乳酸菌胞外多糖肠道黏附及免疫
调节作用研究进展

李 超，王春凤，杨桂连*

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林省动物微生态制剂工程研究中心，吉林 长春 130118）

摘 要：乳酸菌作为公认的食品级益生菌，在医学、食品科学及人类健康中发挥重要作用。乳酸菌的胞外多糖作为其主要的细胞外分泌物与其相应生物学功能的发挥密切相关。本文旨在从乳酸菌胞外多糖的理化特性和分子结构方面入手探究其调节免疫的机制，并总结乳酸菌胞外多糖在调节胃肠道功能和进入体内后的免疫调节等方面的特性。以期为乳酸菌胞外多糖的研究和应用奠定理论基础。

关键词：乳酸菌；胞外多糖；黏附；免疫调节

Progress in Intestinal Adhension and Immunoregulatory Effect of Extracellular Polysaccharides of Lactic Acid Bacteria

LI Chao, WANG Chun-feng, YANG Gui-lian*

(Jilin Provincial Engineering Research Center of Animal Probiotics, College of Animal Science and Technology,

Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Abstract: Lactic acid bacteria are acknowledged as one kind of food-grade probiotics, and play an important role in medical science, food science and many other fields of life science. Extracellular polysaccharide as the extracellular secretion of lactic acid bacteria is closely related to its biological characteristics. This article reviews the immune regulation mechanism, physical and chemical properties, and molecular structure of extracellular polysaccharides from lactic acid bacteria, and summarizes their gastrointestinal and immune regulatory effects. We expect that this study will provide the theoretical basis for researching and applying exopolysaccharides from lactic acid bacteria.

Key words: lactic acid bacteria; extracellular polysaccharide; adhesion; immunoregulation

中图分类号：Q939.117 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）11-0314-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201411061

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是能发酵葡萄糖产生大量乳酸的一类细菌的总称，其广泛分布于人体、动物、植物和整个自然界，已发现的在分类学上至少有23 个属，在食品和医药等领域中应用较多的有7 个属[1]。乳酸菌菌群中革兰氏阳性的一些菌株被认为是有益菌属，也是人体肠道中的常在菌群，被认为是与人类健康有关的功能性菌群。因此对乳酸菌的研究、应用与开发成为当前研究的热点。目前乳酸菌主要通过在肠道定殖在改善肠道微环境、抗肿瘤、抗炎症和调节免疫等方面发挥关键作用，其中乳酸菌的次生代谢产物胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）在刺激黏膜免疫和调节机体免疫过程中具有重要作用。

乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外渗透在培养基上的糖类化合物[2]。胞外多糖不仅在体内可作为能量转化的来源以及在生物被膜结构中起到重要作用，而且作为天然的大分子活性物质，多糖在调节机体免疫过程中也具有很好的免疫原性。更加值得注意的是乳酸菌胞外多糖来源具有可追溯性，同时不会产生显著的毒副作用，是理想的免疫佐剂。因此，本文将就乳酸菌EPS的相关生物学特性进行论述，并初步探讨其免疫调节功能及其相关作用机制。

1 乳酸菌胞外多糖的分类和结构

乳酸菌EPS的分类方法有很多：根据与细胞表面黏附的紧密程度分为与细胞表面松散相连的EPS和完全释放到外界环境的EPS；根据调控合成相关酶的基因数量上的差异分为同型多糖与异型多糖[3-5]。本文主要根据EPS中所含单糖种类不同将其分为同多糖（homopolysaccharide，HoPS）和杂多糖（heteropolysaccharide，HePS）。

1.1 同多糖

同多糖是只包含一种类型单糖的多糖物质，在空间构型上分为α和β两种类型：葡聚糖主要是形成α和β链接；果聚糖主要是形成β链。例如：瑞特乳酸菌属、清酒乳杆菌属等可以产生α-葡聚糖[6]；片球菌属、酒球菌属以及乳杆菌属等产生β-葡聚糖[7]。一般来说，HoPS分子质量介于4.0×104 u和6.0×106 u之间，主要是由高凝集度的聚合物生成。HoPSs的生成量可以达到几克每升，而HePSs生成量为50～200 mg/L。乳酸菌分泌的HoPS由葡萄糖或果糖作为唯一的单糖，据此可分为葡聚糖和果聚糖。这两个亚属包含有多个具有特异性的链接类型、分子质量、主链长度和化学构象的多糖。人们一般用分子质量描述这些单糖：葡聚糖（2.8×107 u），果聚糖（2×106 u）或菊粉型果聚糖（1.0×107 u）。同一种乳酸菌可以生成不同的EPS，已经发现在相同的培养条件下乳酸菌可合成多种HoPSs，且经大量研究表明这种乳酸菌菌株具有分泌益生素β-（2,1）果聚糖（菊粉样多糖）的能力。不同菌株生成的EPS链接方式也存在差异，乳酸菌生成EPS的连接方式是β-（2,6）或β-（2,1）。然而植物乳酸杆菌(Lactobacillu johnsonii)NCC 533生成的菊粉型果聚糖是线性的[8]。这种菊粉型果聚糖是可溶性葡聚糖，包含有70%的α-（1,4）链接和较少的α-（1,6）链接，已经发现其在烘焙工业中得到广泛应用，并参与L. reuteri果聚糖的合成。在合成过程中，葡聚糖、果聚糖是在胞外合成的，其特异性底物不进入细胞，而是在胞外酶的作用下不依赖糖基核苷酸和C55等物质直接将底物中的糖基聚合成胞外多糖。其中合成体系包括：糖基供体、糖基受体和葡聚糖蔗糖酶[9]。这些生物聚合物生成量较大，例如，乳酸菌株（Lb. reuteri）能够生成在10 g/L左右由
D-葡萄糖或D-果糖组成的两种类型的同多糖。

1.2 杂多糖

杂多糖是由几种不同类型的单糖组成的多糖物质。其分子质量从1×104 u到6×106 u[10-11]。乳酸菌EPS的主链由7 个单糖组成重复单位，其中葡萄糖、半乳糖、鼠李糖是主要的糖类，也存在N-乙酰-D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-半乳糖胺等氨基糖以及多元醇（甘油）。根据HePS的重复单位中的取代基将其分为不带电荷、带电荷和中性聚合物。特别提到的是在中性粒子中，含有阳性（如游离氨基）和阴性（如磷酸盐和羧化物）电荷数量相等的重复单位，称为“两性离子”EPS。虽然在细菌中存在很少，但这些分子可以调节包括先天性免疫和适应性免疫反应在内的免疫反应。

杂多糖的合成体系包括供体糖、核苷酸、酰基供体脂中间体酶系统及糖基受体5个因子[12]。由于连接类型（α和β），连接中碳的位置，不同的侧链等的存在构成了不同的结构[5]。HePS重复单元复杂的化学成分和结构组成影响与它们合成相关的蛋白质基因编码的组成，编码HePS生物合成的基因根据HePS的复杂程度位于12～25kb的特异性基因簇中[13]。一般地，乳酸菌胞外多糖基因簇拥有一个大部分基因朝向一个方向的操纵子结构，并且拥有高编码密度和高度保守的结构功能组织，与其聚合、分泌和调节相关基因的区域在与糖基转移酶基因相似的中央区域的侧面。

2 乳酸菌胞外多糖在肠道黏附中的作用

乳酸菌对宿主肠道的黏附可以缓解肠道蠕动对其产生的排除作用，从而定殖于肠道内发挥益生作用[14]。具有黏附作用的成分主要包括脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）、表层蛋白（S层蛋白）、完整肽聚糖（peptidoglycan，WPG）和EPS[15-16]，这些成分也被称为黏附素（adhesin）。其中EPS在非特异性黏附和特异性黏附中均发挥重要作用。

2.1 非特异性黏附

肠道上皮细胞表面包裹着一层黏液（约550 μm），而且菌体表面也有一层黏附层（约110 μm）[17]。乳酸菌进入肠道后首先依靠非特异性黏附作用在肠道表面定殖，定殖主要由细菌表面的疏水性取代基之间的的范德华力引力和与细菌表面所带的电荷的静电引力构成，由于链接不紧密这种黏附具有可逆性。而EPS在提高菌株对肠道表面的非特异性黏附能力方面起到重要作用[18]。乳酸菌分泌的EPS和具有肽链取代基的多糖在细胞外层形成具有黏附性的多糖外层，可与肠道黏液层接触，进而黏附。研究[19]显示乳酸菌合成的EPS与细菌聚集相关，对随后的黏附起到了促进作用，因EPS的表面分布决定LP6的疏水特性，证实EPS可以调节乳酸菌的黏附作用，乳酸菌和黏液层的疏水性接触可以影响乳酸菌的初步黏附。

2.2 特异性黏附

在非特异性黏附的作用下，乳酸菌在肠道的局部聚集，为菌体的特异性配体进一步与宿主细胞相应的受体之间特异性的结合提供了条件[20]。宿主表面的蛋白、糖蛋白和糖脂可能就是受体，也可选择性地吸附特定种类的细菌，这些受体是具有凝集红血球和酵母特性的糖蛋白或蛋白质。未吸附的细菌会随着肠绒毛的蠕动得到清除[21]。最近应用CaCo-2细胞（具有小肠微绒毛细胞的某些特性）作为黏附细胞在体外研究黏附性实验，均发现在去除或清除肠细胞表面顶端刷状边缘结构后乳酸菌在宿主肠道内的定殖量明显下降。经胰蛋白酶和过碘酸钠处理后的肠上皮细胞Lovo与双歧杆菌的黏附明显降低。以结构域的识别为结构基础，乳酸菌可与宿主表面的受体进行结合。不同种类乳酸杆菌黏附结构域具有同源性，而同一黏附素可以具有不同黏附结构域的存在，也可以出现一系列相同的连接域。因此乳酸菌可与致病菌竞争肠上皮微绒毛上的脂质和蛋白质上的相同复合糖 （glycoconjugate）受体，进而与致病菌竞争生存与繁殖空间、定居部位以及营养，形成生物屏障[22]。乳酸杆菌可以穿透肠黏膜并且在脾脏和其他器官中存活数天，从而刺激吞噬细胞活性。

3 乳酸菌胞外多糖诱导免疫应答

乳酸菌进入动物肠道与肠道上皮微绒毛上的受体特异性黏附后，优先占据肠道黏附位点。定殖后，乳酸菌通过其菌体表面分泌的活性成分与肠道外黏液层进行融合，此阶段主要是乳酸菌表面紧密相连的EPS发挥作用，随后乳酸菌与小肠上皮直接接触。因为HoPSs的结构简单、分子质量小并且没有取代基，其免疫原性较弱。相反，成分中含有磷酸盐（带有负电荷）的HePSs是极强的免疫反应诱导物[23]。乳酸菌亚种bulgaricus OLL-1073-R1可生成分别由酸性和中性两部分组成的HePSs，均含有葡萄糖和半乳糖，但在酸性组成的部分还含有0.1% PO4－。其中酸的部分是不同的巨噬细胞分化和增殖的强诱导剂，然而中性的部分并不能诱导刺激反应。并且，用化学反应去除磷酸基的HePSs在刺激免疫反应中作用有所降低。利用肠膜样明串珠菌模型中合成的α-葡萄糖HoPSs也可证明在免疫刺激中PO4－可发挥相应的作用[24]。磷酸化的右旋糖酐可诱导鼠脾脏的淋巴细胞亚群的增殖，以及IFN-γ和IL-10的基因表达，并可直接增强磷酸盐的含量[25]，证明磷酸盐是EPS触发免疫反应的主要取代基分子。

在肠道中，抗原呈递主要发生在派伊尔节（peyer’s patch，PPs）的滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium，FAE）。FAE是由单层柱状上皮细胞和散在分布的小肠上皮微皱褶细胞（M细胞）组成但M细胞的含量很少，然而它们可能在吸收益生菌菌体从而诱导免疫反应的过程中发挥重要作用。M细胞膜通常没有厚得糖萼，但存在独特的配糖体。这些糖配体与细菌凝集素发生配体/受体特异性作用。所以乳酸菌可能以与黏液素黏附相似的机制黏附到M细胞，从而进入PPs，引发免疫反应。在递呈的过程中乳酸菌胞外多糖促进肠道树突状细胞分泌趋化因子（fractalkine，FKN）和巨噬细胞炎症蛋白3α（macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α）的分泌并能增加受体CCR6和CX3CR1的表达量[26]。进而促进其通过M细胞及上皮下的树突状细胞，进入肠道的毛细血管。在此过程中乳酸菌胞外多糖可刺激DCs成熟的重要表面标志IL-12的分泌，进而增强DCs与T细胞之间免疫信号的转导，进一步诱导DCs的成熟[27]。与其他抗原物质对DCs产生趋化作用相似，DCs大量聚集于小肠上皮细胞固有层并可通过两种途径摄取EPS：一种是通过树突状细胞直接将树突通过细胞间隙伸入无菌黏膜层中摄取EPS；另一种是树突状细胞直接摄取通过M细胞进入固有层中的EPS。EPS发挥其生物学功能有赖于淋巴细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）相结合，其与DCs结合后即可启动免疫应答。能识别多糖类的模式识别受体有：Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）、β-葡聚糖受体、CD14、补体受体3（CR3）和Dectin-1等[28]。加强对EPS的抗原提呈能力增强肠道免疫。之后配体与PRR的结合可触发NF-κB等介导的信号发生，引发胞内一系列信号级联反应，导致转录激活和炎症相关因子的产生，诱导相关免疫基因表达。

4 乳酸菌胞外多糖的免疫调节机制

巨噬细胞在维护机体免疫内稳态和宿主防御中发挥关键作用，在静止的状态下，产生少量的促炎细胞因子维持可被病原体激活的能力。激活后可诱导吞噬作用的增加和对病原菌的杀伤力[29]。此外，如果入侵的病原体致病力较强巨噬细胞即产生介质，例如：IL-1β、TNF-α、MIP-1、MIP-1β、IL-8和IL-6，可促进中性粒细胞在肠道固有层的聚集，趋化后的中性粒细胞对巨噬细胞的吞噬能力起到辅助作用。DCs聚集于抗原暴露的位置实验发现乳杆菌细胞外多糖能够促进小鼠骨髓来源的树突状细胞分泌细胞因子IL-12p70的能力，IL-12p70是初始T细胞分化为Th1细胞过程中分泌的Th1型细胞因子，由此可见，EPS可以通过调节DC分泌不同类型的细胞因子，诱导机体Th1型细胞免疫应答，促进机体由固有性免疫向适应性免疫过渡[30]。与DCs结合后的乳酸菌在相关的淋巴结中积聚，活化肠上皮细胞内黏膜反应增加肠道内分泌性IgA的生成。乳酸杆菌肽聚糖（属于HePSs）能提高受刺激小鼠腹腔巨噬细胞中炎性细胞因子IL-1、TNF-α及脾淋巴细胞中IFN-γ的分泌[31]。此外还发现以稳定状态迁移的DCs将乳酸菌递呈至肠道的毛细血管中，促进CD4+T细胞增殖的同时诱导Th1类细胞因子的生成并调节外周血单核细胞的反应[32]。并且EPS活化后的单核巨噬细胞可大量分泌
IL-10、IL-12、IL-18和IFN-γ等多种细胞因子[33]。其中IL-10是抗炎性细胞因子，对Th1反应的反向抑制剂起到负调节作用，减少炎性因子的聚集，并活化B细胞。

递呈细胞处理后的EPS暴露于体液中激活抗体免疫反应。抗体产生的计量依赖于EPS所暴露的位置，这可能由于随着对食糜的消化EPS逐渐暴露的结果。暴露于小肠前段主要诱导分泌型IgA（secretory IgA，sIgA）低剂量的分泌，然而乳酸菌定殖在小肠后段时可诱导sIgA大量的生成[34]。sIgA在外分泌液中以双链和四链的形式存在，具有多链性、黏膜亲和性与抵抗蛋白酶作用的特性，比单链IgA更具有抗原结合力[35]。研究[36]表明肠系膜相关的淋巴组织是肠道黏膜免疫应答重要的感应部位。树突状细胞摄取的EPS与肠系膜相关的淋巴组织接触，活化的CD4+T细胞和促进可生成sIgA的浆细胞，使两者在充满肠道固有层。此外，实验已证明口服乳酸菌可提高IgA分泌细胞在小肠固有层的数量。并且发现刺激后的免疫细胞可以在各个黏膜组织部位间进行迁移和传送，这表明口服免疫刺激可以诱发远离肠道黏膜的免疫[37]。在炎症条件下，Th2反应可生成大量额外的IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，致使肠道中的细胞因子在较大的范围内变化。细胞因子的生成诱导B细胞的增殖和成熟为聚合性IgA分泌细胞最后生成特异性抗体。口服乳酸胞外多糖的实验动物中发现其肠道中IL-4和IL-10的量显著提高并且在肠黏膜中sIgA的分泌量显著增加。在黏膜组织中免疫球蛋白总量的80%是IgA，其中主要是sIgA，是抵抗感染主要黏膜免疫屏障因为特异性sIgA可以防止在肠道传染病和炎症性肠病期黏膜组织损伤和随后病原菌的定殖传播进入体液循环，使得其在炎症性反应过程中发挥重要作用。

EPS在免疫机制和免疫调节中仍有很多问题需要讨论。Yasuda等[35]利用干酪乳杆菌模型证明大体积高分子质量的HePSs具有免疫抑制效应。基因敲除突变体的胞外多糖基因可诱导鼠巨噬细胞系（RAW-264.7）和鼠的脾脏细胞中TNF-γ、IL-12、IL-10和IL-6的生成，这与野生型细菌相比具有较高的表达量。因此，乳酸菌的EPS可减少免疫细胞过度的反应，不仅抑制自身的刺激成分也抑制其他的抑制物。相似的，生成高分子质量EPS的乳酸菌RW-9595M刺激鼠类腹膜巨噬细胞，诱导TNF-γ和IL-6的低水平表达，然而同源的乳酸菌ATCC9595菌株诱导IL-12的高水平表达并且对IL-10产生抑制作用[37]。与短双歧杆菌同基因型的EPS突变体相比较，EPS＋（野生菌株）菌株刺激后的脾脏细胞中的促炎性细胞因子前体水平显著降低（IFN-γ、TNF-α和IL-12）。与此相反，与未处理小鼠相比较饲喂EPS－菌株的小鼠不同免疫细胞亚群的数量有所增加，并且在各组小鼠（空白对照组、饲喂EPS+和EPS－）免疫细胞中的细胞因子也存在差异。与双歧杆菌菌株分离出的EPS共同培养的人外周血单核细胞，具有特别的细胞因子组成，说明化学组成不同的EPS可以诱导不同的免疫反应[36]。菌类菌核的β-葡萄糖与细菌的EPS具有有相同的单体，但在空间构象和大小上存在不同，且对人单核细胞培养物产生增殖的变化。表明可能HePSs和HoPSs的EPS聚合物的大小，与它们的免疫性质具有特殊的联系。

5 结 语

在实际生产中乳酸菌胞外多糖转化率低，生产成本较高，要实现工业化生产还有待进一步的研究。现阶段国内外有关EPS的研究主要集中于影响EPS的生物合成条件。随着产多糖相关基因功能多糖结构与功能关系进一步的确定，并且结合糖代谢控制和生物信息学分析，弄清其遗传背景，可为通过基因工程获得高产优质胞外多糖菌株奠定基础。另外，面对抗生素滥用的日渐无能为力的现状，人们正在不断寻求新的更加有效的生物抗菌产品，通过基因改造提高乳酸菌在肠道的定殖量，随后分泌的相应益生素被肠道吸收。定殖的乳酸菌复制人工合成基因片段，并指导合成特定的蛋白质和多糖类胞外分泌物即可起到增强免疫的效果。可见乳酸菌EPS可以作为新型饲料添加剂，在医疗和保健方面的应用也已成为以后研究的重点。

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