鲢鱼卵中低分子CPIs的纯化鉴定及改善
鱼糜凝胶强度的效果研究

刘 玲,蒋然然,彭海鑫,李艳芳,任阳阳,肖安蓬,陈 海,李树红*

(四川农业大学食品学院,四川 雅安 625014)

 

摘 要:通过比较鲢鱼卵半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine proteinase inhibitors,CPIs)粗提过程中的比活力(Azocasein法),确定其最佳粗提条件为:以含0.1 mmol/L苯甲基 磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)作为匀浆缓冲液,并于30 ℃对匀浆样进行pH 3.0酸处理10 min,然后碱回调至pH 8.0,CPIs纯度提高了15.54 倍。进一步经SP Sepharose Fast Flow阳离子层析验证表明,与pH 4.0相比,pH 3.0酸处理能高效除去活性峰Ⅱ中的酸碱及热不稳定杂蛋白,使CPIs比活力提高了48.22 倍。采用Sephacryl S-200分子筛层析,获得部分纯化的低分子CPIs组分Ⅱ-b和Ⅱ-c,比活力和纯化倍数分别为1 098.59 U/mg、312.10 倍和1 769.23 U/mg、502.62 倍。电泳分析表明,明胶底物-SDS-反相酶谱法无法鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c的抑制活性;而与木瓜蛋白酶在适宜条件下反应后进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)则初步鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c中均含有至少7 kD和10 kD两种低分子CPIs。最后经质构分析表明,Ⅱ-b和Ⅱ-c以5 U/g添加入鲢鱼鱼糜时,均能够极显著提高鲢鱼鱼糜凝胶强度(48.77%和55.55%),抑制软化。

关键词:鲢鱼卵;半胱氨酸蛋白酶抑制因子;纯化;鉴定;鱼糜凝胶强度

 

Purification and Characterization of Low-Molecular-Weight Cysteine Proteinase Inhibitors (CPIs) from
Silver Carp Eggs and Their Effects on Improving Gel Strength of Surimi

 

LIU Ling, JIANG Ran-ran, PENG Hai-xin, LI Yan-fang, REN Yang-yang, XIAO An-peng, CHEN Hai, LI Shu-hong*

(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

 

Abstract: In this study, the optimum isolation condition of crude cysteine proteinase inhibitors (CPIs) from silver carp eggs that provided increased specific activity as measured by Azocasein assay was determined as homogenization using 20 mmol/L phosphate buffer containing 0.1 mmol/L phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) at pH 6.0, and pH readjustment to 8.0 after acid (pH 3.0) treatment of the homogenate at 30 ℃ for 10 min. Under the optimized conditions, the purity of CPIs was enhanced 16.54 folds. SP Sepharose fast flow chromatography analysis demonstrated effective removal of acid, alkali and protein impurities with poor thermal stability using acid treatment at pH 3.0 than at pH 4.0, giving rise to a purification factor of 48.22. After further chromatography on a Sephacryl S-200 column, partially purified low-molecular-weight fractions named as Ⅱ-b and Ⅱ-c were obtained with a specific activity of 1 098.59 and 1 769.23 U/mg, respectively, and their purification folds were 312.10 and 502.62 times, respectively. The electrophoresis analysis showed that Ⅱ-b and Ⅱ-c could not be identified by gelatin substrate-SDS-reverse zymography. However, after reaction with papain under the appropriate condition, both fractions were found to contain at least two low-molecule-weight CPIs (7 and 10 kD) as indicated by SDS-PAGE analysis. When added to silver carp surimi at a level of 5 U/g, each fraction significantly improved the gel strength significantly by 48.77% and 55.55%, respectively, and inhibited softening.

Key words: silver carp eggs; cysteine protease inhibitors; purification; characterization; surimi gel strength

中图分类号:TS254.1 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)13-0037-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413007

鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)是我国主要淡水养殖品种,每年养殖产量371.39t,位居第2位[1]。鲢鱼采肉率低,加工过程中产生大量下脚料和废弃物,约占鱼体的50%~60%[2]。研究表明鱼类内脏、卵巢、睾丸、鱼皮、血浆等加工废弃物中,均存在半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine proteinase inhibitors,CPIs)活性[3]。

CPIs是一类专门抑制活性中心含有半胱氨酸(Cy-SH)残基的蛋白酶的抑制因子[4]。目前,尽管对陆生哺乳动物来源CPIs的研究相对较深入。但由于鱼类进化地位和生存环境的明显差异,鱼类来源CPIs很可能具有某些特殊的性质或活性。然而,在此方面的研究尚十分有限。此外,在食品领域已有研究表明鱼类来源的Cystatins可有效抑制鱼糜凝胶软化相关热稳定蛋白酶[5-7],因此推测有望开发为鱼糜制品弹性改良剂。

目前除作者所在研究团队从鲢鱼卵中部分纯化出了89kD CPIs[8]外,有关鲢鱼低分子CPIs的研究还未见报道。因此,本实验在对鲢鱼卵低分子CPIs粗分离进行条件优化的基础上,进一步对其纯化鉴定,并初步测定了鲢鱼低分子CPIs对改善鲢鱼鱼糜凝胶强度的作用效果,以便为后续深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

怀卵期(Ⅳ期)鲢鱼于四川崇州通威养殖中心采集,宰杀后立即采卵,液氮速冻后于-80 ℃超低温冰箱冻藏,使用前4 ℃解冻。

荧光合成肽(benzyloxycarbonyl-L-phenylalany-L-arginyl-4-methyl-7-coumarylamide,Z-Phe-Arg-MCA)、偶氮酪蛋白(azocasein)、苯甲基 磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、明胶、荧光标品(7-amino-4-methylcoumarin,AMC)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、丙烯酰胺(acrylamide,Acr)、
甲叉双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacrylamide,Bis)、
过硫酸铵(ammonium persulfate,Aps) 美国
Sigma公司;木瓜蛋白酶 成都康迪生物技术有限公司;蛋白浓度试剂盒 南京建成生物工程研究所;
SP Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 美国GE公司;中分子质量Marker(14.4~94 kD) 北京天根生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BR4i大容量高速冷冻离心机、Varioskan全波长多功能酶标仪 美国Thermo公司;PHS-320酸度计 成都世纪方舟有限公司;Biologic Duo Flow全自动中高压层析系统、Mini Protein3垂直电泳槽、PowerPac 3000电泳电源、Gel Doc 2000凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司;Ultra-8050超滤杯 美国Millipore公司;TA-XTPlus质
构仪 英国Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 鲢鱼卵CPIs粗提取条件的筛选

分别取鲢鱼卵(约30 g)用4 倍体积的不同pH值的3 种提取缓冲液(Ⅰ:含0.1 mmol/L PMSF的20 mmol/L
磷酸盐缓冲液,pH6.0;Ⅱ:含0.1 mmol/L PMSF的20 mmol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0;Ⅲ:含0.1 mmol/L
PMSF的20 mmol/L Tris-HCl缓冲液,pH8.0)匀浆,10 000×g离心20 min取上清液,经4 层纱布过滤后得CPIs匀浆液。取最佳匀浆缓冲液提取的粗提物,进行不同条件的酸碱处理。即匀浆液4 ℃用1 mol/L HCl调节pH值至3.0或4.0,再分别于4 ℃或30 ℃静置10 min,此后于4 ℃用1 mol/L NaOH分别回调至pH值至6.0或8.0。最后10 000×g离心10 min取上清为最终的粗提液。以上步骤除特殊说明外,均在4 ℃操作。采用下述Azocasein法检测各匀浆液、酸碱处理后的粗提液的总活力和比活力,筛选适宜的粗分离条件。

1.3.2 蛋白质量浓度的测定

采用Bradford法[9],按照试剂盒说明,测定各步骤所得粗提取液的蛋白质量浓度。

1.3.3 CPIs抑制活性的测定

1.3.3.1 Azocasein法

Azocasein法参考Li Dekun等[5]方法,以Azocasein为底物测定粗提取各步骤的总活力和比活力。调节CPIs的加入量,使测定的其对木瓜蛋白酶水解Azocasein活性的抑制率处于30%~70%之间[10]。CPIs抑制活性单位定义为:在反应条件(37 ℃,pH7.0)下,440 nm波长处吸光度降低0.01即为1个单位。

1.3.3.2 荧光合成肽底物法

层析过程中,以灵敏度更高的荧光合成肽Z-Phe-Arg-MCA为底物,于激发波长360 nm,发射波长440 nm下监测洗脱物对木瓜蛋白酶活性的抑制情况,具体参照Anastasi等[11]方法。调节CPIs的加入量,使测定的抑制率在30%~70%之间[10]。1个酶活力单位定义为:在反应条件(40 ℃、pH 6.8)下,能够在1 min内水解底物并释放出1 nmol/L AMC产物的酶活性量(1 nmol AMC/min)。1个抑制活性单位定义为:抑制1 个单位的酶活性。

1.3.4 鲢鱼卵低分子CPIs的层析纯化

粗提液用Amicon YM-3超滤膜(截留分子质量为3 kD)浓缩,透析(A液:20 mmol/L的磷酸盐缓冲液,pH6.0)后进行SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析。SP Sepharose Fast Flow柱(2.6 cm×15 cm)首先用A液压实、平衡。微滤后的粗提液上样,用A液洗去不吸附的蛋白,然后用含0~1 mol/L NaCl的A液进行梯度洗脱。流速6.7 mL/min,每分钟收集一管。荧光合成肽底物法测定每个收集管中的CPIs抑制活性。收集的活性部分,浓缩、微滤后上Sephacryl S-200分子筛层析柱(1.0 cm×90 cm)。用含0.2 mol/L NaCl的A液洗脱,流速0.07 mL/min,每管收集1.0 mL。荧光合成肽底物法测定每个收集管中的CPIs抑制活性。收集活性部分经浓缩作为最终纯化物。

1.3.5 鲢鱼卵低分子CPIs的SDS-PAGE鉴定

Sephacryl S-200分子筛层析收集的活性部分,浓缩、适当透析(A液)后进行还原性SDS-PAGE。另取浓缩的CPIs收集液(小于2.5 μg)与0.625 µg的木瓜蛋白酶混合,置于37 ℃水浴反应5 h以上,煮沸5 min后,再进行还原性SDS-PAGE。2.5 µg的BSA与0.625 µg的木瓜蛋白酶混合液,经相同处理后作为对照样。

SDS-PAGE按照Laemmli[12]的方法。采用17%分离胶和4%浓缩胶,每泳道上样20 μL,120 V稳压下电泳约2 h。考马斯亮蓝R-250染色,脱色液(95%乙醇、冰醋酸、蒸馏水体积比4.50.55)脱色至电泳条带清晰可见。

1.3.6 鲢鱼卵低分子CPIs的明胶底物-SDS-反相酶谱法鉴定

鲢鱼卵低分子CPIs的反相酶谱电泳基本参照Saitoh等[13]的方法。不同之处在于,同时以比样品质量浓度稍高的BSA做CPIs反相酶谱电泳的对照。此外,复性后的凝胶用含0.4 mg/mL的木瓜蛋白酶的50 mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)在4 ℃反应1 h,随后用含1%明胶的50 mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)在37 ℃反应12 h。

1.3.7 鲢鱼鱼糜凝胶的制备

鱼糜凝胶的制备基本参考Nakamura等[14]的方法进行。取新鲜鲢鱼背部白肉,绞碎,漂洗脱水后,添加10%碎冰空擂,再加入3% NaCl盐擂,得鱼糜(操作温度低于10 ℃)。实验组取适量鱼糜,以1 g鲢鱼肉糜加入5 个活性单位(Azocasein法)的CPIs纯化液后,填入直径为12 mm的5 mL离心管中,5 000×g离心5 min。采用二段加热法,即首先50 ℃加热1 h,然后置于90 ℃水浴锅中继续加热20 min。对照组加入与实验组CPIs纯化液相同体积的超纯水,其余操作同实验组。90 ℃加热后,所有的凝胶立刻在冰水中冷却30 min,4 ℃存放过夜备用。

1.3.8 鱼糜凝胶强度的测定

鱼糜凝胶在室温放置2 h后,将其切成高度20 mm的均一圆柱体。于TA-XTPlus质构仪上检测各组凝胶的破断力和凹陷深度。以破断力与凹陷深度的乘积计算凝胶强度。

凝胶强度/(gmm)=破断力/g×凹陷深度/mm

采用压缩模式,参数设定为:压缩距离14 mm,测试速率1 mm/s,触发力5.0 g,5 mm的圆球形探头(P/0.25S)。对照组和实验组每组取8 个试样测定即8 次重复,采用SPSS19.0数学软件进行统计分析,计算各指标的平均值和标准差,采用One-Way ANOVA法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 鲢鱼卵CPIs粗提取条件的筛选

表 1 鲢鱼卵CPIs匀浆缓冲液的筛选

Table 1 Selection of optimal homogenization buffer for extraction of CPIs from silver carp eggs

提取缓冲液

蛋白质量浓度/(mg/mL)

总活力/U

比活力/(U/mg)

Ⅰ(pH 6.0)

30.40±2.03 Cc

16 900±1 559Ab

3.49±0.34Aa

Ⅱ(pH 7.0)

40.31±1.27Bb

18 600±1 200Aab

3.08±0.20Bb

Ⅲ(pH 8.0)

48.90±0.46 Aa

20 100±900Aa

2.74±0.12Bc

 

注:同列大写字母不同表示差异显著(P<0.05);同列小写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。下同。

 

由表1可知,缓冲液Ⅰ所得鲢鱼卵CPIs匀浆样的总活力在3 种匀浆缓冲液提取样中最低(P>0.05或0.01<
P<0.05),但是其比活力最高,为3.49 U/mg,极显著高于其他两组(P<0.01)。提示pH 6.0的匀浆液缓冲液Ⅰ更适合鲢鱼卵CPIs的粗提取,因此匀浆步骤选择此缓冲液作为提取液。

表 2 鲢鱼卵CPIs酸碱处理条件的筛选

Table 2 Selection of optimal acid-base treatment conditions for CPIs from silver carp eggs

组别

处理条件

蛋白质量浓度/(mg/mL)

总活力/U

比活力/(U/mg)

1

pH3.0,4 ℃、10 min,回调pH6.0

3.48±0.23Dd

8 000±562Ee

28.64±2.01Dd

2

pH3.0,4 ℃、10 min,回调pH 8.0

1.86±0.19Ee

6 240±244 Ff

41.90±1.64 Bb

3

pH3.0,30 ℃、10 min,回调pH6.0

3.12±5.44Dd

9 120±80Dd

36.45±0.32 Cc

4

pH3.0,30 ℃、10 min,回调pH 8.0

1.62±0.33Ee

7 520±80Ee

57.72±0.61Aa

5

pH4.0,4 ℃、10 min,回调pH6.0

29.22±0.47Cc

12 640±244 Bb

5.40±0.10Ee

6

pH4.0,4 ℃、10 min,回调pH8.0

31.54±4.35 Bb

14 400±403Aa

5.71±0.13Ee

7

pH4.0,30 ℃、10 min,回调pH6.0

31.73±4.35 Bb

11 200±320Cc

4.41±0.13Ee

8

pH4.0,30 ℃、10 min,回调pH 8.0

32.38±0.93Aa

12 640±403Bb

4.88±0.16Ee

 

 

由表2可知,经1 mol/L HCl调节至pH3.0的各组样液中CPIs抑制比活力均极显著(P<0.01)高于pH 4.0酸处理的各组样液,尤其以pH 3.0酸处理后30 ℃放置10 min后回调pH 8.0的处理条件下比活力最高,因此,最终第4组处理条件作为适宜的粗分离条件。此条件下CPIs的比活力(57.72 U/mg)与最适匀浆步骤比活力(3.49 U/mg)相比,提高了15.54 倍,说明30 ℃、pH 3.0酸处理10 min而后回调pH 8.0,去除了大部分酸碱不稳定及一部分热不稳定的杂蛋白。

2.2 鲢鱼卵CPIs的层析纯化

实验选取了鲢鱼卵CPIs pH 3.0酸处理中的第4组和pH 4.0酸处理中的第8组样液(除酸处理pH值不同外,其他处理条件相同),经适当浓缩、透析后,分别上
SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析,进一步分析pH3.0酸处理的纯化效果(图1、2)。两组样品阳离子层析后均分离得到4 个活性部分,即CPI-Ⅰ、CPI-Ⅱ、CPI-Ⅲ、CPI-Ⅳ。但与pH 4.0相比,pH 3.0处理组的显著特点是活性峰CPI-Ⅱ的紫外吸收峰明显降低,说明pH3.0酸处理的显著纯化作用在于高效除去了活性峰Ⅱ中的杂蛋白,使CPI-Ⅱ比活力提高了48.22 倍(表3)。本研究继续选此部分进行下一步的Sephacryl S-200分子筛层析(图3),再次除去了较多高分子质量的杂蛋白,并在低分子部分呈现3 个活性峰,编号分别为Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c,其中Ⅱ-b、Ⅱ-c的比活力分别为1 098.59U/mg和
1 769.23 U/mg,纯化了312.10、502.62 倍。

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图 1 pH3.0酸处理后鲢鱼卵CPIs的SP Sepharose Fast Flow

阳离子交换层析

Fig.1 SP Sepharose fast flow chromatography of crude CPIs extract after acidification at pH 3.0

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图 2 pH4.0酸处理后鲢鱼卵CPIs的SP Sepharose Fast Flow

阳离子交换层析

Fig.2 SP Sepharose fast flow chromatography of CPIs crude extract after acidification at pH 4.0

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图 3 阳离子层析收集的鲢鱼卵CPIs-Ⅱ的Sephacryl S-200分子筛层析

Fig.3 Sephacryl S-200 chromatography of CPIs-Ⅱ collected from
SP Sepharose fast flow chromatography

表 3 鲢鱼卵小分子CPIs组分Ⅱ-b和Ⅱ-c的纯化结果

Table 3 Purification of Ⅱ-b and Ⅱ-c from silver carp eggs

步骤

蛋白质量浓度/

(mg/mL)

总蛋白

质量/mg

总活

力/U

比活力/(U/mg)

纯化

倍数

回收

率%

匀浆(pH 6.0)

31.61

5 056.82

17 800

3.52

1

100

酸处理(pH 3.0~8.0)

1.02

137.59

7 840

56.98

16.19

44.04

SP Sepharose Fast Flow(Ⅱ峰)

6.08

18.24

3 160

173.25

49.22

17.75

Sephacryl S-200(Ⅱ-b)

0.89

0.71

780

1 098.59

312.10

4.38

Sephacryl S-200(Ⅱ-c)

0.52

0.52

920

1 769.23

502.62

5.17

 

 

2.3 鲢鱼卵CPIs的SDS-PAGE

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M.标准蛋白;1.Ⅱ-a;2.Ⅱ-b;3.Ⅱ-c。

图 4 Sephacryl S-200分子筛层析后收集的鲢鱼卵CPIs部分的SDS-PAGE

Fig.4 SDS-PAGE of CPIs from silver carp eggs after Sephacryl S-200 chromatography

由图4可知,电泳后,Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c在低分子质量部分均呈现了清晰的条带。其中Ⅱ-a除在23、16 kD(图4中泳道1中箭头所示)处有明显低分子条带外,尚含较多的高分子质量成分,Ⅱ-b仅在约16、10、7 kD(图4泳道2中箭头所示)处呈现了3 条带,而抑制活性最高的Ⅱ-c仅在10 kD和7 kD(图4泳道3中箭头所示)附近呈现两条带。但Ⅱ-b及Ⅱ-c的7 kD处条带均稍呈弥散状态,其中很可能还混有没有分开的其他小蛋白组分。综合电泳图谱及纯化倍数,说明适宜的酸碱处理条件加上
SP Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-200两步层析,能除去大部分杂蛋白,使鲢鱼卵中部分低分子CPIs得到了快速有效的纯化。

2.4 鲢鱼卵CPIs抑制条带的电泳鉴定

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1.BSA;2.Ⅱ-b;3.反相酶谱处理后的BSA;4.反相酶谱处理后的Ⅱ-b。

图 5 鲢鱼卵低分子CPIsⅡ-b的明胶底物-SDS-反相酶谱鉴定

Fig.5 Identification of Ⅱ-b by gelatin-SDS-reverse zymography

采用明胶底物-SDS-反相酶谱法进行抑制条带鉴定,以质量浓度稍高于样品的BSA做对照,对Ⅱ-b进行抑制条带的鉴定,由图5可知,37 ℃反应12 h后,在BSA尚未完全水解时,Ⅱ-b已经消失,即在反相酶谱电泳中Ⅱ-b没有体现出抑制活性,说明该方法并不适合鉴定鲢鱼卵低分子CPIs。

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1. 木瓜蛋白酶;2.BSA;3. BSA+木瓜蛋白酶;6.标准蛋白;
7. Ⅱ-b;8. Ⅱ-b+木瓜蛋白酶;9. Ⅱ-c;10. Ⅱ-c+木瓜蛋白酶。

图 6 Ⅱ-b及Ⅱ-c与木瓜蛋白酶反应后抑制条带的SDS-PAG鉴定

Fig.6 Identification by SDS-PAGE of Ⅱ-b and Ⅱ-c after reaction with papain

将Ⅱ-b和Ⅱ-c(均小于2.5 μg)与0.625 μg木瓜蛋白酶在适宜条件下反应后,进行SDS-PAGE检测,并以2.5 μg的BSA作为对照。由图6可知,0.625 μg的木瓜蛋白酶能彻底水解2.5 μg BSA(泳道3),但同样水解条件下,Ⅱ-b中仅16 kD条带消失(泳道8),而10 kD和7 kD的蛋白条带几乎没有变化,表明二者能够抑制半胱氨酸蛋白酶的水解作用。Ⅱ-c与木瓜蛋白酶反应前后,其10 kD和7 kD处的蛋白条带亦几乎没有变化。因而初步判断Ⅱ-b及Ⅱ-c中均存在10 kD和7 kD的低分子抑制因子,但由于7 kD条带呈弥散态,因此推测Ⅱ-b及Ⅱ-c中也可能同时存在低于7 kD的抑制因子,具体成分及种类还有待鉴定。

2.5 鲢鱼卵CPIs对鲢鱼鱼糜凝胶强度的影响

鱼糜凝胶软化的抑制研究表明,当Ⅱ-b、Ⅱ-c在鲢鱼糜中的添加量为5 U/g(Azocasein法)时,明显抑制了鱼糜凝胶软化。由图7可知,相对于对照组凝胶强度分别增加了48.77%(P<0.01)和55.55%(P<0.01),但二者之间差异不显著(P>0.05),说明Ⅱ-b中16 kD杂蛋白对鲢鱼低分子CPIs抑制鱼糜凝胶软化的作用影响不大。

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大写字母不同表示差异显著(P<0.05);对照组.添加水;实验组1.添加Ⅱ-b;实验组2.添加Ⅱ-c。

图 7 添加CPIs对鱼糜凝胶强度的影响

Fig.7 Effects of added CPIs on gel strength of surimi

3 讨 论

尽管对鱼类CPIs的研究有限,但相关报道均表明在鱼类CPIs粗分离过程中,根据其具有较宽的pH值稳定范围,可采用酸碱处理提高纯化效率。Yamashita等[15]在纯化大麻哈鱼(Oncorhynchus keta)卵低分子(16 kD及11 kD)CPIs时,即采用了pH 3.0~6.0的酸碱处理提取条件。刘健安等[16]从鲫鱼(Carassius aumtus)卵中分离低分子CPIs(14 kD和9.2 kD)时,同样采用pH4.0~8.8的酸碱处理,比活力提高2.09 倍。本实验中,在适宜粗提条件下(30 ℃时pH 3.0处理10 min,回调pH 8.0),类似地鲢鱼卵CPIs比活力提高了15.45倍,进一步通过阳离子交换层析,证明酸碱处理主要除去的是CPI-Ⅱ部分的杂蛋白,对CPIs的抑制活性影响不大。因此,推测实验所得两部分鲢鱼卵低分子CPIs(Ⅱ-b和Ⅱ-c)具有耐受pH 3.0至pH 8.0及30℃的良好酸碱稳定性及热稳定性。

Cystatins超家族[17]是动物源CPIs的最主要类群,其划分为低分子质量的家族Ⅰ Stefin(约11 kD)和家族Ⅱ Cystatin(约13 kD),以及高分子质量的家族Ⅲ Kininogen(约50~120 kD)[4,18]。此外低分子质量的Thyropins家族[19]、类前体肽类[20]等抑制剂也属于动物源CPIs的类群。在鱼类中,除发现18 kD的类Stefin[6]、12 kD [21]、16.8 kD [22]、17 kD [22]的Cystatin外,也证实存在低分子的(6、9、11 kD)Thyropins家族CPIs[15,23]和类前体肽CPIs[20]。日本鳗鱼(Anguilla japonica)皮中还分离到了16 kD的类凝集素类新型低CPI[24]。本实验中低分子活性部分Ⅱ-b和Ⅱ-c经电泳分析鉴定,初步判断除10 kD和7 kD外,还可能包括分子质量更低的CPIs,它们是否分属于CPIs的不同类群,但是还有待进一步分离纯化和分类鉴定。

明胶-底物-SDS-PAGE反相酶谱法无法成功鉴定纯化的鲢鱼卵低分子CPIs,这可能与鱼种有关,鲢鱼卵CPIs的活性较低。此外,此法中所用的非离子型去垢剂SDS可能导致了鲢鱼CPIs结构不稳定,致使其活性减弱或失活。研究表明鲤鱼Cystatin(家族Ⅱ)表面均匀分布正电荷[25],带负电荷的SDS很可能改变Cystatin构象,从而影响其活性。而Ⅱ-b和Ⅱ-c与木瓜蛋白酶在适宜条件下反应后,再进行SDS-PAGE分析,则可能避免了SDS对其结构和活性的影响,因此使得抑制条带得到鉴定。

目前采用直接添加分离纯化的鱼源低分子CPIs抑制鱼糜凝胶软化的研究寥寥无几,通常是以重组低分子CPIs作为研究对象[26],其实际应用受限。因此,深入研究天然的鱼源CPIs的活性特征及对鱼糜凝胶软化的抑制效果,具有重要意义。鱼糜凝胶化的最适pH值范围通常在6.5~7.5,同时本实验中经pH3.0~8.0酸碱处理后得到的低分子CPIs,在pH 6.5~7.5范围内应具有较好稳定性。此外,鲢鱼鱼糜在50 ℃最易发生凝胶软化[27]。尽管本实验中Ⅱ-b和Ⅱ-c是部分纯化的小分子CPIs,但实验证明添加Ⅱ-b和Ⅱ-c后,在50 ℃条件下凝胶化的鲢鱼鱼糜凝胶强度显著增加(P<0.01),说明鲢鱼卵低分子CPIs能够提高鲢鱼鱼糜的凝胶形成能,具有开发为鱼糜弹性改良剂的应用前景。但是为了更充分有效的利用鲢鱼卵中CPIs资源,目前还有待对其中的CPIs进行系统的分离纯化,深入鉴定其分类及生物学活性特征。

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收稿日期:2013-07-13

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31101249)

作者简介:刘玲(1989—),女,硕士研究生,研究方向为水产品加工理论技术。E-mail:piaoll1989@126.com

*通信作者:李树红(1975—),女,副教授,博士后,研究方向为水产品加工理论与技术。E-mail:xiaoshu928@126.com