胞培养液代替细胞悬液和药液。按下式计算抑制率，从而计算半数抑制浓度IC50。

1.4 统计学方法

实验数据用

±s表示。并用组间t检验分析差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 CRP的性状

CRP呈浅褐色粉末状，有一定黏度，溶于热水，不溶于95%的乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。CRP的Molish反应为阳性，Fehling试剂反应为阴性，经2 mol/L硫酸加热水解后，水解液Fehling试剂反应为阳性，表明产品为非还原性多糖，经酸水解后，有还原性糖类存在。硫酸基定性实验为阳性，说明产品中有硫酸基团存在。双缩脲反应为阳性，说明产品中有蛋白质存在。

2.2 CRP紫外扫描光谱分析

图 1 CRP紫外扫描图谱

Fig.1 UV Spectrum of CRP

由图1可知，CRP溶液在波长200 nm左右具有典型的多糖吸收峰，并且在280 nm波长处有少许蛋白质吸收峰。

2.3 CRP红外光谱分析

图 2 CRP红外扫描图谱

Fig.2 Infrared spectrum of CRP

由图2可知，3 400 cm-1处的吸收峰是—OH的伸缩振动吸收峰，表明多糖存在分子间或分子内氢键；在3 000～2 800 cm-1区域内的吸收峰是糖类的特征峰，CRP在2 923 cm-1处的吸收峰是C—H的伸缩振动引起的；1 651 cm-1处的峰是多糖中乙酰氨基
（—NHCOCH3）的C＝O伸缩振动，证明蛋白质官能团的存在；1 380 cm-1处吸收峰是羧基（C—O）伸缩振动引起的，表明CRP是一种酸性多糖；1 258 cm-1处是硫酸基（—O—SO2－）中S＝O的伸缩振动引起的吸收峰，表明CRP是一种硫酸多糖。

2.4 CRP基本组成

表 1 CRP基本组成含量测定结果

Table 1 Chemical composition of CRP

由表1可知，CRP尽管经过反复除蛋白，但还含有一定量蛋白质，此蛋白可能与多糖通过糖肽链以聚合物形式存在；CRP中含有的硫酸基含量高达27.6%，暗示其可能具有较高的生物活性。

2.5 CRP对肿瘤细胞生长的抑制作用

2.5.1 对HeLa细胞生长的抑制作用

表 2 CRP对HeLa细胞生长的抑制作用

Table 2 Inhibitory effect of CRP on the growth HeLa cells

注：*.与对照（0 mg/mL CRP）OD570 nm值相比，差异显著（P＜0.05）；**.与对照OD570 nm值相比，差异极显著（P＜0.01）；***.与对照OD570 nm值相比，差异高度显著（P＜0.001）。下同。

由表2可知，CRP对HeLa细胞的生长有一定抑制作用，在24～72 h内，随着时间的延长，抑制率逐渐增强，在0.0625～4 mg/mL质量浓度范围内，随着质量浓度的增加，抑制率逐渐增强。CRP对HeLa细胞作用24、48 h和72 h的IC50值分别为2.94、2.59 mg/mL和1.26mg/mL。

2.5.2 对K562细胞生长的抑制作用

表 3 CRP对K562细胞生长的抑制作用

Table 3 Inhibitory effect of CRP on the growth K562 cells

由表3可知，CRP对K562细胞的生长有一定的抑制作用。不同质量浓度的CRP对K562细胞作用24 h时，在0.0625～2 mg/mL质量浓度范围内，CRP对K562细胞的抑制作用不显著，但达到4 mg/mL时，抑制效果显著增强；CRP对K562细胞生长的抑制作用随着时间的延长，抑制率也逐渐增强，4 mg/mL CRP作用72 h时，抑制率达到85.9%。CRP对K562细胞作用24、48 h和72 h的IC50分别为2.64、1.26 mg/mL和0.21 mg/mL。

2.5.3 对CNE-2z细胞生长的抑制作用

表 4 CRP对CNE-2z细胞生长的抑制作用

Table 4 Inhibitory effect of CRP on the growth CNE-2z cells

由表4可知，CRP对CNE-2z细胞的生长有一定的抑制作用。不同质量浓度的CRP对CNE-2z细胞作用24 h时，在0.0625～2 mg/mL质量浓度范围内，CRP对CNE-2z细胞的抑制作用不显著，但达到4 mg/mL时，抑制效果显著增强；CRP对CNE-2z细胞生长的抑制作用随着时间的延长，抑制率也逐渐增强，4 mg/mL CRP作用72 h时，抑制率达到90.3%。CRP对CNE-2z细胞作用24、48 h和72 h的IC50分别为1.55、0.75 mg/mL和0.49 mg/mL。

3 讨 论

通过比较CRP对3 种肿瘤细胞的IC50发现，分别作用24 h和48 h时，HeLa细胞的IC50最大，其次是K562细胞，CNE2z细胞的IC50最小。然而作用72 h后，K562细胞的IC50最小，HeLa细胞的IC50依然最大。可见，HeLa细胞对CRP最不敏感。近些年来国内外有关海洋生物多糖抗肿瘤机制表现在以下几个方面[13]：1）海洋多糖抑制细胞周期及相关蛋白质合成，进而抑制肿瘤细胞增殖[13-15]；2）海洋多糖通过抗细胞氧化、清除自由基作用抑制肿瘤细胞增殖[16]；3）海洋多糖通过抗突变、抗遗传损伤作用抑制肿瘤细胞增殖[17]；4）海洋多糖通过促进肿瘤细胞凋亡作用抑制肿瘤细胞生长[18-19]；5）海洋多糖对肿瘤细胞的直接杀伤作用[20]。此外，还有部分海洋多糖通过较为特别的作用机制发挥其抗肿瘤活性，如鲨鱼软骨素可以抑制肿瘤细胞周围血管的生长，进而达到抗肿瘤的作用[21]。微藻中的半乳聚糖硫酸酯可以通过抑制拓扑异构酶l和2的双重作用阻碍肿瘤细胞的生长等[22]。至于总状蕨藻粗多糖CRP是通过何种机制抑制肿瘤细胞的生长还需下一步研究进一步探讨。

4 结 论

CRP对3 种肿瘤细胞都有一定的抑制作用，在24～72 h内，随着时间的延长，抑制率逐渐增强，在0.0625～4 mg/mL质量浓度范围内，随着质量浓度的增加，抑制率逐渐增强，对HeLa、K562和CNE-2z细胞的抑制率最大分别达到61.7%、85.9%和90.3%。

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