微波处理淀粉自由基的生长和衰减

刘意骁1，范大明1,*，王丽云1，连惠章2，赵建新1，张 灏1，陈 卫1

（1.江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；

2.无锡华顺民生食品有限公司，江苏 无锡 214218）

摘 要：研究在微波加热方式下大米淀粉自由基的生长以及储存过程中的衰减。运用电子顺磁共振的检测手段和图谱拟合软件，对微波处理淀粉的自由基相对数量和结构进行分析。结果表明：微波处理淀粉产生在室温下能够较长时间存在的自由基；淀粉在微波处理后会产生以碳为中心的自由基；在1 600 W（160 W/g）功率下自由基数量的增长速率大于800 W（80 W/g）功率下的增长；在停止微波处理后，自由基信号在衰减之前有一段短时间的增长期；实验从微波处理淀粉中分离出3 种自由基成分，主要成分为以葡萄糖环C1为中心的自由基。

关键词：微波；淀粉；自由基；电子顺磁共振

Growth and Annihilation of Microwave-Induced Free Radicals in Rice Starch

LIU Yi-xiao1, FAN Da-ming1,*, WANG Li-yun1, LIAN Hui-zhang2, ZHAO Jian-xin1, ZHANG Hao1, CHEN Wei1

(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology,

Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Wuxi Huashun Minsheng Food Co. Ltd., Wuxi 214218, China)

Abstract: In this article, the growth of microwave-induced free radicals in rice starch and their annihilation process during storage were investigated. Electron paramagnetic resonance (EPR) and signal simulation software were applied to investigate the relative quantity and structure of microwave-treated starch radicals. The results showed that microwave treatment could induce starch radicals which could exist for a long time at room temperature. The starch radicals were carbon-centered radicals. The growth of radicals was much faster when rice starch was treated at 1 600 W (160 W/g) than at 800 W (80 W/g).
After microwave treatment, the signal intensity started to drop after a short period of increase. Three components were separated from microwave-induced starch radicals in the experiment. The main component was the radical located at the C1 position of the glucose ring.

Key words: microwave; starch; radical; electron paramagnetic resonance (EPR)

中图分类号：TS234 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）13-0114-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413021

微波作为一种新型加热技术，已经普及至日常家用和工业应用的方方面面。由于其操作简便快速，微波在食品加工处理上的应用十分广泛，例如食品解冻、干燥、焙烤、灭酶及杀菌等。淀粉是大部分加工食品的主要成分之一。研究发现，在一定强度的能量场中，淀粉受激发会产生自由基，接受能量的大小和时间长短会影响自由基的生成。例如高温加热[1-4]、X射线[5]、γ射线[6]、紫外辐射[7]等，均能够引发淀粉自由基。众所周知，微波通过电磁场传递能量对受加工的食品产生作用，据以往的研究[8]得知微波照射处理也能引发淀粉中的自由基反应。

自由基反应可能会产生一类半衰期极短的自由基和一类长半衰期的自由基，半衰期短的自由基对生物细胞会造成损伤，导致疾病的发生，而大分子碳水化合物中半衰期长的自由基可以作为自由基捕获物而中和有害的高反应活性的自由基[9-10]。自由基与淀粉化学反应具有一定的关联，例如淀粉热降解导致分子内或分子间脱水造成的自由基反应，会产生呋喃、小分子醛酮物质以及CO2、CO、H2O气体等[11]。因而解读微波处理对淀粉产生自由基的作用和以及自由基在储藏过程中的衰减特性对微波食品的安全性研究具有一定意义，对控制微波食品品质和风味等具有重要影响。

目前已经有不少关于微波淀粉的研究，例如淀粉颗粒性质、流变和溶胀特性[8-9]以及淀粉的热力学和介电物理学特性[10]等。这些证据都表明微波辐射会不可避免地对淀粉颗粒甚至分子结构造成改变。然而，国内外有关微波场中大米淀粉产生自由基的生长及衰减变化的研究还鲜有报道。

本研究主要探究在民用微波频率（2 450 MHz）下，低水分活度大米淀粉的自由基生成规律以及淀粉自由基在室温储存时的衰减变化规律。本实验使用电子顺磁共振仪来检测自由基的种类、组成成分和相对数量；通过软件拟合分析，得到淀粉自由基的分子结构信息，从而推测出淀粉自由基在生长和衰减过程中的成分变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米淀粉 江西金农生物科技有限公司。

K2SO4 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

XO-SM400超声微波组合反应系统 南京先欧仪器制造有限公司；EMX-8/2.7型电子顺磁共振仪 德国Bruker公司；FA-st lab水分活度仪 法国GBX公司。

1.3 方法

1.3.1 大米淀粉水分调节

为调节淀粉的水分活度，将大米淀粉装入敞口烧杯中，置于下方装有K2SO4饱和溶液的带孔陶瓷隔板上密闭平衡2 周。淀粉水分活度采用GBX FA-st lab水分活度仪测定。

1.3.2 微波处理大米淀粉的制备

将大米淀粉2.0 g均匀铺于内径6 mm的敞口玻璃培养皿内，平均厚度为1.5 mm。微波处理时将5个培养皿围圈放置在微波腔体中间，在频率2 450 MHz下，分别用功率1 600 W（160 W/g）和800 W（80 W/g）条件下处理1～5 min。微波结束，将5 个培养皿中淀粉样品混合均匀，立即测定或储存一定时间测定自由基信号。样品的储存条件为室温（20 ℃左右）避光保存。

1.3.3 自由基的顺磁共振测定

准确称取（60.0±0.5）mg样品于内径3 mm的核磁样品管内，样品管置于谐振腔。仪器的微波频率为9.85 GHz，调试频率为100 kHz。图谱在室温20 ℃条件下测定，中心磁场为351 mT，扫场宽度为10 mT，调制幅度（MA）为0.6 T，增益为3.17×105，微波功率设定为20 mW。g值采用比较法测定。将已知g值的标准样品（Bruker公司的Mark，g=1.980 0）与待测样品分别置于谐振腔中，记录图谱，通过与Mark比较得到样品g值。则待测样品的g值可由下式求得。

式中：下标s、x分别表示标准样品和待测样品；β为玻尔磁子。

信号强度大小为电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）谱线一次导数的峰高差。EPR信号模拟使用的是基于Matlab R2013a（The MathWorks，Inc.）平台的EasySpin 4.5.3自由基处理软件[15-18]。软件所得的g值误差为±0.005，超精细常数A误差为±0.1 mT。

2 结果与分析

2.1 微波加热淀粉自由基成分分析

A.原淀粉信号；B.在1 600 W处理5 min后的信号。

图 1 大米淀粉的EPR谱线（Exp）和信号拟合谱线（Sim）

Fig.1 EPR spectrum (Exp) and simulated spectrum (Sim) of rice starch

大米淀粉的EPR图谱不出现明显的信号峰。微波处理后产生的淀粉自由基信号见图1B。将本实验中得到的淀粉自由基图谱与?abanowska等[9-10]得到的热致自由基图谱比较，谱线峰型相似，而通过比较法与顺磁共振仪中所带的标准样品Mark的g值计算得到的样品自由基信号g值是典型的淀粉碳自由基的g值，因此可以判定本研究中微波处理淀粉产生的自由基是碳为中心的自由基，这与Dyrek等[8]采用微波处理马铃薯淀粉及玉米淀粉的实验结果也相符。

图 2 大米淀粉自由基信号主要成分

Fig.2 Main components of rice starch radical signals

从微波处理后大米淀粉的EPR图谱（图1）中可以看出，淀粉中的自由基显然不是单一组分，而是多种成分叠加而成的组合谱。通过信号模拟处理，分析出其中存在的3 种主要成分。由图2可知，信号Ⅰ是葡萄糖环C1位置上的α氢脱去后形成的自由基。位于C2上β氢原子对于C1上的自由电子产生了裂分作用，形成二重峰形态的信号Ⅰ。然而由于裂分常数小，表观上信号Ⅰ仍然呈现一重峰形态。信号Ⅱ表现为具有四重峰形态的超精细结构（hyperfine structure，HFS）谱线，该成分是由葡萄糖环侧链C6位的自由基构成的。C6脱去一个α氢之后形成自由基，由另一个α氢和C5上的β氢分别对C6上的自由电子产生作用，导致HFS结构的产生。信号Ⅲ形成的原因为C2位置上的H原子和C3位置上的OH基团发生分子内脱水，形成的双键使得成分Ⅰ中的电子能够离域到π键上。因此成分Ⅲ的增加一般是伴随着成分Ⅰ的减少[9-10]。

2.2 微波加热时间对淀粉自由基增长的影响

图 3 微波加热时间对淀粉自由基增长的影响

Fig.3 Influence of microwave heating time on the growth of starch radicals

以水分活度0.7的大米淀粉样品分别在微波1 600、800 W功率下处理1～5 min的顺磁共振信号变化情况为例，说明自由基在电磁场中随时间演变的趋势。由图 3可知，在淀粉接受微波辐射1～2 min时，信号几乎无增长，表明淀粉中没有稳定的自由基产生。这有可能是源于体系还未能将电磁能量转化为足够的热能和化学能激发自由基反应，或者是因为体系中的水分将产生的自由基淬灭了。在辐射的起始阶段，考虑到水分的存在，样品具有较大的介电常数，能够有效地将电磁场的能量转换为热量[14]，因而样品迅速升温。微波处理3 min后，该样品的自由基信号中仅存在信号Ⅰ和Ⅱ，分别为87%和13%，证明此时自由基的成分以淀粉分子内葡萄糖环C1位置脱氢产物为主，另外还有一部分为侧链C6位置脱氢产生的自由基。在微波辐射的第2～4分钟，自由基增长迅速，可能是多重因素导致的链式效应。随着温度升高，分子活跃度提高，更容易被热和其他来源的能量所激发。在处理至4 min时，信号中出现了第3种成分，这是由于淀粉分子吸收能量后，葡萄糖环C2上的氢与C3上的羟基发生脱水，形成C＝C键，因而C1上未成对电子不再受到C2上H原子的裂分作用，而分子中氧原子的减少和双键形成使其自由基的g值相对于成分Ⅰ来说降低了。在微波辐射处理的第5分钟，水分活度降至0.05，此时信号Ⅲ的比例显著提高，从2%升至4%，而此时C6自由基的比例降至9%左右，说明C1位置的脱氢速度略大于C6的脱氢速度，并且信号Ⅰ中有一部分向信号Ⅲ转化，暗示了C2～C3之间双键的产生。与此同时，在淀粉基质中已经存在大量的自由基，使自由基电子之间的偶极-偶极相互作用增强，导致部分信号展宽，可能导致在第4～5 分钟时自由基表观增长减缓。

表 1 微波淀粉EPR自由基信号参数的拟合结果

Table1 EPR simulation results of starch radicals after microwave treatment

而对于800 W功率下处理的大米淀粉，在起始阶段的2 min内几乎检测不到自由基的增长。而在2 min之后，自由基的增长趋势大致与1 600 W相似，但是增速明显慢于1 600 W功率下的自由基增速。4 min后在800 W条件下处理的淀粉自由基数量与1 600 W条件下处理的淀粉自由基数量之差趋于恒定。由表1可知，800 W功率处理的自由基其拟合结果几乎差别，其组成成分含量相同，分别为92%的C1自由基和8%的C6自由基。

2.3 储存时间对微波处理淀粉自由基衰减的影响

为了研究微波处理得到的淀粉自由基在储藏过程中的衰减特性，将微波1 600 W和800 W处理5 min后的淀粉样品室温避光保存0～120 d后，分别进行顺磁共振检测。随着储藏时间延长，在淀粉基质中大量存在的自由基之间的偶极-偶极相互作用逐渐减弱，使得原先未被检测到的自由基信号出现，表现为在最初的1 d内，自由基的信号强度逐渐增大，由于本身1 600 W处理后的淀粉中自由基含量明显多于800 W处理后的淀粉，因此这种自由基延迟增长的效应在1 600 W处理后的淀粉中表现得更为显著（图4）。而在第1～5天后，自由基增长趋势消失并开始缓慢衰减，1 600 W条件下处理的自由基数量在3 周内降至与微波处理结束时的数量；800 W条件下处理的自由基数量则在9 d左右时降至与微波处理结束时的数量。在第16周时测定的1 600 W处理样品储存后的自由基含量仍然大于800 W处理后样品自由基最大值。

b. 1 600 W；c. 800 W。

图 4 储存时间对微波处理淀粉自由基的影响

Fig.4 Influence of storage time on microwave-treated starch radicals

进一步对衰减过程中自由基组成的分析发现，1600 W处理后的大米淀粉在保存过程中成分Ⅲ在5 d内逐渐减少至消失。这与微波处理过程中成分Ⅲ的生成过程正好相反。推测这种现象产生的原因是，在储存过程中，原本葡萄糖分子内部脱水形成的C2＝C3键逐渐吸收了环境中的水分，双键被还原，成分Ⅲ逐渐转化为成分Ⅰ
的自由基形式。说明含有双键的自由基成分在储存时较不稳定，而葡萄糖环的C1自由基以及侧链的C6自由基相对较稳定。800 W处理后的大米淀粉无论在自由基增长阶段还是衰减阶段，其组成成分均没有大的变化，依然是以成分Ⅰ为主，占到自由基总量的90%以上，同时含有部分侧链的自由基成分Ⅱ。

3 结 论

本研究通过对微波处理大米淀粉的自由基检测研究，验证了微波处理淀粉能产生长时间存在室温下存在的稳定自由基。确定了大米淀粉自由基是以碳为中心的自由基。大米淀粉自由基的3 种组成成分结构。得出了不同微波功率下自由基数量随着时间逐渐增长至差值稳定的趋势。通过储存实验发现，淀粉基质中自由基的偶极-偶极作用减弱会导致在储存前期信号有增长，储存中后期信号减弱，自由基成分有变化。在本实验中讨论的自由基均为半衰期相对较长的稳定自由基，未涉及短半衰期的自由基。因其性质活泼，在数秒内即被反应淬灭，所以很难检测到。在今后的研究中，本课题组可以探索合适的捕集手段，将活性自由基半衰期延长进而检测其数量及成分，对于完善微波处理淀粉产生自由基的生长和衰减的研究具有重要意义。

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