苦荞纳豆酱的抗氧化活性

赵晓娟1，吴 均1，陈佳昕1，杜木英1,2,3,*，阚建全1,2,3

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715；

3.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（重庆），重庆 400715）

摘 要：为研究苦荞纳豆酱总黄酮和总酚的体外抗氧化活性，测定DPPH自由基清除率、ABTS+•清除率、•OH清除率、O2－•清除率和Fe3+还原能力，并且与黄豆酱、甜面酱进行抗氧化活性比较研究。结果表明：苦荞纳豆酱的DPPH自由基清除率、ABTS＋•清除率、•OH清除率、O2－•清除率均高于黄豆酱和甜面酱；Fe3+还原能力略低于甜面酱。被测样品的抗氧化活性与总黄酮、总酚的含量有显著相关性（P＜0.01）。

关键词：苦荞纳豆酱；总黄酮；总酚；抗氧化活性

Antioxidant Activity of Tartary Buckwheat Natto

ZHAO Xiao-juan1, WU Jun1, CHEN Jia-xin1, DU Mu-ying1,2,3,*, KAN Jian-quan1,2,3

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Special Food Programs and Technology Research Center, Chongqing 400715, China; 3. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

Abstract: This study aimed to explore the in vitro antioxidant activities of total flavonoids and total polyphenols from tartary buckwheat natto, made from mixtures of soybeans and tartary buckwheat fermented with Bacillus subtilis natto. The scavenging rates against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH), 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid) ammonium salt (ABTS), hydroxyl and superoxide anion free radicals, and reducing power were investigated and compared with those of yellow soybean paste and sweet soybean paste. The results showed that tartary buckwheat natto exhibited the highest scavenging activities on DPPH, ABTS, hydroryl and superoxide anion free radicals despite having slightly weaker Fe3+ reducing activity than sweet soybean paste. Our results also showed a highly significant correlation between antioxidant capacity and either total flavonoids or total polyphenols (P ＜ 0.01) for all three investigated samples.

Key words: tartary buckwheat natto; total flavonoids; total polyphenols; antioxidant activity

中图分类号：TS264.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）13-0122-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413023

豆酱（soybean paste）是我国传统发酵豆制品之一，它是以大豆为主要原料，经过浸泡、蒸煮后由微生物发酵而成的半流动状态的调味品，也称黄豆酱、黄酱或大豆酱。豆酱不仅酱香浓郁、色泽鲜艳、口感鲜美、风味独特，是优良的蛋白质来源，而且还含有许多的抗氧化活性成分，主要有黄酮类化合物、酚类化合物等[1]。研究证明，酱油[2]、木耳[3]、绿豆[4]、杨梅[5]、苹果[6]、荔枝[7]等物质中的黄酮类、酚类化合物均有较好的抗氧化活性。本实验测定了苦荞纳豆酱中的总黄酮、总酚的含量，研究了体外抗氧化能力，并且和黄豆酱、甜面酱进行了对比，同时分析了总黄酮、总酚含量与抗氧化能力之间的相关性，以期为苦荞纳豆酱的开发和深加工提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦荞纳豆酱 西南大学食品科学学院实验室自制；黄豆酱（海天黄豆酱） 佛山市海天调味品食品股份有限公司；南泉甜面酱 重庆黄花园酿造调味品有限责任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ，DPPH）、2,2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid) ammonium salt，ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris（2-pyridyl）-S-triazine，TPTZ） 美国Sigma公司；芦丁、没食子酸 中国药品生物制品检定所；福林-酚 北京索莱宝科技有限公司；浓盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸钠、过硫酸钾、冰乙酸、醋酸钠、氯化铁、硫酸亚铁、邻二氮菲、双氧水、Tris、邻苯三酚均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

台式高速离心机 德国艾本德公司；HHS型数显恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司；WH-2微型漩涡混合仪 上海沪西分析仪器厂；UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 苦荞纳豆酱发酵工艺流程

称取筛选后的黄豆，按照黄豆∶水为1∶3（m/V）加水浸泡18 h，然后蒸煮30 min，苦荞粉与水质量比为1∶1拌合后蒸煮5 min，与蒸煮过的黄豆混合（黄豆∶苦荞质量比为8∶2），冷却后接种纳豆芽孢杆菌4%，混合均匀后35 ℃恒温制曲80 h，成曲有纳豆特有香味，且有很长的拉丝现象。用冷却至室温的盐水（12 g/100 mL盐水）按曲料与盐水比为1∶1.5拌曲，进行45 ℃恒温发酵，每天搅拌一次，至酱呈深褐色，带有浓郁酱香即可。将样品搅拌均匀后，取适量放入研钵中，迅速研磨至无颗粒，进行产品测定。

1.3.2 样液的制备[8]

准确称取（5.000±0.005）g冻干样品，加入50 mL体积分数为50%的乙醇，均质后在室温下振荡提取2 h，于3 000 r/min条件下离心20 min，取上清液重新离心，4 000 r/min条件下离心20 min，上清液即为样品提取液，4 ℃保存备用。

1.3.3 总黄酮的提取

准确称取冻干样品（2±0.005） g，置于50 mL圆底烧瓶中，加入50 mL 70%乙醇，于80℃水浴回流1 h，冷却后过滤，并用提取液洗涤滤渣，合并滤液，定容至50 mL。

1.3.4 总酚的提取

准确称取冻干样品（2±0.005）g，置于50 mL圆底烧瓶中，加入50 mL 60%乙醇，于60 ℃水浴回流2 h，冷却后过滤，并用提取液洗涤滤渣，合并滤液，定容至50 mL。

1.3.5 总黄酮含量的测定[9]

1.3.5.1 芦丁标准曲线的绘制

准确称取在105 ℃烘至恒重的芦丁20 mg，用60%乙醇溶解稀释至100 mL。分别吸取0、1、2、3、4、5 mL芦丁标液，加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，放置6 min，加5%的硝酸铝溶液0.3 mL，放置6 min，加4%的氢氧化钠溶液2 mL，混匀后，用30%乙醇溶液补充体积至10 mL，放置15 min后于510 nm波长处测吸光度。以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制芦丁标准曲线，得到线性回归方程：y=5.306 0x+0.003 1（R2=0.999 7）。

1.3.5.2 样液测定

取0.2 mL样液于10 mL比色管中，加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，放置6 min，加5%的硝酸铝溶液0.3 mL，放置6 min，加4%的氢氧化钠溶液2 mL，混匀后，用30%乙醇溶液补充体积至10 mL，放置15 min后于510 nm波长处测吸光度，对照组不加硝酸铝溶液。

1.3.6 总酚含量的测定[10]

1.3.6.1 没食子酸标准曲线的绘制

准确称取0.5 mg没食子酸，用蒸馏水溶解后定容至100 mL容量瓶中，分别吸取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL没食子酸溶液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，分别吸取1 mL于10 mL比色管中，向各管中加入0.5 mL福林酚，充分混合后于45 ℃反应15 min，在765 nm波长处测吸光度。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制没食子酸标准曲线，得到线性回归方程：y=11.940 0x＋0.008 2（R2=0.999 5）。

1.3.6.2 样液测定

实验组加样液0.05 mL、去离子水4.8 mL，空白组为5.0 mL水，向各管中加入0.5 mL福林酚，充分混合后于45 ℃反应15 min，在765 nm波长处测吸光度，福林-酚试剂可以与被测样品中的酚类物质反应生成蓝色化合物，颜色越深，酚类物质含量越高，得到总酚含量[11]。

1.3.7 抗氧化活性的测定

1.3.7.1 DPPH自由基清除率的测定[12]

DPPH自由基溶于乙醇，在517 nm波长处有最大吸光度，是一种稳定的自由基。当DPPH自由基遇到能够提供质子的抗氧化性物质时，接受被测样品提供的电子后，形成稳定的分子，导致其在517 nm波长处的吸光度减小，溶液颜色减退，由紫色变为黄色。根据反应液吸光度的大小可以判断被测样品抗氧化能力的强弱，吸光度越小，则表明被测样品的抗氧化能力越强[13]。

将DPPH自由基溶解于无水乙醇中，使DPPH自由基最终浓度在0.2 mmol/L，同时制备不同浓度梯度的提取液（乙醇稀释），将0.1 mL样品溶液添加到3.9 mL DPPH溶液中，混合均匀后暗处避光30 min，混合液于517 nm波长处测定吸光度A1，用无水乙醇作参比。同时测定0.1 mL无水乙醇与3.9 mL DPPH溶液混合后的吸光度A2，以及0.1 mL样品溶液与3.9 mL无水乙醇混合后的吸光度A3，按式（1）计算清除率。

（1）

1.3.7.2 ABTS+•清除率的测定

将一定浓度的ABTS溶液与过硫酸钾溶液混合均匀，避光反应12～16 h，ABTS经过氧化后生成稳定的阳离子自由基，并呈现出蓝绿色。抗氧化物质与ABTS+•混合反应后，使该体系颜色变浅，并且吸光度降低。根据反应液吸光度的大小可以判断被测样品抗氧化能力的强弱，吸光度越小，则表明被测样品的抗氧化能力越强[14]。

将等量的7 mmol/L ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾水溶液混合，避光放置12～16 h。用无水乙醇将该溶液稀释至其在波长为734 nm波长处吸光度为0.7±0.02，得到ABTS工作液，稀释液当天使用。同时制备不同浓度梯度的提取液（乙醇稀释），将0.15 mL样品溶液添加到2.85 mL ABTS工作液中，混合均匀后避光反应10 min，混合液于734 nm波长处测定吸光度，以无水乙醇为参比。同时测定0.15 mL无水乙醇与2.85 mL DPPH自由基溶液混合后的吸光度A2，以及0.15 mL样品溶液与2.85 mL无水乙醇混合后的吸光度A3，按式（2）计算ABTS+•清除率。

（2）

1.3.7.3 Fe3+还原能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）的测定[15]

FRAP值的测定也是用来评价物质抗氧化能力的常用方法之一。Fe3+-TPTZ可被样品中的还原性物质还原为Fe2+的形式，呈现出蓝色，并在593 nm波长处有最大光吸收。可以根据吸光度的大小计算出样品的FRAP值，从而判断比较样品抗氧化能力的强弱，吸光度越大，FRAP值越大，被测样品的抗氧化能力也就越强[16]。

将300 mmol/L醋酸钠缓冲溶液（pH3.6）、10 mmol/L
TPTZ盐酸溶液（盐酸浓度40 mmol/L）、20 mmol/L FeCl3溶液按照体积比10∶1∶1混合现配制得FRAP工作液。

取0.1 mL不同浓度（0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mmol/L）FeSO4溶液加入到2.9 mL FRAP工作液中，混合均匀后置于37 ℃恒温水浴10 min，于593 nm波长处测定吸光度，以去离子水为参比。以吸光度为纵坐标，FeSO4溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=0.739 9x+0.006 9（R2=0.999 5）。

制备不同浓度梯度的提取液，取0.1 mL不同浓度样品溶液加入到2.9 mL FRAP工作液中，混合均匀后置于37 ℃恒温水浴10 min，于593 nm波长处测定吸光度，以去离子水为参比。样品抗氧化能力以Fe2+当量表示（mmol Fe2+/100 g冻干粉）。

1.3.7.4 •OH清除能力的测定[17]

被测样品提取物对•OH清除能力的测定，主要是利用反应体系中的H2O2与Fe2+反应产生•OH，然后在该体系中加入邻二氮菲产生有色物质，该物质在510nm波长处有最大吸收。

分别向10 mL比色管中加入0.05 mol/L pH7.4的磷酸缓冲溶液1 mL，6 mmol/L的邻二氮菲溶液0.5 mL，充分混合后，加入6 mmol/L的FeSO4溶液0.5 mL，加入后立即混匀，然后向其中加入0.5 mL的样品溶液，充分混匀后加入0.1% H2O2溶液0.5 mL启动反应，最后补充体积为10 mL，于37 ℃恒温水浴1 h，于536 nm波长处测定吸光度A1。同时用等体积的去离子水代替样品溶液重复上述步骤，测定吸光度A，用等体积的去离子水代替样品溶液及H2O2溶液，测定吸光度A0，按式（3）计算•OH清除率。

（3）

1.3.7.5 O2－•清除率的测定[18]

在反应体系中，邻苯三酚自身的氧化速度较快，在加入样品提取液后，由于样品溶液可以提供氢，阻断了自由基的反应，从而抑制邻苯三酚自身氧化产生O2－•[19]。

分别向10 mL比色管中加入2 mL pH8.0的Tris-HCl缓冲液（150 mmol/L）再加入1.2 mmol/L的邻苯三酚溶液（10 mmol/L盐酸溶液配制）1 mL，最后加入0.5 mL不同浓度样品，充分混合后于室温反应30 min，于325 nm波长处测定吸光度A1，同时测定等体积的去离子水代替样品溶液的吸光度A2，以及去离子水代替邻苯三酚溶液的吸光度A3，按式（4）计算O2－•清除率。

（4）

1.3.8 总黄酮、总酚含量与抗氧化能力之间相关性

根据不同样品中的总黄酮和总酚含量，将样品抗氧化能力测定时冻干粉质量浓度换算为总黄酮和总酚含量，结合不同冻干粉质量浓度时的抗氧化能力，分析得到各抗氧化变量之间的相关性。通过研究3 种样品中不同总黄酮含量、总酚含量与抗氧化结果之间及不同抗氧化能力之间的相关性、显著性，对样品总黄酮含量、总酚含量以及抗氧化能力之间的关系进行分析。

1.4 数据处理

所有测定指标的数据平行测定3 次后取平均值，应用Excel和SPSS17.0软件进行数据处理，应用Origin8.6软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 总黄酮和总酚的含量

由表1可知，苦荞纳豆酱的总黄酮含量最高，其次是黄豆酱，甜面酱的总黄酮含量最低。这可能是由于苦荞纳豆酱与黄豆酱都是以黄豆为主要原料，黄豆本身含有较高的大豆异黄酮，使二者的总黄酮含量均在2.50 mg/g冻干粉以上；而甜面酱的总酚含量最高，达到13.02 mg/g冻干粉，苦荞纳豆酱次之，黄豆酱的最低。

表 1 冻干粉样品中总黄酮和总酚含量

Table 1 Contents of total flavonoids and total polyphenols in
three samples

2.2 DPPH自由基清除率的测定

图 1 冻干粉样品对DPPH自由基的清除作用

Fig.1 Scavenging activities on DPPH free radicals of three samples

由图1可知，苦荞纳豆酱、黄豆酱和甜面酱都具有一定的DPPH自由基清除能力，说明3 种被测样品中都含有能够与DPPH自由基发生反应的物质。此外，黄豆酱、苦荞纳豆酱和甜面酱3 种被测样品对DPPH自由基的清除能力均随着底物质量浓度的增加而上升，且苦荞纳豆酱对DPPH自由基的清除能力要明显好于黄豆酱和甜面酱，黄豆酱和甜面酱对DPPH自由基的清除能力基本一致。当底物质量浓度在10～40 mg/mL之间变化时，自由基清除率与底物质量浓度之间呈现良好的线性关系。

2.3 ABTS＋•清除率的测定

图 2 各样品对ABTS＋•的清除作用

Fig.2 Scavenging activities on ABTS free radicals of three samples

由图2可知，苦荞纳豆酱、黄豆酱和甜面酱都具有一定的ABTS＋•清除能力，说明3 种被测样品中均含有抗氧化物质。此外，黄豆酱、苦荞纳豆酱和甜面酱3 种被测样品对ABTS＋•的清除能力均随着底物质量浓度的增加而不断上升，且苦荞纳豆酱对ABTS＋•的清除能力要明显高于黄豆酱和甜面酱，黄豆酱和甜面酱对ABTS＋•清除能力基本一致。当底物质量浓度在4～10 mg/mL之间变化时，自由基清除率与底物质量浓度之间呈现良好的线性关系。

2.4 Fe3+还原能力的测定

图 3 冻干粉样品对Fe3+的还原能力

Fig.3 Fe3+ reducing power of three samples

由图3可知，苦荞纳豆酱、黄豆酱和甜面酱对Fe3+都具有一定的还原能力，说明3 种被测样品中都含有一定的还原性物质。黄豆酱、苦荞纳豆酱和甜面酱3 种被测样品对DPPH自由基的清除能力均随着底物质量浓度的增加而上升，且甜面酱对Fe3+的还原能力略高于苦荞纳豆酱，黄豆酱Fe3+的还原能力最低。当底物质量浓度在10～30 mg/mL之间变化时，自由基清除率与底物质量浓度之间呈现良好的线性关系。

2.5 •OH清除率的测定

图 4 冻干粉样品对•OH的清除作用

Fig.4 Scavenging activities on hydroxyl free radicals of three samples

由图4可知，苦荞纳豆酱、黄豆酱和甜面酱对•OH都具有一定的清除作用。黄豆酱、苦荞纳豆酱和甜面酱3 种被测样品对•OH的清除能力均随着底物质量浓度的增加而上升，苦荞纳豆酱和甜面酱对•OH的清除能力均高于黄豆酱。当底物质量浓度小于60 mg/mL时，甜面酱对•OH的清除能力高于黄苦荞纳豆酱，当底物质量浓度大于60 mg/mL时，甜面酱对•OH的清除能力小于黄苦荞纳豆酱，且当底物质量浓度在40～100 mg/mL之间变化时，自由基清除率与底物质量浓度之间呈现良好的线性关系。

2.6 O2－•清除率的测定

由图5可知，苦荞纳豆酱、黄豆酱和甜面酱对O2－•都具有一定的清除作用。黄豆酱、苦荞纳豆酱和甜面酱3 种被测样品对O2－•的清除能力均随着底物质量浓度的增加而上升，苦荞纳豆酱对O2－•的清除能力高于黄豆酱和甜面酱，且当底物质量浓度在20～80 mg/mL之间变化时，O2－•清除率与底物质量浓度之间呈现良好的线性关系。

图 5 冻干粉样品对O2－•的清除作用

Fig.5 Scavenging activities on superoxide anion free
radicals of three samples

2.7 总黄酮含量、总酚含量与抗氧化能力之间的关系

表 2 不同样品抗氧化能力与总黄酮及总酚含量的相关系数

Table 2 Correlation coefficients between antioxidant activities and either total flavonoids or total polyphenols contents

注：**.差异极显著（P＜0.01）。

由表2可知，样品中的总黄酮、总酚含量与其对DPPH自由基、ABTS＋•、•OH、O2－•的清除能力，对Fe3+的还原能力呈极显著相关（P＜0.01），说明黄酮类物质、酚类物质对其抗氧化能力有显著影响，同时各抗氧化能力之间也存在显著的相关性。

3 结 论

本实验测定了苦荞纳豆酱、黄豆酱和甜面酱中的总黄酮和总酚含量，并且比较了3种样品对DPPH自由基、ABTS＋•、•OH、O2－•的清除能力和对Fe3+的还原能力。实验证明了总黄酮和总酚具有较强的抗氧化能力，并且随着被测样液质量浓度的增加，其抗氧化能力也在不断增强，表现出了良好的量效关系。同时，在一定质量浓度条件下，苦荞纳豆酱除了对Fe3+的还原能力低于甜面酱外，对自由基的清除能力均优于黄豆酱和甜面酱。

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