3种处理方式对葛仙米藻胆蛋白清除
超氧阴离子自由基能力的影响

程 超1,2，薛 峰3，李 伟2，汪兴平2,*

（1.湖北民族学院林学园艺学院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；

3.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

摘 要：主要研究反复冻融、溶剂、pH值等对葛仙米藻胆蛋白清除超氧阴离子自由基能力的影响，并探讨藻胆蛋白的模拟胃肠液降解产物对超氧阴离子自由基清除能力的变化情况。结果发现反复冻融不会影响葛仙米藻胆蛋白清除超氧阴离子自由基的能力，磷酸缓冲液可提高藻胆蛋白清除超氧阴离子自由基的能力。pH 5.6和pH 7.3浸提物清除超氧阴离子自由基的能力差异不显著，但pH 8.1浸提液略优于其他两种。随着处理时间延长，模拟肠液消化产物清除超氧阴离子自由基能力逐渐增强，模拟胃液消化产物却逐渐下降。

关键词：葛仙米藻胆蛋白；反复冻融；pH；降解产物

Effect of Pretreatment and Extraction Conditions on Superoxide Anion Radical Scavenging Capacity of Phycobiliprotein from Nostoc sphaeroides Kützing

CHENG Chao1,2, XUE Feng3, LI Wei2, WANG Xing-ping2,*

(1. College of Forestry and Horticulture, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China;

2. College of Biological Science and Technology, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China;

3. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Abstract: We explored the effect of pretreatment and extraction conditions (repeated freeze-thawing, extraction solvent and pH) on the superoxide anion radical scavenging capacity of phycobiliprotein from Nostoc sphaeroides Küting. The results revealed that this activity was not affected by repeated freeze-thawing before extraction, but enhanced by using phosphate buffer as the extraction solvent. The extracts at pH 5.6 and pH 7.3 did not show a significant difference from each other with respect to superoxide anion radical scavenging capacity, although both slightly inferior to that obtained at pH 8.1. The superoxide anion radical scavenging capacity of phycobiliprotein from Nostoc sphaeroides Küting became stronger with increasing digestion time in simulated intestinal juice, but was attenuated in simulated gastric juice.

Key words: phycobiliprotein from Nostoc sphaeroides Küting; repeated freeze-thawing; pH; degradation products

中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）13-0026-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413005

葛仙米（Nostoc sphaeroides Küting）是一种蓝藻门蓝藻纲念珠藻科念珠藻属的低等淡水藻类，仅在湖北省鹤峰县走马坪镇有大面积生长。葛仙米中富含7%～8%的藻胆蛋白（phycobiliprotein，PBP），主要为藻蓝蛋白和藻红蛋白，其中藻蓝蛋白含量是藻红蛋白的3.5 倍左右[1]。近几年人们对PBP抗氧化特性进行了研究[2-6]，如汪兴平等[7]研究发现葛仙米藻胆蛋白对超氧阴离子自由基（O2－•）的清除效果较好；藻蓝蛋白能减少血液和肝脏中过氧化物及丙二醛含量[8]。

O2－•是一种可在体内产生的对细胞成分非常有害的自由基，会导致氢过氧化物的产生；也是许多活性物质的前提，过量的O2－•会给人体带来多种疾病[9]。此外衰老的自由基学说认为O2－•是导致细胞直接或间接损伤的重要活性氧[10]。

葛仙米藻胆蛋白为胞内蛋白，其提取中会涉及很多处理，如破壁、浸提、干燥等工序，这些处理方式是否会影响PBP的抗氧化特性还有待研究。本实验利用邻苯三酚-鲁米诺化学发光法测定样品对O2－•的清除作用，初步评价处理方式是否会影响葛仙米藻胆蛋白对O2－•的清除作用。

1 材料与方法

1.1 材料

葛仙米购于湖北省恩施市鹤峰县。

1.2 试剂

磷酸二氢钾、氢氧化钠、硫酸铵、乙酸、乙酸钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、邻苯三酚、碳酸钠等（均为分析纯）；鲁米诺 美国Sigma公司；胃蛋白酶（酶活力为1∶3 000）、胰蛋白酶（酶活力为1∶250） 美国Amresco公司。

1.3 仪器与设备

高速冷冻离心机、Ф660pH/Temp/Mv meter 美国Beckman Coulter公司；ALPHA1-4真空冷冻干燥机 德国Marin Chris公司；BPCL型超微弱化学发光测量仪 中国科学院生物物理研究所；Waters高效液相色谱仪（Waters 2998 Photodiode Array Detector，Waters e2695 Separations module） 美国沃特斯公司。

1.4 方法

1.4.1 样品的制备

反复冻融葛仙米藻胆蛋白：称取脱脂葛仙米粉30 g，复水后于－20 ℃反复冻融3 次，后高速匀浆，4 ℃条件下在pH 7.3 的50 mmol/L KH2PO4-NaOH缓冲液浸提，10 000 r/min离心15 min，20%饱和硫酸铵去除杂蛋白后，上清液接着用60%饱和硫酸铵沉淀，透析过羟基磷灰石柱层析后冷冻干燥得产品。用重蒸水、50 mmol/L
pH 7.3的KH2PO4-NaOH缓冲液溶解分别得样品水溶反复冻融葛仙米藻胆蛋白（water-soluble phycobiliprotein from repeatedly frozen-thawed Nostoc sphaeroides Küting，RFTWP）和磷溶反复冻融葛仙米藻胆蛋白（phosphate buffer-soluble phycobiliprotein from repeatedly frozen-thawed Nostoc sphaeroides Küting，RFTPP）。

未反复冻融葛仙米藻胆蛋白（phycobiliprotein from non-repeatedly frozen-thawed Nostoc sphaeroides Küting，NRFTP）：称取脱脂干葛仙米粉30 g，复水后高速匀浆处理，而后按照反复冻融的方法得样品。用重蒸水和pH 7.3的50 mmol/L KH2PO4-NaOH缓冲液溶解分别得水溶未冻融葛仙米藻胆蛋白（water-soluble phycobiliprotein from non-repeatedly frozen-thawed Nostoc sphaeroides Küting，NRFTWP）和磷溶未冻融葛仙米藻胆蛋白（phosphate buffer-soluble phycobiliprotein from non-repeatedly frozen-thawed Nostoc sphaeroides Küting，NRFTPP）。

不同pH值缓冲液样品：称取脱脂干葛仙米粉30 g，复水后－20 ℃反复冻融3 次，分别用pH 7.3的20 mmol/L
KH2PO4-NaOH、pH 5.6的20 mmol/L的乙酸-乙酸钠、pH 8.1的20 mmol/L的Tris-HCl缓冲液在4 ℃浸提，10 000 r/min离心15 min，20%饱和硫酸铵除杂蛋白，用60%硫酸铵沉淀，透析HA处理后冷冻干燥得pH 5.6、pH 7.3和pH 8.1的葛仙米藻胆蛋白。

1.4.2 模拟胃肠液的配制方法

按照参考文献[11]方法配制2×人工胃液和2×人工肠液。

1.4.3 葛仙米藻胆蛋白的模拟胃肠液降解

取50 mL三角瓶11 个，每瓶加10 mL 2×人工胃液，37 ℃保温10 min。然后分别加入10 mL 37 ℃预热的葛仙米藻胆蛋白溶液，37 ℃保温消化，在0、1、5、10、15、30、60、90、120、150、180 min取样，0.168 mol/L Na2CO3溶液调pH值为7～8终止反应。冷冻干燥得到不同时间胃液降解的样品。

1.4.4 蛋白质在人工肠液中降解程度

取50 mL三角瓶11 个，每管加入10 mL的2×人工肠液，37 ℃保温10 min。分别加入37 ℃预热的10 mL葛仙米藻胆蛋白溶液，37 ℃保温消化，在0、1、5、10、15、30、60、90、120、150、180 min取样，90 ℃加热5 min终止反应，冷冻干燥得不同时间肠液降解的样品。

1.4.5 对O2－•的清除能力

采用邻苯三酚-鲁米诺化学发光体系[12]：按照表1加入各种试剂。最后加入鲁米诺和碳酸缓冲液以启动反应，间隔2 s，测定300 s。用Origin8.0软件对曲线面积积分以此表示相对发光强度，按下式计算抑制率，各组数据采用

±s表示。

式中：CL对照、CL本底和CL样品分别表示对照组、本底和样品的相对发光强度。

表 1 邻苯三酚-鲁米诺化学发光体系

Table 1 Pyragollic acid-luminol luminescence system

1.4.6 HPLC条件

将样品用不同pH值溶液溶解后过0.44 μm滤膜后上样，HPLC柱型号：SEC-300（4.8 mm×300 mm）Sepax Technologies；洗脱液：0.1 mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液，上样量：20 μL，柱温：27 ℃；流速：
0.3 mL/min；柱压：2.76 MPa；检测波长：280 nm[13]。

1.5 数据分析

采用Origin8.0软件作图，SPSS16.0软件对数据结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 反复冻融和不同溶剂处理葛仙米藻胆蛋白对O2－•的清除作用

周站平等[14]曾报道：藻蓝蛋白经过冻融后表现为清除自由基，未经冻融的可产生自由基。因此本部分按照实验方法分别制备反复冻融和未反复冻融的藻胆蛋白，而后将其分别用重蒸水和pH 7.3的KH2PO4-NaOH缓冲液溶解，按化学发光法测定其对O2－•的清除作用，具体结果见图1～4。

a.化学发光曲线；b.剂量-效应关系图；0.对照；1～6.样品质量浓度分别为 0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/mL。图2～7同。

图 1 RFTPP对O2－•的抑制作用

Fig.1 Superoxide anion radical scavenging activity of RFTPP

图 2 RFTWP对O2－•的抑制作用

Fig.2 Superoxide anion radical scavenging activity of RFTWP

图 3 NRFTWP对O2－•的清除作用

Fig.3 Superoxide anion radical scavenging activityof NRFTWP

图 4 NRFTPP对O2－•的清除作用

Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activity of NRFTPP

根据图1～4可以计算出RFTPP、RFTWP、NFRTPP和NRFTWP对O2－•的IC50值分别为1.060、1.110、1.097、1.161 mg/mL，统计分析发现4 种处理对O2－•的清除作用差异均不显著（P=0.187）。即反复冻融处理不会影响葛仙米藻胆蛋白对O2－•的清除作用，而且前期研究发现：反复冻融处理还可提高葛仙米藻胆蛋白得率[15]，因此提取藻胆蛋白可将葛仙米进行反复冻融处理。本结果与周站平等的结果有差异，可能是因为两种实验材料不同，材料差异导致内含的藻胆蛋白种类不同，冻融处理对不同的藻胆蛋白种类产生的效果有可能不同。溶剂对藻胆蛋白的抗氧化特性有一定影响，缓冲盐溶液可提高其对O2－•的清除能力，这可能是因为缓冲盐改变了溶液的离子强度，而离子强度会影响藻胆蛋白的聚集状态（藻胆蛋白的六聚体与单体间的平衡）[16]，因此以下处理均采用缓冲液。

2.2 浸提液pH值对葛仙米藻胆蛋白抗氧化特性的影响

藻胆蛋白在pH 5～8之间存在聚合度的转变，按照参考文献[17-20]，本实验分别制备pH 5.6、pH 7.3和pH 8.1的葛仙米藻胆蛋白，其对O2－•的清除作用见图5～7。

图 5 pH 5.6 PBP对O2－•的清除作用

Fig.5 Superoxide anion radical scavenging activity of phycobiliprotein extracted with pH 5.6 PBP

图 6 pH 7.3 PBP对O2－•的清除作用

Fig.6 Superoxide anion radical scavenging activity of phycobiliprotein extracted with pH 7.3 PBP

图 7 pH 8.1 PBP对O2－•的清除作用

Fig.7 Superoxide anion radical scavenging activity of phycobiliprotein extracted with pH 8.1 PBP

由图5～7可知，pH 5.6、7.3、8.1的PBP对O2－•的IC50分别为1.103、1.060、1.010 mg/mL，统计分析发现：三者对O2－•的清除作用差异均不显著。但pH 8.1的浸提液葛仙米藻胆蛋白对O2－•的清除作用要略强于其他两种浸提液。这可能是由于不同pH值缓冲液浸提时葛仙米藻胆蛋白的聚集状态不同而引起的。因此对不同pH值浸提液进行HPLC分析，结果见图8～10。

a. HPLC；b. UV图。图9、10同。

图 8 pH5.6的葛仙米藻胆蛋白的HPLC及紫外扫描图

Fig.8 HPLC profile and UV absorption spectrum of phycobiliprotein extracted with pH 5.6 buffer

图 9 pH7.3的葛仙米藻胆蛋白HPLC及紫外扫描图

Fig.9 HPLC profile and UV absorption spectrum of phycobiliprotein extracted with pH 7.3 buffer

图 10 pH8.1的葛仙米藻胆蛋白的HPLC及紫外扫描图

Fig.10 HPLC profile and UV absorption spectrum of phycobiliprotein extracted with pH 8.1 buffer

由图8～10可知，pH 5.6和pH 7.3浸提液中藻胆蛋白保留时间为11.300 min和11.374 min，非常接近，因此两种浸提液中藻胆蛋白对O2－•的清除效果相当；但pH 8.1浸提液藻胆蛋白保留时间后移至16.991 min，说明其藻胆蛋白的分子质量减小，聚合程度下降，同时pH 8.1浸提液中增加了一个保留时间为23.056 min的吸收峰，这并不是藻胆蛋白类物质，因此综合考虑选择pH 7.3为浸提液。

2.3 葛仙米藻胆蛋白模拟胃肠液降解产物对O2－•的清除作用

a.化学发光曲线；b.处理时间-效应关系图。图12同。

图 11 模拟肠液消化产物对O2－•的清除作用

Fig.11 Effect of simulated intestinal liquid on the superoxide anion radical scavenging activity of phycobiliprotein

图 12 模拟胃液消化产物对O2－•的清除作用

Fig.12 Effect of simulated gastric liquid on the superoxide anion radical scavenging activity of phycobiliprotein

由图11、12可知，随处理时间延长，模拟肠液消化产物对自由基清除能力增强，而模拟胃液消化产物对自由基清除能力下降。这可能是由于胃液或肠液的降解产物分子质量不同而导致的[22]。

3 结 论

综上所述，作为破壁方法之一的反复冻融处理不会影响葛仙米藻胆蛋白对O2－•的清除效果，缓冲液作为浸提液可使葛仙米藻胆蛋白对O2－•的清除作用增强，同时不同pH值缓冲液浸提液中，由于藻胆蛋白的聚合度不同导致其对O2－•清除作用有差异。此外随处理时间延长，模拟肠液消化产物对O2－•清除能力增强，而模拟胃液消化产物对O2－•清除能力下降。主要是由于模拟胃液中藻胆蛋白的降解程度强于模拟肠液的，即模拟胃液中小分子物质的含量远高于模拟肠液的，尤其是随着处理时间延长，这种小分子物质含量差异越明显，而藻胆蛋白的抗氧化功能与其分子质量具有很大关系[23]，因此藻胆蛋白只有适度降解后才能增加其抗氧化功能。

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