木犀草素通过蛋白激酶C途径抑制肥胖相关的巨噬细胞极化

张 磊1，鲍 斌1,2，刘 健1,*

（1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.合肥丰乐种业股份有限公司，安徽 合肥 230031）

摘 要：目的：木犀草素（luteolin，LU）是富含于多种植物源食品中的天然黄酮类化合物，实验旨在探讨其对肥胖相关的巨噬细胞极化的影响及机制。方法：将5 周龄雄性小鼠分为3 组分别给予低脂饮食（low-fat diet，LFD）、高脂饮食（high-fat diet，HFD）和添加0.01%木犀草素的高脂饮食（HFD＋0.01% LU），喂养12 周后利用免疫组织化学染色检测附睾脂肪组织中巨噬细胞，并利用实时定量荧光聚合酶链式反应分别检测促炎性M1巨噬细胞和抗炎性M2巨噬细胞的标记基因表达情况；体外实验研究木犀草素对脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导的巨噬细胞系RAW264.7极化的影响，利用蛋白激酶C激活剂佛波酯进行干预后，检测促炎性细胞因子、M1和M2标记基因的mRNA表达情况。结果：木犀草素降低了高脂饮食诱导的脂肪组织巨噬细胞聚集和M1型巨噬细胞标记基因CD11c与Nos2 mRNA的表达；体外木犀草素也抑制了LPS诱导巨噬细胞炎性因子和M1型巨噬细胞标记基因的表达，上调M2型巨噬细胞标记基因的表达，且这些作用依赖于蛋白激酶C途径。结论：木犀草素能够抑制肥胖相关的巨噬细胞极化，并且通过蛋白激酶C途径抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎性因子的表达与极化。

关键词：木犀草素；肥胖；巨噬细胞；蛋白激酶C

Luteolin Inhibits Obesity-Associated Adipose Tissue Macrophage Polarization through Protein Kinase C (PKC) Pathway

ZHANG Lei1, BAO Bin1,2, LIU Jian1,*

(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China;

2. Hefei Fengle Seed Co. Ltd., Hefei 230031, China)

Abstract: Objective: Luteolin is a natural flavonoid abundant in many edible plants. The aim of this study is to explore the effect of luteolin (LU) on obesity-associated adipose tissue macrophage (ATM) polarization and its underlying mechanisms. Methods: Five-week-old C57BL/6 mice were fed with low-fat diet (LFD), high-fat diet (HFD), or HFD with 0.0l% luteolin (HFD＋0.0l% LU) for 12 weeks, respectively. Macrophage infiltration and polarization were detected by immunohistochemical staining or real-time PCR in epididymal adipose tissue. The in vitro effect of luteolin on RAW264.7 macrophage inflammation and polarization in lipopolysaccharide (LPS) and/or PMA-stimulated conditions was also explored. The expression levels of proinflammatory cytokines and M1/M2 marker genes were detected by real-time PCR. Results: Dietary luteolin reduced HFD-induced ATM infiltration and mRNA levels of M1 macrophage marker genes. In LPS-stimulated conditions, luteolin inhibited the expression of proinflammatory cytokines and M1 marker genes in RAW264.7 macrophages. In contrast, the expression of M2 marker genes was enhanced by luteolin. However, these effects of luteolin were aborted by protein kinase C (PKC) activator phorbol myristate acetate (PMA). Conclusion: Luteolin can inhibit obesity-associated ATM and RAW264.7 macrophage polarization in LPS stimulated-conditions through protein kinase C pathway.

Key words: luteolin; obesity; macrophage; protein kinase C

中图分类号：R151.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）13-0186-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413036

随着经济的迅速发展，人们的生活水平不断提高，饮食结构不合理及运动缺乏，导致肥胖快速成为一个威胁人类健康的重要问题。肥胖过程中，随着脂肪组织不断扩张，促炎性细胞（如M1型巨噬细胞）大量聚集[1]，分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、单核细胞趋化因子1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP1）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等促炎性细胞因子[2]，而抗炎性的细胞（M2型巨噬细胞）大量减少。脂肪组织炎性细胞及炎性因子变化，使脂肪组织呈现炎性，继而使机体出现系统性的慢性低等炎性[3]，从而诱发一系列相关代谢疾病，如2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和心血管疾病等[4-6]。因而，肥胖及其相关代谢疾病严重影响了人们的生活质量，而一些食品源的天然化合物具有潜在的减肥降糖作用，需阐明其作用机制，以期更好用于肥胖的预防和治疗。

木犀草素（luteolin，LU）又叫四羟黄酮，是一种常见的天然黄酮类化合物，广泛存在于胡萝卜、绿茶、辣椒、芹菜、花菜、黄瓜、紫苏叶、柠檬、白萝卜、石榴等植物源食品中[7-8]。木犀草素具有多种生物活性，包括抗炎、抗过敏、抗肥胖、抗糖尿病、抗氧化/促氧化、抗癌、诱导凋亡等[7,9-10]。低剂量饮食补充木犀草素可以通过稳定肥大细胞，抑制相关的血管生成作用，从而改善高脂饮食诱导小鼠的肥胖和胰岛素抵抗。饮食补充木犀草素也降低了脂肪组织中巨噬细胞及促炎性细胞因子TNF-α、MCP1和IL-6的mRNA的水平[11]。但木犀草素是否影响高脂饮食诱导的脂肪组织巨噬细胞极化尚不清楚。

本研究考察了高脂饮食小鼠通过饮食补充木犀草素12 周后，脂肪组织中巨噬细胞M1/M2分型变化；并体外探讨了木犀草素影响巨噬细胞极化的机制，以揭示木犀草素对巨噬细胞极化中的作用及机制，为利用这一食品源的天然化合物用于肥胖预防和治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料与试剂

SPF级C57BL/6雄性4 周龄小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

木犀草素（HPLC检测得其纯度＞98%） 上海华壹生物科技有限公司；Trizol 试剂盒 日本TaKaRa公司；逆转录试剂盒 美国Invitrogen公司；实时定量荧光聚合酶链式反应试剂（SYBR Green MIX） 美国Bio-Rad公司；Mac2抗体 美国BioLegend公司；DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美国Gibco公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA） 美国Sigma公司；无水乙醇等常规生化试剂 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

IQ5荧光定量PCR仪 美国Bio-Rad公司；TKY-TSH组织脱水机、YB-6LF石蜡包埋机 湖北孝感亚光医用电子技术有限公司；RM2235组织切片机 德国Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠饲养

小鼠于SPF级动物房中饲养，温度维持于25 ℃，12 h/12 h光暗周期下，自由摄取食物和水。5 周龄时，参照此前关于木犀草素减肥降糖的相关研究结果[11]，将这些动物随机分为3 组，每组8 只，即给予低脂饮食（low-fat diet，LFD，research diets D12450B，10%能量源于脂肪）的正常对照组、给予高脂饮食（high-fat diet，HFD，research diets D12451，45%能量源于脂肪）的肥胖模型组和给予添加质量分数为0.01% LU高脂饮食（HFD＋
0.01% LU）的处理组。喂养12 周后处死，收取附睾脂肪组织立即冻于－80 ℃。

1.3.2 免疫组织化学

组织收取后，用体积分数为4%的中性甲醛固定24 h，常规脱水石蜡包埋及切片；切片脱蜡复水，0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）微波修复，5 min；3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，10 min；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗3×5 min；2%羊血清37 ℃条件下封闭2 h；Mac2抗体（1∶800），4 ℃孵育过夜；PBS洗3×5 min；HRP-IgG（羊抗大鼠，1∶1000），室温反应2 h；PBS洗3×5 min；二氨基联苯胺显色，流水冲洗，风干，二甲苯透明中性树胶封片；镜检拍照；使用Image-Pro Plus Version 6.0软件计算Mac2染色的巨噬细胞阳性面积[12]。

1.3.3 细胞培养

RAW264.7细胞培养于DMEM＋10% FBS，将消化后的细胞接入48 孔板中，贴壁后用20 μmol/L木犀草素处理，对照组加入等体积的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），24 h后用100 ng/mL的LPS或LPS和100 mol/L蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活剂PMA刺激3 h[13]，用PBS洗两遍，收集细胞，提取总RNA。

1.3.4 组织总RNA提取、逆转录及实时定量荧光聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction， real-time PCR）

组织或细胞，用Trizol试剂提取总RNA。取2 μg总RNA，按照Invitrogen逆转录试剂说明书合成cDNA第一链。然后，利用SYBR Green MIX进行Real-time PCR，GAPDH用作内参基因，利用ΔΔCt法分析基因表达[12]。具体引物序列如表1所示。

表 1 Real-time PCR引物序列

Table 1 Primer sequences of real-time PCR

1.4 统计分析

实验结果表示为

±s。采用Origin 9统计软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），进一步两两比较采用最小显著性差异法，
P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 木犀草素可以降低饮食诱导的肥胖小鼠体质量增加和脂肪组织巨噬细胞聚集

高脂饮食中添加0.01%的木犀草素可以显著减少小鼠体质量的增加（图1A）。饮食诱导的肥胖会导致巨噬细胞在脂肪组织中的大量浸润，并形成冠状区域。通过Mac2抗体免疫组织化学染色（图1B），Mac2阳性面积明显减少（图1C）。结果表明，木犀草素饮食补充不仅具有显著的抗肥胖作用，而且显著降低了附睾脂肪组织中巨噬细胞的募集，与之前的报道相一致[11]。

B

a1

a2

b1

b2

c1

c2

A.小鼠体质量；B. Mac2阳性的巨噬细胞，a. LFD组，b.HFD组，c.HFD＋0.01% LU组，小脚标1、2表示分别放大100、400倍；C. Mac2阳性面积定量；*.与HFD组相比，差异显著（P＜0.05）。

图 1 木犀草素减少饮食诱导小鼠体质量的增加和
脂肪组织中巨噬细胞聚集

Fig.1 Luteolin reduced HFD-fed mice body weight gain and macrophage infiltration in adipose tissue

2.2 木犀草素降低饮食诱导小鼠脂肪组织中巨噬细胞的极化

在饮食诱导肥胖产生过程中，脂肪细胞的增殖和体积增大使脂肪组织不断扩张，募集大量的巨噬细胞浸润，使M1/M2型巨噬细胞的比例不断提高，引起脂肪组织慢性低度炎性的发生。通过Real-time PCR检测脂肪组织中巨噬细胞分型标记基因mRNA表达，发现木犀草素降低高脂饮食诱导小鼠脂肪组织中M1型巨噬细胞标记基因CD11c和Nos2 mRNA表达（图2a、2b）；没有改变M2型巨噬细胞标记基因Mgl2和Chi3l3 mRNA表达（图2c、2d）。M1型巨噬细胞的减少，降低了高脂饮食引起的M1/M2型巨噬细胞的比例，改善了脂肪组织中的炎性。

a、b. RAW264.7 M1型巨噬细胞标记基因mRNA表达；c、d. RAW264.7 M2型巨噬细胞标记基因mRNA表达；*.与HFD组相比，差异显著（P＜0.05）。

图 2 木犀草素降低脂肪组织中巨噬细胞的极化

Fig.2 Luteolin depressed macrophage polarization in adipose tissue of HFD-fed mice

2.3 木犀草素抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的极化

为了进一步验证木犀草素对巨噬细胞极化的影响，体外利用LPS可以诱导巨噬细胞系RAW264.7向M1型巨噬细胞极化[13-14]。RAW264.7经LPS刺激后，炎性因子TNF-α和MCP1 mRNA的表达显著升高；M1型巨噬细胞标记基因CD11c和Nos2 mRNA表达显著升高；而M2型巨噬细胞标记基因Mgl2和Chi3l3 mRNA表达显著下降。而添加木犀草素，则可以显著改善LPS刺激引起的上述改变，与单独LPS刺激相比，TNF-α和MCP1的表达显著降低（图3a、3b），CD11c和Nos2 mRNA表达显著降低（图3c、3d），Mgl2和Chi3l3 mRNA表达显著升高（图3e、3f）。木犀草素可以显著改善LPS刺激后RAW264.7巨噬细胞的极化及炎性。

a、b. RAW264.7巨噬细胞炎性因子mRNA表达；c、d. RAW264.7 M1型巨噬细胞标记基因mRNA表达；e、f. RAW264.7 M2型巨噬细胞标记基因mRNA表达；*.与LPS处理组相比，差异显著（P＜0.05）。

图 3 在体外木犀草素抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的极化

Fig.3 Luteolin suppressed RAW264.7 macrophage polarization in vitro

2.4 木犀草素抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的极化依赖于蛋白激酶C途径

木犀草素抑制了LPS引起的巨噬细胞极化及炎性，但是木犀草素通过何条信号途径发挥作用仍不清楚。蛋白激酶C是一种Ca2+和磷脂依赖性激酶，通过催化多种靶蛋白发生磷酸化反应，完成细胞对外源性信号的应答[15]，参与了LPS通过TLR4介导NF-κB的激活转录炎性因子的表达[14]。因此，利用RAW264.7巨噬细胞系，研究了木犀草素发挥作用是否依赖了蛋白激酶C途径。添加蛋白激酶C的激活剂（PMA），让TLR4的下游处于持续激活状态，然后加入木犀草素观察其对LPS诱导的RAW264.7的极化及炎性的影响。由图4可知，PMA可以阻断木犀草素的作用。加入PMA后，木犀草素不再能够降低LPS刺激下炎性因子TNF-α、MCP1（图4a、4b）和M1型巨噬细胞标记基因CD11c、Nos2的mRNA表达（图4c、4d）；木犀草素也不再能够升高LPS刺激下M2型巨噬细胞标记基因Mgl2和Chi3l3 mRNA表达（图4e、4f）。

a、b. RAW264.7巨噬细胞炎性因子mRNA表达；c、d. RAW264.7 M1型巨噬细胞标记基因mRNA表达；e、f. RAW264.7 M2型巨噬细胞标记基因mRNA表达；*.与LU处理组相比，差异显著（P＜0.05）。

图 4 木犀草素抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的极化
依赖蛋白激酶C途径

Fig.4 Suppression of luteolin on RAW264.7 macrophage polarization through PKC pathway

3 讨 论

木犀草素，作为一种广泛存在于各种植物源食品中的天然黄酮化合物，具有多种生物活性，是潜在具备减肥降糖作用的天然化合物[16]。已有研究报道，木犀草素可以通过稳定肥大细胞抑制血管的生成，改善高脂饮食诱导肥胖及胰岛素抵抗[11,17]。木犀草素还可以直接作用于巨噬细胞，降低促炎性细胞因子的表达[9,18]。但是，木犀草素对巨噬细胞的极化的影响尚不清晰。本研究通过在饮食中添加木犀草素，降低了高脂饮食喂养小鼠体质量的增加和脂肪组织巨噬细胞的浸润。同时，木犀草素也抑制了高脂饮食诱导的脂肪组织巨噬细胞M1极化；M2型巨噬细胞的数量没有改变，引起M1/M2比例的降低，最终改善了高脂饮食诱导的脂肪组织慢性炎性。在肥胖相关的慢性低度炎性发展过程中，脂肪组织中巨噬细胞的浸润与极化是产生炎性的重要原因[3]，所以降低脂肪组织中巨噬细胞的浸润与极化，可以改善肥胖相关代谢疾病的产生。

为进一步查明木犀草素影响巨噬细胞极化的作用机制，本研究考察了，在LPS刺激下，木犀草素处理对巨噬细胞系RAW264.7向M1型巨噬细胞极化及炎性变化的影响。结果显示，木犀草素处理可以显著降低LPS诱导的RAW264.7炎性因子和M1型巨噬细胞标记基因表达，升高M2型巨噬细胞标记基因表达，改变了M1/M2的比例，降低了细胞的炎性。鉴于蛋白激酶C在LPS诱导的巨噬细胞炎性与极化调控中起重要作用[19-20]，本研究进一步研究了木犀草素对这一信号途径的影响。结果显示，添加蛋白激酶C激活剂PMA，可以阻断木犀草素对LPS诱导巨噬细胞促炎性细胞因子表达和极化的影响，说明木犀草素的改变巨噬细胞极化依赖于蛋白激酶C途径，但具体的作用机制有待进一步研究。这些结果说明，木犀草素在体外可以抑制LPS诱导的巨噬细胞的极化与促炎性因子表达，在体内可以抑制高脂饮食所导致的脂肪组织炎性的产生。此前的研究已报道[17]，稳定肥大细胞可以抑制巨噬细胞的脂肪组织浸润与极化。但是，本实验所发现的上述对巨噬细胞炎性和极化的抑制作用是否是由于木犀草素的肥大细胞稳定特性，仍有待进一步的研究证明。上述机制的阐明，为食品源木犀草素的减肥降糖作用增添了新的证据，为推广富含木犀草素的的植物源食品，改善高热量饮食所导致的肥胖及其相关代谢综合症奠定了理论基础。

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