蛹虫草菌糠多糖的分离纯化及结构组成分析

张 颖1，曾 艳2，张丽姣2，崔世茂1，孙媛霞2,*

（1.内蒙古农业大学农学院，内蒙古 呼和浩特 010010；2.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308）

摘 要：以蛹虫草菌糠为原料，利用纤维素酶酶解提取多糖，通过乙醇分级醇沉与Sevag法脱蛋白对所提多糖进行初级分离纯化，得到4种多糖（P1、P2、P3、P4）。利用凝胶色谱、气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对这4种多糖的分子质量分布与单糖组成进行分析；进一步利用Superdex 200凝胶柱层析对P2进行纯化精制，通过高碘酸钠氧化、Smith降解、红外光谱和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术表征了精多糖P2的一级结构。结果表明：乙醇分级沉淀与Sevag脱蛋白方法的结合能满足蛹虫草菌糠多糖初级纯化的要求，得到了较纯的P2、P3、P4组分，分子质量分别为35.9、9.4、3.7kD；其中P2是由葡萄糖组成的葡聚糖，其主链结构主要为α-（1→4）吡喃葡聚糖。P3和P4是由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的杂多糖，且单糖组成均以葡萄糖为主。

关键词：蛹虫草；菌糠多糖；分离纯化；结构分析

Separation, Purification and Structural Analysis of Polysaccharides from Spent Mushroom Substrate of Cordyceps militaris

ZHANG Ying1, ZENG Yan2, ZHANG Li-jiao2, CUI Shi-mao1, SUN Yuan-xia2,*

(1. Agricultural College, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010010, China;

2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China)

Abstract: Four polysaccharides (P1, P2, P3, and P4) were prepared from the spent mushroom substrate of Cordyceps militaris after the extraction with cellulase, fractional precipitation with ethanol and deproteinization with Sevag regent. Their molecular weight distribution and monosaccharide composition were analyzed by gel chromatography and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The polysaccharide P2 was further purified by Superdex 200 gel-filtration column and its primary structure was studied by sodium periodate oxidation, Smith degradation, infrared spectroscopy as well as nuclear magnetic resonance. The results showed that the fractional precipitation by ethanol in combination with deproteinization by Sevag regent could provide preliminary purification for the polysaccharides, resulting in 3 relatively pure polysaccharides (P2, P3, and P4) with molecular weight of 35.9, 9.4 and 3.7 kD, respectively. The structural analysis demonstrated that P2 was a glucan with a chain mainly comprised of α-(1→4) pyran glucan. Both P3 and P4 were heteropolysaccharides consisting of mannose, galactose and glucose with glucose being the main monosaccharide.

Key words: Cordyceps militaris; polysaccharides from spent mushroom substrate; separation and purification; structural analysis

中图分类号：TQ929.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）13-0054-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413010

食用菌的菌丝残体以及培养料残渣被称为食用菌菌糠，其含有丰富的多糖、氨基酸、微量元素及一些食用菌生长代谢产物。食用菌生产的平均生物转化率约为100%，即每生产100 g食用菌干品需要消耗100 g干培养料。据中国食用菌协会统计2010年全国食用菌总产量为2 200万 t，这也意味着至少有2 200万 t的食用菌菌糠产生。已有研究表明食用菌菌糠多糖也具有抗氧化、抑菌等活性，如杏鲍菇菌糠多糖具有较强的抗氧化活性[1]，香菇菌糠多糖对大肠杆菌有极强的抑菌性[2]。因此从菌糠中提取多糖，不仅可以延伸食用菌种植产业链，增加附加值，还可以减少环境污染，保证食用菌产业的可持续发展，具有显著的经济和生态意义。

近几年蛹虫草作为冬虫夏草的替代品在全国各地得以广泛栽培[3]，一般生产6 g蛹虫草子实体干品需要10 g干料，因此蛹虫草栽培会产生大量菌糠。这些菌糠主要以大米为原料（辅料为含蚕蛹粉的营养液），来源与生产过程洁净可控。蛹虫草多糖作为一种特殊的免疫调节剂，具有降血糖[4]、抗慢性肾衰[5]，抗氧化和增强人体免疫的作用[6]。学者们对蛹虫草子实体、菌丝体及胞外多糖的分离纯化、结构与活性进行了大量研究[7-17]，结果表明蛹虫草多糖的生物活性与其结构有着密切关系，但对蛹虫草菌糠多糖的相关研究却仍有待深入。

本研究以大米为原料[18]（其中各组分质量含量分别为大米82.3%、蚕蛹粉7.7%、蛋白胨3.8%、白糖5.4%、KH2PO4 0.8%）栽培蛹虫草后的菌糠为材料，利用纤维素酶酶解提取蛹虫草菌糠多糖，通过乙醇分级纯化与Sevag脱蛋白环节，获得4 种菌糠多糖，对其结构组成进行分析比较，并对纯化后的精多糖P2进行了一级结构表征。本研究对蛹虫草菌糠多糖结构的解析将为进一步确定多糖构效关系、改性增强多糖生物活性提供参考，同时也为蛹虫草菌糠多糖开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草菌糠 内蒙古园艺研究院；Cellulase ACCF-4740 日本明治制果药业株式会社；标准单糖及葡聚糖标准品 美国Sigma-Aldirch公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200Series高效液相色谱、Agilent 7890A GC/7200 Q-TOF精确质量四极杆飞行时间质谱 美国安捷伦公司；AKTA purifier 100 蛋白纯化仪 美国通用公司；VERTEX70型傅里叶变换红外光谱仪、Bruker AVANCE III 600MHz NMR核磁共振仪 德国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 菌糠多糖酶法提取

蛹虫草菌糠干燥至恒质量，粉粹，过80 目筛，按料液比1∶20（m/V）加入二次水，调节pH值为4，加入1%的纤维素酶（按样品质量计），在45 ℃酶解2 h。然后 95 ℃灭酶15 min，冷却离心（6 000 r/min，15 min），取上清液，浓缩冷冻干燥。

1.3.2 菌糠多糖乙醇分级沉淀法精制

取所得冷冻干燥菌糠多糖，适量溶解。加乙醇至终体积分数为20%，4 ℃冰箱过夜，12 000 r/min离心15 min，收集沉淀，冻干即P1；上清液中继续加乙醇至体积分数为40%，4 ℃冰箱过夜，上述条件离心，收集沉淀冻干即为P2；上清液中再继续加乙醇至体积分数为60%，4 ℃冰箱过夜，离心，收集沉淀冻干为P3；上清液中再继续加乙醇至体积分数为80%，4 ℃冰箱过夜，离心，收集沉淀冻干为P4。

1.3.3 菌糠多糖Sevag法脱蛋白

向分级醇沉多糖的溶液中加入1/5体积的Sevag试剂（V（氯仿）∶V（正丁醇） = 4∶1），剧烈搅拌30 min，7 500 r/min离心10 min后，除去水层和氯仿之间变性的蛋白，重复6 次。采用Lowry[19]检测样品中蛋白质含量。

1.3.4 高效渗透凝胶色谱表征多糖分子质量

凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）分析条件：色谱柱：Agilent PL aquagel-OH MIXED-H（300 mm×7.5 mm，8 µm），柱温30 ℃，洗脱液为超纯水，流速0.8 mL/min，进样量20 µL，色谱采集时间25 min。

葡聚糖标准曲线的绘制：配制2.0 mg/mL的葡聚糖标准品（分子质量分别为5、25、50、80、150、410、670 kD）水溶液，根据上述凝胶色谱分析条件采集各标准品谱图，以标准品分子质量对数lgMr（y） 与出峰保留时间（x）作图，并对曲线进行二次回归拟合，得到葡聚糖标准曲线方程y = －0.971 1x＋14.228（R² = 0.988 4），用于确定被测样品中多糖分子质量分布。

1.3.5 单糖组成分析

气相色谱条件：色谱柱：RTX-225石英毛细血管柱（15 m×250 µm，0.25 µm），载气为He，流速16.2 mL/min，
进样口温度250 ℃，接口温度280 ℃，进样量1 µL，分流比10∶1。

准确称取待测菌糠多糖样品10 mg置于安瓿瓶中，加入5 mL的 4 mol/L三氟乙酸，封管，120 ℃油浴中反应6 h，使用氮气吹干仪去除三氟乙酸；再加入0.5 mL吡啶、10 mg盐酸羟胺和1 mg内标肌醇六乙酸酯，90 ℃加热反应30 min；取出冷却后加入乙酸酐0.5 mL，继续在90 ℃反应30 min进行乙酰化；反应结束后，采用氮气吹干仪去除相关溶液，加入1 mL三氯甲烷溶解过膜，上机分析。

1.3.6 精多糖P2分离纯化及其一级结构测定

1.3.6.1 精多糖P2分离纯化

利用凝胶柱Superdex 200 10/300GL分离纯化粗多糖P2，上样量20 mg，超纯水洗脱，流速0.25 mL/min，收集速率0.25 mL/管，通过硫酸-苯酚法和示差检测器分析监控，获得精多糖P2。

1.3.6.2 高碘酸钠氧化与Smith降解[20]

高碘酸钠氧化：称取25 mg纯化的P2置于25 mL容量瓶中，加入30 mmol/L的高碘酸钠，定容，于4 ℃条件下避光氧化，按一定时间间隔吸取100 μL氧化液，250倍稀释后测定其在223 nm波长处的吸光度，直至恒定，加入乙二醇终止反应。根据标准曲线计算高碘酸钠消耗量；同时移取2 mL的氧化液，以溴甲酚绿为指示剂，用0.01 mol/L的NaOH滴定甲酸生成量。

Smith降解：将上述乙二醇处理后的氧化液透析48 h，减压浓缩，加入100 mg NaBH4暗处放置24 h；用50%的醋酸调节反应液pH值至6～7，透析除去过量的NaBH4，冷冻干燥得到多糖醇产物。采用1.3.5节的方法水解后，进行单糖分析。

1.3.6.3 红外光谱分析

称取充分干燥的精多糖P2样品2 mg与150 mg KBr混合研磨后压片，上机扫描分析，扫描范围400～ 4 000 cm- 1。

1.3.6.4 1H NMR和13C NMR的分析

用D2O溶解适量纯化的P2，通过Bruker AVANCE III 600 MHz NMR测定分析。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草菌糠多糖不同组分的蛋白质含量

表 1 Sevag法脱蛋白前后分级醇沉多糖的蛋白质含量

Table 1 The protein content in the alcohol precipitated polysaccharides before and after the deproteinization with Sevag reagent

由表1可知，随着分级醇沉体系中乙醇体积分数的增加，菌糠多糖组分的蛋白含量也在增加。这与Huang Qilin等[21]分级醇沉冬虫夏草胞外多糖时的蛋白含量变化趋势一致。重复6 次脱蛋白步骤后，Lowry法的检测结果表明P1、P2的游离蛋白基本去除，P3含有少量蛋白，而P4蛋白去除率最差，由于Sevag法不易脱去结合蛋白，推测P3与P4含有结合蛋白。

2.2 蛹虫草菌糠多糖分子质量分布

a. P1；b. P2；c. P3；d. P4。

图 1 蛹虫草菌糠多糖（P1～P4）的凝胶色谱分析图谱

Fig.1 Gel permeation chromatograms of the polysaccharide fractions (P1 through P4)

由图1可知，根据出峰时间与峰形可判断，4 种多糖中，P1分子质量较大，分布较宽。P2、P3、P4的主要成分则比较单一。根据葡聚糖分子质量标准曲线，分别测得其分子质量为35.9、9.4、3.7 kD，呈依次减小的关系。在乙醇分级醇沉中，大分子质量的多糖在低体积分数的乙醇中先被沉淀出来。4 种蛹虫草菌糠多糖的分子质量大小变化与这一原理相吻合。

2.3 蛹虫草菌糠单糖组成

a.单糖标准品；b. P2；c. P3；d. P4；1.鼠李糖；2.岩藻糖；3.阿拉伯糖；4.木糖；5.甘露糖；6.葡萄糖；7.半乳糖；8.肌醇。

图 2 单糖标准品及蛹虫草菌糠多糖（P2～P4）气相色谱

Fig.2 GC chromatograms of monosaccharide standards and the monosaccharide composition of P2, P3 and P4

通过对图2保留时间及质谱碎片峰对比，发现P2仅含葡萄糖；P3和P4则含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖。因此推断P2为葡聚糖；P3和P4是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖，其甘露糖、葡萄糖、半乳糖物质的量比分别为8∶91∶6和1∶18∶1。于荣敏等[22]分离纯化人工蛹虫草菌丝体多糖后，得到1 个葡聚糖和5 个均由葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成的杂多糖。吴凤瑶[6]从蛹虫草子实体多糖中也分离纯化得到了4 个由上述3 种单糖组成的杂多糖。本研究结果显示蛹虫草菌糠的单糖组成成分与报道的蛹虫草子实体多糖组成成分基本一致。

2.4 蛹虫草菌糠多糖P2一级结构的测定结果

2.4.1 高碘酸钠氧化和Smith降解实验

表 2 蛹虫草菌糠多糖P2高碘酸钠氧化和Smith降解结果

Table 2 The results of sodium periodate oxidation and Smith degradation for P2

由表2可知，P2的高碘酸钠氧化有甲酸生成，说明其结构中存在1→6糖苷，但是其消耗高碘酸钠的量远远大于甲酸生成量的2倍，因此糖苷主要以1→2或1→4键型存在。Smith降解产物水解后产生的甘油、赤藓糖醇、甘露糖物质的量比为0.29∶3.66∶0.34。由于产生赤藓糖醇的糖苷键型为1→4，产生甘露糖的为1→3，产生甘油的为1→6或1→2[23]。由此推断P2主链以1→4糖苷为主，含有少量1→2、1→6和1→3糖苷键。

2.4.2 红外光谱分析结果

图 3 蛹虫草菌糠多糖P2红外光谱

Fig.3 FT-IR spectrum of P2

由图3可知，3 325.32 cm-1的峰是－OH的伸缩振动吸收峰，2 931.47 cm-1是C－H的伸缩振动峰，1 652.45 cm-1是－OH的弯曲振动吸收峰，1 155.85、1 080.84、1 021.62 cm-1的吸收峰表示P2的葡萄糖残基为吡喃糖环构型（呋喃型糖环在此区间只有两个强吸收峰）[24]。此外P2在850.82 cm-1处出现吸收峰，而890 cm-1附近无吸收，说明其不含β端基差向异构，为α构型[25-26]。

2.4.3 核磁共振图谱

a. 1H NMR；b. 13C NMR。

图 4 蛹虫草菌糠多糖P2核磁共振图谱

Fig.4 NMR spectrum of P2

由图4a可知，其C1上质子的化学位移为5.32。而C2～C6的质子化学位移集中于4.0～4.8，受D2O的溶剂峰（化学位移4.71）干扰外，信号重叠严重，难以给出准确的结构信息。一般而言，α构型糖苷C1的质子化学位移大于4.95，β构型的则小于4.95，而呋喃糖C1的质子化学位移为5.4左右[27]。因此推断P2糖苷为α-吡喃构型。

13C NMR分析能同时提供多糖糖苷构型与糖苷键连接方式的信息。α构型吡喃糖残基C1的化学位移为90～102，β构型的为102～112[28]。呋喃糖的C3或C5在82～84之间有信号，而吡喃糖的C3或C5化学位移则小于80[29]。由图4b可知，P2除在化学位移99.6出现13C NMR信号外，其余信号的化学位移均小于80， 因此，在红外光谱与1H NMR分析基础上，借助13C NMR可进一步确定P2的葡萄糖残基为α构型吡喃糖。Ranjini等[30]从Curcuma aeruginosa中获得一种α-（1→4）葡聚糖，其非取代的C3、C2、C5、C6化学位移分别为73.2、71.9、71.6、60.5。在P2的13C MNR谱中，其非取代的C3、C2、C5、C6的化学位移分别为73.3、71.5、71.2、60.5，并且信号强度高于其他峰，说明P2的糖苷键以α-（1→4）为主。这与高碘酸钠氧化和Smith降解实验结果是印证的。

3 结 论

蛹虫草菌糠多糖经乙醇分级醇沉和Sevag脱蛋白后得到4种多糖（P1～P4），其中P2、P3、P4分子质量分布较单一。通过GC-MS单糖组成分析表明P2为仅由葡萄糖聚合而成的葡聚糖，P3和P4是由甘露糖、葡萄糖和半乳糖聚合组成的杂多糖。凝胶柱Superdex 200分离纯化P2后，结合高碘酸钠氧化、Smith降解和红外光谱、核磁共振方法对其一级结构进行分析，初步推断P2主链中为α-（1→4）吡喃葡糖，并含有少量的α-（1→2）、
α-（1→6）和α-（1→3）糖苷键。

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