QuEChERS在食品中真菌毒素检测的研究进展

陈建彪1,董丽娜1,刘 娇2,路 磊3,赵明明3,丁 华3,王小红2,4,胡定金3,周有祥3,*

(1.通标标准技术服务(上海)有限公司,上海 200233;2.华中农业大学食品科学技术学院,湖北 武汉 430070;

3.湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,湖北 武汉 430064;

4.环境食品学教育部重点实验室,湖北 武汉 430070)

 

摘 要:真菌毒素是重要的食品安全危害因子,建立高通量真菌毒素分析方法将有效降低人群的真菌毒素暴露风险,而实现复杂基质中多种真菌毒素的联合提取是建立这类分析技术的前提保证。QuEChERS是集快速(quick)、简单(easy)、便宜(cheap)、有效(effective)、可靠(rugged)、安全(safe)于一体前处理技术的简称,本文通过介绍QuEChERS技术的原理和近年来该技术在真菌毒素分析领域的应用,针对真菌毒素的理化性质和样品基质特点,探讨了QuEChERS技术中不同提取液和净化剂的优缺点和适用范围,分析该技术在提取净化过程中存在的问题,提出了改进思路,并展望今后QuEChERS技术在多真菌毒素联合分析的发展趋势。

关键词:QuEChERS;真菌毒素;食品;农产品

 

Advances in Application of QuEChERS for Mycotoxin Analysis in Foods

 

CHEN Jian-biao1, DONG Li-na1, LIU Jiao2, LU Lei3, ZHAO Ming-ming3, DING Hua3, WANG Xiao-hong2,4,

HU Ding-jin3, ZHOU You-xiang3,*

(1. SGS-CSTC Standards Technical Services (Shanghai) Co. Ltd., Shanghai 200233, China; 2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 3. Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China;

4. Key Laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, Wuhan 430070, China)

 

Abstract: Mycotoxins are a group of important risk factors of food safety. Simultaneous extraction of mycotoxins from complex sample matrices is a prerequisite to establish a high-throughput analytical method which in turn will provide useful test data for reducing the human health risks posed by mycotoxin exposure. QuEChERS, an acronym for Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe, is a commonly used sample preparation technique. In this paper, the principle of QuEChERS technique and its applications in mycotoxin analysis are reviewed. The advantages and disadvantages of different extraction solvents and sorbents in QuEChERS are discussed on the basis of the matrix effects and the chemical and physical characteristics of mycotoxins. Finally, some improvements and future trends in the application of QuEChERS technique for mycotoxin analysis are proposed.

Key words: QuEChERS; mycotoxins; food; agricultural products

中图分类号:O652.6 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)11-0286-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201411057

真菌毒素主要是一类由产毒丝状真菌(通常称作产毒真菌)产生的有毒次生代谢产物。目前,已发现了300~400种真菌毒素,主要来源于镰刀菌属(Fusarium),曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)的200多种产毒丝状真菌[1-2]。在适宜条件下,产毒丝状真菌极易在产前和产后侵染农作物,造成真菌毒素残留,威胁人畜健康。为了最大限度减小人群的真菌毒素暴露风险,世界各国均建立了一系列真菌毒素限量和检测标准,加强食品和饲料中真菌毒素残留的监控力度。

早期真菌毒素的分析方法主要是针对是单一毒素检测,如:薄层层析(thin layer chromatography,TLC)[3],但这类方法通常是半定量方法,不具备高通量分析能力,难以满足当前食品分析的要求。而以酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)为代表的免疫分析方法,其检测效率高,但这类方法存在干扰因素多,重现性较差等问题[4-5],因此多用于样品快速检测或初筛。随着现代仪器分析技术的发展及推广,真菌毒素高通量分析的仪器检测方法在真菌毒素分析中的应用报道也越来越多,以气相色谱-串联质谱法(gas chromatography tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)[6]、液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[7]、毛细管电泳色谱法(capillary electrophoresis,CE)[8]和超高效液相-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UHPLC-MS/MS)[9]等为代表的现代仪器方法,由于重现性好,检出限低,常作为真菌毒素的定量或仲裁方法。综合上述真菌毒素仪器分析方法的特点,我们发现,现代仪器分析技术正朝着广谱分析、自动分析、痕量分析、快速分析以及绿色分析的趋势发展[10-11]。

由于仪器分析方法灵敏度高,痕量干扰物质会严重影响最终分析结果。因此有效的提取净化方法是实现现代分析的前提保证。目前应用于真菌毒素分析的提取净化方法包括:固相萃取(solid-phase extraction)[12]、固相微萃取(solid-phase microextraction)[13]、超临界流体萃取(supercritical fluid extraction)[14]、免疫亲和萃取(immunoaffinity extraction)[15]、快速溶剂萃取(accelerated solvent extraction)[16]和基质固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion)[17]等,但上述方法多用于单一或者同类毒素的提取净化,在多真菌毒素毒素分析方面报道较少。近年来,QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)技术作为一项新兴的高效提取净化技术,广泛应用于农药残留的分析检测中,其高效、简便和绿色的技术理念正逐渐在兽药残留[18]、食品添加剂[19]、生物毒素[20]以及环境污染物[21-22]等分析检测领域得到应用。本文根据QuEChERS技术的特点,结合样品基质特征和真菌毒素的理化性质,对QuEChERS技术在真菌毒素分析中的应用做简要综述。

1 QuEChERS技术简介

QuEChERS技术是由Anastassiades等[23]研究人员在基质固相分散萃取技术的基础上,整合了提取、固相萃取等步骤,建立的集快速(quick)、简单(easy)、便宜(cheap)、有效(effective)、可靠(rugged)、安全(safe)为一体的样品提取净化技术,即QuEChERS技术。一般而言,QuEChERS技术分为提取、盐析和净化3个步骤(图1)。即先以有机溶剂(如:乙腈、丙酮和乙酸乙酯等)与水按照一定比例混合后萃取待测物,再经过盐析剂(如:无水MgSO4、Na2SO4和NaCl等)盐析分层,最后取目标提取液至装有净化剂(如:乙二胺-N-丙基硅烷、佛罗里硅土、石墨化炭黑和C18键合硅胶等)的聚四氟乙烯离心管中净化,经振摇离心后,取上清液进行仪器分析[10]。

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☆. 目标分析物;▲和●. 样品共萃取物;∴. MgSO4和NaCl混合盐。

图 1 常见QuEChERS法的操作步骤

Fig.1 Schematic procedure of the most commonly used QuEChERS

QuEChERS技术最初是作为高含水量样品(>75%,如水果和蔬菜等)中多农药残留的提取净化方法[23]。随后在低含水量(<25%,如谷物)和油脂类样品(如:肉、蛋和植物油等)的多农药残留分析中也得到了应用[24-25]。随着人们对QuEChERS技术中提取液、盐析剂以及净化剂等相关内容研究的深入,适用于其他食品安全危害因子(如:食品添加剂、兽药、真菌毒素以及多环芳烃等)的相关方法也不断被开发和报道[18-19,22]。

2 QuEChERS方法在农产品中真菌毒素检测的应用

大多数农产品营养成分丰富,在适宜条件下,极易受到产毒真菌的侵染,这使得相关消费群体(人和畜禽等)具有较高的真菌毒素暴露风险。特别需要指出的是,传统的真菌毒素提取净化方法,通常需要经过多次溶剂提取净化,不仅存在较高的真菌毒素暴露风险,还需要使用大量的高毒试剂,这使得大多数操作人员对于分析真菌毒素具有较强的戒备心理。较之传统的真菌毒素提取净化方法,QuEChERS技术的整个分析体系具有以下显著优势:1)实验设备简单。整个QuEChERS处理仅需要离心管、振荡器、离心机即可完成。2)试剂使用量少。在全部提取净化步骤中,有机试剂使用量大约在5~25mL之间,废弃液在15mL以内,对环境污染小。3)前处理步骤少。整个提取净化操作是在重复振荡—离心—再振荡中完成,操作技术难度低,适宜推广。4)处理时间短。全部提取净化步骤可在30min内完成,适合批量分析。5)实现多组分提取净化。通过设计提取液配方,选择适宜盐析剂和净化剂,可实现多真菌毒素的联合提取,提高分析效率。6)操作人员暴露风险低。QuEChERS技术的操作过程简单,处理时间短,溶剂使用量少,可控性强。

基于上述优点,根据真菌毒素和样品基质的理化特性,开发真菌毒素,尤其是多真菌毒素的QuEChERS技术正逐渐成为真菌毒素研究领域的热点。

目前,QuEChERS技术已应用于真菌毒素分析,现已报道的毒素主要包括:15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol,15-AcDON)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol,NIV)、T-2毒素(T-2 toxin,T-2)、HT-2毒素(HT-2 toxin)、黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2(aflatoxin B1、B2、G1、G2,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)、赭曲霉毒素A (ochratoxin A,OTA)、橘霉素(citrinin,CIT)、伏马菌素(fumonisin,FUN)、麦角克碱(ergocristine,ERG)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、棒曲霉毒素(patulin,PAT)以及环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)等,具体见表1。

2.1 样品基质和目标毒素

目前QuEChERS技术在真菌毒素检测分析中的应用,主要是针对极易在生长、贮藏过程中发生真菌污染的高淀粉、高蛋白的样品,如:玉米、小麦及其制品等。由于这些样品基质中的淀粉和蛋白质等组分在提取和净化过程中极易发生交联形成网络结构,使毒素难以从样品中游离出来[11],因此通常在分析这类样品前,添加一定量的去离子水,充分浸润样品,以提高有机溶剂对非水溶性基质的渗透性和提取效率[40]。

真菌毒素是产毒真菌的次生代谢产物,其种类多,结构差异较大,即使是同类毒素,也有较多的衍生物。如何建立有效的QuEChERS分析技术是目前急需解决的问题之一。现有报道表明,不管是提取同类别还是不同类别的真菌毒素,只要极性相似,QuEChERS技术都有较高的提取效率,例如:DON、T-2等A、B类单端孢霉烯族毒素,来源于同一种属的产毒真菌,且都属于极性毒素,针对其结构相近,极性相似的特点,Sospedra等[26]以QuEChERS技术提取净化了面粉中的单端孢霉烯族毒素,而FUN也属于极性毒素,Zachariasova等[30]根据其极性与单端孢霉烯族毒素极性相近,采用QuEChERS技术实现了单端孢霉烯族毒素和伏马菌素的联合分析。

2.2 提取液

从本质上说,QuEChERS技术是在液液分配(有机试剂与水)的基础上采用了基质固相分散技术实现了样品的高效提取和净化。作为QuEChERS技术重要的组成部分,提取液的提取效率决定着最终分析结果的准确性。在传统真菌毒素的检测方法中,乙腈、丙酮、乙酸乙酯与三氯甲烷等通常具有较好的提取效率,但综合各种试剂的理化性质和在QuEChERS中的提取效果,乙腈以其提取率高,适用范围广的特点,应用最多。这是因为乙腈为极性较强的低毒溶剂(极性5.8),具有优良的溶解性,根据“相似相溶”的原理,对大多数非极性和部分极性真菌毒素有较高的提取率,特别是在盐析作用下,极易从水相中萃取极性较弱的毒素。丙酮极性(极性5.1)与乙腈相似,对AFB1和OTA提取效果较好,但该溶剂的盐析效果较差,而且难以去除水溶性杂质干扰,一般不作为QuEChERS技术中的主要提取试剂。乙酸乙酯(极性4.4)极性低于乙腈和丙酮,水溶性差,提取单一强极性毒素(如:OTA和CIT)效果较好,可作为联合提取多种真菌毒素的辅助试剂使用[10,26-27]。

虽然单一乙腈作为提取液对多真菌毒素的联合提取效果较好,但对pH值、极性范围敏感的真菌毒素提取时,需在提取液中添加辅助试剂(乙酸、甲酸和甲醇等)以增强联合提取的效果[26,28-29,34-39]。例如:在分析橘霉素时,由于CIT属于两性化合物,使用单一乙腈的效果并不理想,但调节提取液pH值至CIT的等电点后,可有效降低CIT的水溶性,回收率可从30%增至70%以上;相似的,FUN也属于酸性毒素,在提取液中添加一定量的酸后,在玉米样品中的回收率可达80%[29]。

2.3 盐析剂

样品经过提取后,提取液中仍然存在大量的共萃物,通过盐析步骤,可以初步去除部分水溶性杂质。当提取液中添加了盐析剂后,提取液中的有机相分子(如:乙腈)会由于离子强度的增加,断开与水分子间的氢键,从水中盐析出来。在QuEChERS技术中,常用盐析剂包括:MgSO4、MgCl、NaNO3、NaSO4、NaCl和LiCl等。其中MgSO4和NaCl的盐析效果最好[23]。MgSO4有强结合水的能力(20℃的水溶解度为337g/L),不但显著减少混合提取液中的水含量,而且能饱和水溶液促使混合液分层。但添加过量MgSO4易形成结块使提取液与样品颗粒接触不充分,而且会释放过多的热量引起过高的温度,影响检测结果的准确度。NaCl可以与MgSO4协同饱和水溶液,加速提取液分层。通过控制NaCl的添加量可以调节乙腈层中水含量,进而控制提取液中分析物和杂质在两相中的分配。合理的MgSO4和NaCl使用量,不但有效促使提取液分层,而且可以控制共萃取物与分析物的分离。因此分析真菌毒素时,多数研究人员模拟果蔬中农残分析的QuEChERS技术,采用4g MgSO4和1g NaCl的混合盐促使提取液分层并获得了理想的分层效果[28-33,37]。

2.4 净化剂

当样品提取液经盐析分层后,少量的蛋白质、油脂、色素以及糖组分会不可避免地与真菌毒素共同萃取出来,严重干扰残留的分析结果。在经典的QuEChERS技术中,通常选用乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine,PSA)、石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)、C8、C18(或ODS)、氰丙基键合硅胶(cyanopropyl,—CN)、胺丙基键合硅胶(aminopropyl,—NH2)等净化剂。这些净化剂可通过极性相互作用,或者非极性相互作用使目标物和杂质相互分离。

PSA的结构上有两个氨基,可与分子结构上含有羟基的极性物质发生氢键相互作用,吸附共萃取物中的极性有机酸、极性色素等杂质,在净化非极性类真菌毒素(如:AFT)中的杂质效果较好。Trebstein等以PSA为净化剂分析玉米和小麦中的AFT、DON和T2等多种真菌毒素,有效去除了样品中的酸性杂质和极性色素[33],但Desmarchelier等[29]认为PSA上的氨基容易与酸性毒素(FUN、CIT和OTA等)上的羧基发生反应,一般不适用于净化这类毒素。

GCB具有阴离子交换作用的吸附剂,通过疏水相互作用和氢键相互作用吸附杂质,对具有平面分子结构的杂质(如:甾醇和叶绿素等)吸附作用显著,而且对具有平面分子结构或不完全平面分子结构的真菌毒素也有较强的吸附作用,在分析饲料中的AFT、ZEN和雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol)时,GCB几乎可以吸附全部具有平面结构的毒素[41]。

基于含有C18或者C8烷基链的净化剂是目前广泛使用的反相吸附材料,可通过非极性相互作用吸附非极性物质,可以有效去除净化样品中的淀粉、糖类和脂肪类物质。Cunha等[31]在分析谷物中的ZEN、FUN、NIV、DON和15-AcDON时,发现C18与MgSO4混合对提取液有显著的净化作用。

另外,含有—CN和—NH2等活性基团的净化剂可通过氢键作用吸附极性物质(脂肪酸和有机酸等),在农药残留和兽药残留分析上有着广泛应用[42]。虽然相关报道较少,但在我们的实验中发现—NH2吸附材料强烈吸附饲料中的极性色素,净化非极性毒素(如:AFT)的效果显著。

样品在经过QuEChERS技术处理后,最终的样品液仍会存在一定量的共萃物干扰物,这些干扰物仍然会影响待测物的检测信号,特别是在使用紫外或者荧光等光学检测器时,干扰更为严重。因此大多报道通常是采用具有高选择性的质谱检测器,特别是串联质谱检测器来进行分析,以提高分析灵敏度和准确度。

综上所述,QuEChERS技术在真菌毒素分析领域,特别是多真菌毒素分析检测中体现出的优势,使得该技术备受关注。通过对QuEChERS技术中的提取液、盐析剂和净化剂的系统研究,将是建立适宜不同样品基质的更有效的QuEChERS技术的有力保证。

3 QuEChERS法应用于真菌毒素分析领域的展望

样品前处理是分析检测中“去芜存菁”的关键步骤,直接关系到分析结果的准确性和可靠性。真菌毒素作为一个重要的食品安全危害因子,如何科学、准确、客观评价农产品中毒素残留水平,是当前真菌毒素分析检测领域中的急需解决的问题。QuEChERS方法以提取净化效率高、环境污染小、操作简单快速以及操作风险低等优点,满足了真菌毒素检测分析的需求,但现有QuEChERS方法在以下几点仍存在进一步改进的空间,以满足真菌毒素,特别是多真菌毒素检测的发展趋势。

3.1 QuEChERS提取液和盐析剂的选择

通过设计不同提取液配方来提高提取液从样品基质中提取目标物的提取能力;通过设计不同提取液配方或者提取方法来实现不同极性毒素的联合提取;通过选择不同盐析剂来降低杂质在目标提取液中的分配比例,减少共萃取杂质。

3.2 净化剂材料的选择

通过设计、选择不同净化剂来实现降低样品基质杂质干扰,尤其找到适用于高脂肪、高蛋白和高淀粉的样品基质的净化剂;研究吸附剂的理化性质,通过添加辅助试剂,降低吸附剂对目标毒素的吸附,实现不同极性毒素的联合净化。

3.3 扩展QuEChERS技术的适用性

改进QuEChERS技术,使样品经QuEChERS技术提取净化后,适合紫外、荧光检测器的分析方法;利用QuEChERS技术的先进理念,开发适用于其他真菌毒素分析技术,特别是快速分析技术,如适合ELISA的QuEChERS技术。

总之,QuEChERS技术是一个具有先进理念的前处理技术。建立提取范围更广,提取效率更高,操作更简单,更环保的QuEChERS技术将是后续相关研究的重点。

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收稿日期:2013-05-18

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31271876);中央高校基本科研业务费专项资金项目(2013PY103);

湖北省公益性专项基金项目(2013BBB12);湖北省农业科学院青年科学基金项目(2011NKYJJ22);

湖北省农业科技创新中心基金项目(2012-620-001-03)

作者简介:陈建彪(1983—),男,硕士,主要从事食品分析研究。E-mail:chenbiao416@126.com

*通信作者:周有祥(1979—),男,副研究员,博士,主要从事农产品风险评估研究。E-mail:zhouyouxiang@gmail.com

表 1 QuEChERS方法在真菌毒素检测中的应用

Table 1 Application of QuEChERS in the analysis of mycotoxins

样品

分析物

m(称样量)∶V(提取液)

 

提取液(V/V

净化剂

检测方法

回收率/%

检出限/(μg/kg)

发表年份

面粉

DON、T-2、NIV等5种A、

B类单端孢霉烯族毒素

5∶10

甲醇-乙腈(85∶15)

无净化

LC-MS

86~108

1~30(DON/3、 T-2/1、NIV/30)

2010[26]

无花果

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和OTA

0.25∶2

四氢呋喃或丙酮

无净化

HPTLC

75~96

1.5~56(AFB1/1.5、OTA/56)

2009[27]

玉米饲料

PAT、CIT、OTA、CPA、FUN、T-2、OTA、ZEN等27种毒素

10∶10

乙酸-乙腈(1∶99)

无净化

LC-MS/MS

60~115

1~739(DON/739、ZEN/9、OTA/10、PAT/371)

2010[28]

玉米、小麦、大米

OTA、FUN、ZEN、T-2、DON、

NIV等17种毒素

5∶10

乙酸-乙腈(1∶199)

无净化

LC-MS/MS

70~120

0.5~100(DON/250、OTA/2.5、ZEN/100、FUN/250)

2010[29]

玉米、大麦、小麦

FUN、ZEN、NIV、T-2、DON等

11种镰刀菌毒素

4∶10

甲酸-乙腈(1∶999)

无净化

UHPLC-MS/MS

94~108

5~50(FUN/10、ZEN/5、NIV/50、T-2/5、DON/25)

2010[30]

玉米、饲料、猪肉、鸡蛋、牛奶和蜂蜜

AFB1、OTA、FUN、ERG

2.5∶10

乙腈-水(84∶16)

无净化

LC-MS/MS

<50 (AFB1/94, OTA/77)

真菌毒素<50

2008[20]

早餐谷物食品、面粉

ZEN、FUN、NIV、DON和15-AcDON

5∶10

乙腈

C18

GC-MS/MS

75~103

2~15(ZEN/2、 NIV/15)

2010[31]

玉米、小麦、谷子

AFB1、AFB2、FUN、DON、T-2、OTA、DON等11种毒素

2∶10

乙腈

PSA

UHPLC -MS

100~108

50~150(ZEN/100、DON/80、FUN/150)

2010[32]

玉米面、面粉、谷物类早餐

ZEN、FUN、T-2、HT-2、DON

5∶20

乙腈

PSA

LC-MS/MS

>80(ZEN除外)

0.4~19.2(ZEN/0.4、FUN/7)

2010[33]

蛋品

AFT、CIT、OTA等10种毒素

2∶10

甲醇-水(80∶20)、1%冰醋酸

无净化

UHPLC-MS/MS

65~114

1.0~5.0

2011[34]

牛奶

AFT等6种毒素

1∶1

乙腈-水(1%乙酸)

UHPLC-QqQ-MS/MS

60~120

0.01~0.20

2011[35]

谷物及其加工食品、酒

AFT、HT-2、T-2、OTA

5∶15

乙腈-水(67∶33)、1%冰醋酸

HPLC-MS/MS

74~105

3.0~5.0

2011[36]

小麦粉

ZEN、HT-2、T-2、DON、PAT等10种毒素

5∶25

乙腈-水(3∶10)

C18

GC-QqQ-MS/MS

74~124

1.25~10

2012[37]

谷物

AFT、HT-2、T-2、OTA、DON、ZEN等

16种毒素

5∶20

甲醇-水(75∶25)、

1%冰醋酸

UHPLC -MS/MS

70~120

0.2~29.7

2013[38]

谷物、坚果、饼干等

AFT、DON、FUS、HT-2、ZEN、

OTA等23种毒素

2∶20

乙腈-水(50∶50)、

0.1%甲酸

HPLC-MS/MS

67~102

AFB1/0.05、DON/45、ZEN/3、OTA/0.15、0.05~60

2013 [39]

 

注:PSA.乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine);DON/3. 斜线后的数据表示分析物具体的检出限,其他同此解释。