枯草芽孢杆菌高产中性蛋白酶发酵条件的优化

刘 颖，张彬彬，孙冰玉，刘琳琳，邹丽宏，石彦国*

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）

摘 要：通过单因素试验和正交试验对枯草芽孢杆菌10075菌株发酵产中性蛋白酶的培养基组分及培养条件进行优化，达到提高菌株中性蛋白酶产量的目的。结果表明，发酵培养基的最佳组分：添加麦芽糖8.0%、蛋白胨4.0%、MgSO4 0.08%；最适发酵条件为发酵温度37 ℃、初始pH 7.0、发酵时间42 h，酶活力由最初的98.36 U/mL 提高到353.45 U/mL。

关键词：枯草芽孢杆菌；中性蛋白酶活力；发酵；优化

Optimization of Fermentation Conditions for Production of Neutral Protease by Bacillus subtilis 10075

LIU Ying, ZHANG Bin-bin, SUN Bing-yu, LIU Lin-lin, ZOU Li-hong, SHI Yan-guo*

(Key Laboratory for Food Science and Engineering of Heilongjiang Province, College of Food Engineering,
Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Abstract: The medium components and culture conditions for Bacillus subtilis 10075 were optimized by single-factor and orthogonal array design methods to increase the production of neutral protease. The results showed that the optimized medium consisted of 8.0% maltose, 4.0% peptone and 0.08% MgSO4, and the optimized culture conditions were 37 ℃, 7.0 and 42 h for temperature, initial pH and time, respectively. The activity of neutral protease after optimization was increased from 98.36 to 353.45 U/mL.

Key words: Bacillus subtilis; neutral protease activity; fermentation; optimization

中图分类号：Q939.97；TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）13-0166-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413032

中性蛋白酶是最早发现并应用于生产的工业酶制剂，现已广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面[1-9]，在医药和食品工业中尤为突出。但中性蛋白酶的产量低、成本高等因素限制其大规模生产[10-11]。因此，对该酶类生产技术的研究受到广泛关注。微生物蛋白酶，主要由霉菌[12-14]、细菌，其次由酵母、放线菌生产。枯草芽孢杆菌是美国食品药物管理局公布的安全菌种[15]，是当今工业酶的主要生产菌种之一，是工业生产上应用最广泛的菌种之一。目前，由枯草芽孢杆菌生产的酶制剂占整个酶制剂市场的50%，主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶[16-17]。枯草芽孢杆菌酶主要应用领域是食品工业，全世界的食品工业用酶量约占生产总量的60%，在我国则高达85%以上[18]。

本实验以中性蛋白酶活力为主要的考察指标，对枯草芽孢杆菌10075的产蛋白酶情况进行研究，以碳源、氮源和无机盐种类，碳、氮源添加量、培养基初始pH值、发酵温度、发酵时间为考察条件，通过单因素试验和正交试验，确定菌株产中性蛋白酶的最优发酵培养基和培养条件。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

枯草芽孢杆菌10075 工业菌种保藏中心。

种子培养基：氯化钠5.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L，pH7.2，121 ℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min；基础发酵培养基：葡萄糖2.0 g/100 mL、牛肉粉2.0 g/100 mL，pH7.2，121 ℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min。

干酪素、营养琼脂、蛋白胨、牛肉粉、酵母浸粉 北京双旋微生物培养基制品厂；氯化钠、氯化钙（分析纯） 西陇化工股份有限公司；福林酚试剂 美国Amresco公司。

1.2 仪器与设备

单人洁净工作台 北京东联哈尔滨仪器制造有限公司；722型分光光度计 上海仪分科学仪器有限公司；雷磁PHS-3C型pH计 南京互川电子有限公司；XFS-280手提式压力蒸汽灭菌锅 浙江新丰医疗器械有限公司；DKZ电热恒温振荡水槽、电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；80-2离心机 上海浦东光学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢杆菌初始发酵条件

将活化好的斜面菌株接种在种子培养基中（100 mL/250 mL），30 ℃、200 r/min振荡培养24 h，使孢子浓度达到108 个/mL，菌悬液以2.0%的接种量接入发酵培养基（100 mL/250 mL），30 ℃、pH7.0、150 r/min培养48 h，以中性蛋白酶酶活力作为评价指标。

1.3.2 中性蛋白酶酶活力测定

按照国家标准GB/T23527—2009《蛋白酶制剂》，采用Folin-酚法测定中性蛋白酶活力[19]。

1.3.3 中性蛋白酶发酵培养基优化

采用单因素试验，分别考察碳源种类及其添加量、氮源种类及其添加量和无机盐对产中性蛋白酶的影响。

1.3.3.1 碳源种类的影响

以2.0%的葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉为碳源，2.0%牛肉粉为氮源进行发酵，确定发酵培养基最佳碳源。

1.3.3.2 氮源种类的影响

以2.0%麦芽糖为碳源，以2.0%的牛肉粉、蛋白胨、酵母浸粉、大豆粉、NH4Cl为氮源进行发酵，确定发酵培养基最佳氮源。

1.3.3.3 碳源添加量对菌种产中性蛋白酶的影响

以2.0%蛋白胨为氮源，以不同麦芽糖添加量2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%进行发酵，确定发酵培养基最优碳源添加量。

1.3.3.4 氮源添加量对菌种产中性蛋白酶的影响

以8.0%麦芽糖为碳源，以不同蛋白胨添加量2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%进行发酵，确定发酵培养基最优氮源添加量。

1.3.3.5 无机盐对菌种产中性蛋白酶的影响

以8.0%麦芽糖和8.0%蛋白胨为碳氮源，并添加0.04%的KH2PO4、CaCl2、MgSO4、NaCl、FeSO4进行发酵，确定培养基最优无机盐。

1.3.4 枯草芽孢杆菌发酵培养基正交优化试验

在单因素试验基础上，确定碳源、氮源、无机盐这3 个因素对菌株10075产蛋白酶活力具有显著性影响（P＜0.05），选取L9（34）正交表进行优化试验，以中性蛋白酶酶活力为评价指标，进行枯草芽孢杆菌发酵培养基组分的优化。

1.3.5 菌株10075产中性蛋白酶培养条件优化

利用优化后的培养基，采用单因素试验对培养条件进行优化，分别考察时间、温度、初始pH值对产中性蛋白酶的影响。

2 结果与分析

2.1 碳源种类对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的影响

图 1 碳源种类对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的影响

Fig.1 Effect of carbon source on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

由图1可知，菌株10075在麦芽糖（P＜0.05）作为碳源时酶活力最高，为155.05 U/mL，乳糖次之，菌株10075对这两种碳源的利用效果较好，这可能与菌体蛋白酶系的合成有关。而葡萄糖作为碳源时，菌株酶活力最低为98.36 U/mL，可能是葡萄糖对产酶有阻遏或诱导作用。结果说明二糖比单糖更能促进菌体产酶，因而选择麦芽糖作为碳源。

2.2 氮源种类对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的影响

图 2 氮源种类对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的影响

Fig.2 Effect of nitrogen source on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

在微生物的代谢过程中，氮源主要被转化为核酸、氨基酸以及构成细胞壁的成分，并且是微生物生长的主要营养。由图2可知，蛋白胨（P＜0.05）作为氮源时菌株10075的酶活力最高，为165.05 U/mL。当选用NH4Cl作为无机氮源时，菌株不产酶，说明NH4Cl不利于产生中性蛋白酶。

2.3 麦芽糖添加量对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的影响

碳源是细菌发酵中所需最多的营养物质，麦芽糖添加量直接影响菌种的产酶情况。由图3可知，当麦芽糖添加量为培养基总质量的2.0%～8.0%时，菌株10075的蛋白酶活力显著上升（P＜0.05），达到8.0%时对麦芽糖的利用效果最好，产生的酶活力最高，达到195.06 U/mL，随着麦芽糖添加量的降低，酶活力有较显著下降。

图 3 麦芽糖添加量对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的影响

Fig.3 Effect of maltose concentration on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

2.4 蛋白胨添加量对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的影响

图 4 蛋白胨添加量对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的影响

Fig.4 Effect of peptone concentration on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

酶本身是蛋白质，而氮元素是构成蛋白质的主要元素，因此氮源添加量对于产酶有重要作用。实验测定了不同添加量的蛋白胨对菌株产酶的影响，由图4可知，当蛋白胨添加量为培养基总质量的2.0%～8.0%时，菌株10075的蛋白酶活力显著上升（P＜0.05），当蛋白胨添加量为8.0 %时，菌株对氮源的利用效果达到最好，达到243.41 U/mL。而当蛋白胨添加量高于8.0%时，由于添加量过高，会导致溶液变得黏稠，使底物流动性下降，不利于菌株生长及产酶。当蛋白胨的添加量由4.0%增大到8.0%时，会导致生产成本大幅度提高，而蛋白酶活力由218.40 U/mL提到到243.41 U/mL，仅提高了1.1%，综合考虑实验结果和生产成本问题，最终选定蛋白胨添加量为4.0%。

2.5 无机盐对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶活力的影响

由图5可知，NaCl对菌株10075产酶略有促进作用
（P＜0.05），Na+能使细胞膜内外渗透压改变，膜通透能力增加，而微生物原蛋白水解酶均为胞外酶，膜内外渗透压的改变有利于酶向膜外运输，并且NaCl可能对目的菌株具有一定的激活作用，因而产酶效果较好；Mg2+是许多酶的辅助因子，并且参与微生物细胞壁的形成，产酶效果最好，对产酶具有重要作用[20]。二者均对菌株10075产酶均有促进作用，但MgSO4的效果更好（P＜0.05），这时酶活力达到231.74 U/mL，而CaCl2、FeSO4、KH2PO4对产酶有不同程度的抑制作用。

图 5 无机盐对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的影响

Fig.5 Effect of inorganic salts on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

2.6 正交试验确定对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶最佳发酵培养基

在单因素试验基础上，菌株10075选取对中性蛋白酶活力影响显著（P＜0.05）的麦芽糖、蛋白胨、MgSO4为考察对象，选用L9（34）分别进行正交试验，采用SPSS17.0进行分析，结果见表1、2。

表 1 菌株10075培养基优化正交试验结果

Table 1 Orthogonal array design and results for the optimization of medium components for Bacillus subtilis 10075

表 2 枯草芽孢杆菌10075培养基优化正交试验结果方差分析

Table 2 Analysis of variance for the optimization of medium components for Bacillus subtilis 10075

菌株10075正交试验极差分析结果由表1可知，对蛋白酶活力影响大小为：麦芽糖＞蛋白胨＞MgSO4，优化的最优产酶条件为A2B2C3，即麦芽糖8.0%、蛋白胨4.0%、MgSO4 0.08%，在此条件下测得蛋白酶活力为238.40 U/mL，正交表中方案6的条件产酶最高，为231.74 U/mL，因此选取A2B2C3为最优结果，既节省成本又能达到理想的效果。由表2方差分析可知，对蛋白酶活力影响大小为：麦芽糖＞蛋白胨＞MgSO4，麦芽糖和蛋白胨均对中性蛋白酶活力有显著影响，而MgSO4没有显著影响。

2.7 发酵温度对菌株产中性蛋白酶的影响

图 6 发酵温度对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的影响

Fig.6 Effect of temperature on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

由图6可知，发酵温度在26～37 ℃时，菌株产酶活力呈逐步升高的趋势（P＜0.05），而当培养温度在37～40 ℃范围产酶活力下降，由于温度过高会导致部分酶蛋白变性失活，化学反应速率和代谢减弱，代谢产物减少，最初大量繁殖的细菌会分解代谢产生热量，使底物浓度更高，促进细菌衰老[21]。菌株10075在37 ℃时达到最适温度，此时酶活力达到238.40 U/mL。温度不仅影响各种酶的反应速率和蛋白质性质，还会影响发酵液的物理性质。温度升高使反应速率和生长代谢加快，提高微生物代谢物产量，但会导致菌体衰老，并缩短了发酵周期，使产酶量减少。

2.8 发酵时间对菌株产中性蛋白酶的影响

图 7 发酵时间对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的影响

Fig.7 Effect of fermentation time on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

发酵时间影响影响菌体的生长情况和蛋白酶产量。由图7可知，在发酵24 h内，发酵液中产酶量很低，培养时间在24～42 h时，菌株蛋白酶的活力在逐渐的上升
（P＜0.05），而当培养时间在42 h时，蛋白酶的活力达到最大值。在之后的延长培养时间，蛋白酶的活力有明显的（P＜0.05）下降趋势，因为在发酵后阶段，底物不断消耗的同时，微生物也在逐渐衰亡，导致产酶下降。最佳培养时间确定为42 h，此时菌株10075酶活力达到353.45 U/mL。

2.9 初始pH值对菌株产中性蛋白酶的影响

图 8 初始pH值对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的影响

Fig.8 Effect of initial medium pH on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

由于发酵过程中的pH值很难准确控制，所以选择控制发酵液的初始pH值。由图8可知，菌株的初始pH值在7.0～8.0范围内产酶效果较好（P＜0.05），pH 7.0时，菌种10075酶活力最高，为353.45 U/mL。说明中性培养基有利于菌株产酶；酸性培养基不利于菌株产酶。pH值通过影响菌体营养物质离子化程度、细胞膜电荷及膜渗透性，影响菌体对养分的吸收。对于大多数菌种来说，一般具保持其体内的细胞质酸度在近中性条件下的能力，利于新陈代谢和各种酶反应，底物的pH值对细胞的新陈代谢和产酶有间接的影响，在不同的初始pH值条件下菌株的生长繁殖能力和产中性蛋白酶的能力存在着一定的差异。

3 结 论

通过优化培养基条件：碳源种类及添加量、氮源种类及添加量和无机盐种类的单因素试验，进一步进行正交试验，确定菌株10075最优培养基为麦芽糖8.0%、蛋白胨4.0%、MgSO4 0.08%，培养条件优化结果为pH7.0、发酵时间42 h、发酵温度37 ℃，通过对发酵条件的优化，酶活力由98.36 U/mL 提高到353.45 U/mL。

本实验确定了产中性蛋白酶发酵培养基的最佳无机盐种类，但是对无机盐添加量的多少并没有进行单因素试验，会对结果产生一定影响。并且一些表面活性剂也可能会促进产酶，有待于进一步实验。芽孢杆菌能够分泌多种酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等[22]，产生酶系的种类与产酶量密切相关，因此实验菌株要应用于工业生产，应对其产生的多种酶进行系统的检测，明确相互之间的影响，并对生产成本与产品品质进行辨证考虑，才能最终确定最佳的工业发酵条件。利用枯草芽孢杆菌菌株发酵生产蛋白酶，具有发酵周期短、产酶量高、安全性好等优点，同时，枯草芽孢杆菌菌株对紫外线敏感，可利用紫外诱变进行菌种选育，能够进一步提高其酶的产量[23-24]。

参考文献：

[1] SCHALLMEY M, SINGH A, WARD O P. Developments in the use of Bacillus species for industrial production[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2004, 50: 1-17.

[2] DEMAIN A L, ADRIO J L. Contributions of microorganisms to industrial biology[J]. Molecular Bioteehnology, 2008, 38(1): 41-55.

[3] 牛春华, 高岩, 李玉秋, 等. 紫外诱变选育高产蛋白酶枯草芽孢杆菌[J]. 中国酿造, 2011, 30(12): 67-69.

[4] 王和玉, 杨帆, 林琳, 等. 地衣芽孢杆菌固态发酵代谢产物分析[J]. 酿酒科技, 2011(9): 32-34.

[5] 杨帆, 林琳, 王和玉, 等. 茅台大曲中3株芽孢杆菌代谢产物的比对分析[J]. 酿酒科技, 2011(8): 42-43.

[6] 豆康宁, 董彬, 王银满. 大豆蛋白活性肽的生物功能与应用前景[J]. 粮食加工, 2007, 32(2): 52-54.

[7] 武波波, 李文献, 王少武, 等. 微胶囊化中性蛋白酶的技术研究[J]. 中国乳品工业, 2009, 37(8): 27-30.

[8] 肖怀秋, 林亲录, 李玉珍, 等. 中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4产酶条件及部分酶学性质[J]. 食品与生物技术学报, 2005, 24(4): 42-46; 56.

[9] 李明阳. 复合菌种发酵海鲜鱼露工艺条件探讨究[D]. 西安: 西北大学, 2012.

[10] 孙晓鸣, 王萍, 邬向东. 产中性蛋白酶芽孢杆菌配伍发酵响应面法研究[J]. 中国食品学报, 2010, 10(2): 117-124.

[11] 黄璠, 蔡俊. 枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的发酵条件优化[J]. 饲料工业, 2012, 33(2): 49-51.

[12] TREMACOLDI C R, WATANABE N K, CARMONA E C. Production of extracellular acid proteases by Aspergillus clavatus[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2004, 20(6): 639-642.

[13] KUMAR S, SHARMA N S, SAHARAN M R, et al. Extracellular acid protease from Rhizopus oryzae: purification and characterization[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(5): 1701-1705.

[14] FERNANDEZ-LAHORE H M, AUDAY R M, FRAILE E R, et al. Purification and characterization of an acid proteinase from mesophilic Mucor sp. solid-state cultures[J]. The Journal of Peptide Research, 1999, 53(6): 599-605.

[15] 闫亚婷. 固态发酵玉米条件的优化及营养物质变化的比较研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2010.

[16] 陈晓明, 张良, 张建国, 等. 枯草芽孢杆菌淀粉酶高产菌株的辐射诱变研究[J]. 辐射研究与辐射工艺学报, 2008, 26(3): 177-182.

[17] 马明, 杜金华. 枯草芽孢杆菌酶在工业生产中的应用[J]. 山东科学, 2006, 19(3): 35-38.

[18] 何国庆. 食品发酵与酿造工艺学[M]. 2版. 北京: 中国农业出版社, 2011: 51-59.

[19] 中华人民共和国国家技术监管局. GB/T23527—2009蛋白酶制剂[S]. 北京: 中国标准出版社, 2009.

[20] PRESCOT M L, HARLEY P J, KLEIN A D. Microbiology[M]. New York: McGraw-Hill Companies Inc., 2002: 96-121.

[21] 张慧涛, 侯新强. 高温中性蛋白酶发酵过程中温度控制的改进[J]. 食品与发酵工业, 2002, 28(6): 80-82.

[22] 袁小平, 王静, 姚惠源. 枯草芽孢杆菌内切木聚糖酶的纯化与性质研究[J] . 食品与发酵工业, 2004, 30(8): 55-59.

[23] 施巧琴, 吴松刚. 工业微生物育种学[M]. 3版. 北京: 科学出版社, 2009.

[24] 张敏, 赵丛, 路福平, 等. 产中性蛋白酶菌株发酵条件的研究[J]. 食品研究与开发, 2007, 28(12): 44-48.