酪蛋白糖巨肽对二甲肼干预的大鼠细胞因子
网络变化的研究

陈庆森1,王金凤2,阎亚丽1,庞广昌1

(1.天津市食品生物技术重点实验室,天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津 300134;

2.北京时合生物科技有限公司,北京 100176)

 

摘 要:目的:探讨不同剂量酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide,CGMP)干预二甲肼处理的大鼠时,外周血和结肠组织内细胞因子水平的变化情况,从而推断CGMP对二甲肼处理的大鼠细胞因子网络的影响。方法:
60只Wistar雄性大鼠随机分为正常组、模型组、CGMP低剂量组、CGMP中剂量组和CGMP高剂量组。除正常组外,对每只大鼠每周腹腔注射二甲肼,剂量为30 mg/(kg•周),同时,3 个剂量CGMP组注射二甲肼的同时每天灌胃CGMP,剂量分别为10、50、100 mg/(kg•d)。15周后,处死大鼠,取其结肠组织和血清,首先检测结肠末端异型隐窝灶个数,然后利用液相芯片法检测结肠组织和血清中的细胞因子的表达水平。结果:乳源CGMP对大鼠体质量影响没有显著性差异,乳源CGMP对大鼠内毒素和活性氧簇的水平具有显著的抑制作用,其抑制作用呈剂量依赖趋势。乳源CGMP可显著抑制异型隐窝灶的形成,且异型隐窝灶个数呈剂量依赖性降低。乳源CGMP可以显著抑制大鼠体内Th1/Th2类细胞因子的失衡,且呈剂量依赖趋势。结论:乳源CGMP具有改善二甲肼处理的大鼠结肠组织损伤的功能,其机制为乳源CGMP可以有效抑制二甲肼处理的大鼠体内异型隐窝灶的形成,并呈剂量依赖性,研究显示乳源CGMP可以下调大鼠体内IL-4等Th2类细胞因子的异常升高,促进IL-2等Th1类细胞因子的分泌,改善大鼠体内处于失衡状态的细胞因子网络。

关键词:乳源酪蛋白糖巨肽;细胞因子网络;异型隐窝灶

 

Effects of Casein Glycomacropeptide on Dimethyl Hydrazine-Induced Alteration of Cytokine Network in Rats

 

CHEN Qing-sen1, WANG Jin-feng2, YAN Ya-li1, PANG Guang-chang1

(1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China; 2. Beijing Shihe Biological Technology Co. Ltd., Beijing 100176, China)

 

Abstract: Purpose: In order to infer the influence of casein glycomacropeptide (CGMP) on the cytokine network in rats treated with dimethyl hydrazine, we studied the changes in cytokines in peripheral blood and colon of rats challenged with intraperitoneal injection of dimethyl hydrazine, followed by intragastric administration of different doses of CGMP. Methods: A total of 60 Wistar rats were randomly divided into five groups: normal, model, low dose CGMP, moderate dose CGMP and high dose CGMP groups. The rats from all other groups except for the normal group were injected weekly with dimethyl hydrazine at 30 mg/kg bw. At the same time, the rats in the low-, moderate- and high dose-CGMP groups were orally administered daily with CGMP at 10, 50 and 100 mg/(kg•d), respectively. Fifteen weeks later, the rats were killed and colon and serum samples were taken. The number of colon aberrant crypt foci was counted, and the levels of cytokines in colon and peripheral blood were detected by using the Luminex assay. Results: 1) no significant difference in body weight in rats among CGMP-treated and control groups was seen whereas CGMP significantly reduced the levels of endotoxin and reactive oxygen species in a dose-dependent manner; 2) CGMP significantly inhibited the formation of aberrant crypt foci (ACF) in a dose-dependent manner; 3) CGMP significantly inhibited imbalance of Th1/Th2 cytokines in rats treated with dimethyl hydrazine in a dose-dependent manner. Conclusions: CGMP could improve colon damage in rats treated with dimethyl hydrazine by effectively inhibiting the formation of ACF in a dose-dependent manner, downregulating the levels of Th2 cytokines such as IL-4, and promoting the secretion of Th1 cytokines such as IL-2 to improve the imbalance of the cytokine network.

Key words: casein glycomacropeptide (CGMP); cytokine network; aberrant crypt foci(ACF)

中图分类号:TS252.1 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)13-0192-07

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413037

乳源酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide,CGMP)是Delfour等[1]于1965年发现的一种含有唾液酸的糖肽,是牛乳中κ-酪蛋白经凝乳酶水解后产生的多肽片段。乳源CGMP是κ-酪蛋白第106位氨基酸(Met)至169位(Val)共64 个残基构成的高度糖基化、并且有磷酸化修饰的多肽。它具有多种生物学活性,如抑制细菌和病毒的附着、抑制胃肠道分泌物、结合霍乱毒素和大肠杆菌毒素[2]、促进双歧杆菌增殖[3]、抑制流感病毒红细胞凝集素[4]等。

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界上第三大肿瘤,在美国,其癌症相关死亡率在恶性肿瘤中位居第3位。在我国,近几年的CRC在恶性肿瘤发病和死亡构成中分别占10.56%和7.80%,居第3位和第5位。CRC的发生在临床上是一个漫长的过程,其发生发展和转移是一个多因素参与多阶段发展的复杂过程,是多种因素长期作用的结果,其发病原因尚未完全清楚,主要包括遗传因素和环境因素两大类。研究[5]发现结直肠癌的发病与免疫、炎症的关系密切,但机制不明。

细胞因子是免疫细胞产生的一大类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。T细胞主要分泌IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TGF-β及血管内皮长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等[6-8],具有促进T细胞分化、成熟和增殖,激活细胞毒性T细胞、巨噬细胞,吞噬杀伤靶细胞,清除胞内病原体,介导细胞免疫应答作用,使机体识别和杀伤肿瘤抗原的能力,是机体免疫监视的主要炎性因子。

依据分泌细胞因子的不同,辅助性T淋巴细胞(Th)主要分为两类,Th1和Th2由共同的前体细胞Th0分化而来,Th0在IL-12作用下可分化为Th1,在IL-4作用下可分化为Th2。在抗原存在的情况下,人体内IL-12、IFN-γ最初由巨噬细胞、NK细胞分泌。Th1细胞以分泌IFN-γ和IL-2为主,可以增强杀伤细胞的细胞毒性作用,激发迟发型超敏反应,主要介导细胞免疫反应;Th2细胞分泌IL-4、IL-10等,促进抗体的产生,主要介导体液免疫反应。正常机体Th1/Th2类细胞因子处于平衡状态。机体的抗肿瘤免疫以细胞免疫为主,当Th1/Th2平衡失调,由Th1向Th2漂移时会造成免疫抑制状态,使肿瘤细胞能够逃逸免疫系统的攻击而继续生长[9]。研究发现胃肠癌患者与对照组相比,其IL-2/IL-4比值降低,表明胃肠癌患者体内细胞免疫为Th1向Th2漂移状态[10]。

生物活性肽作为一种生物制剂,可以提高机体的特异性和非特异性免疫功能,从而达到抗肿瘤的目的。目前,作为肿瘤治疗的重要辅助手段——生物免疫治疗法,已经越来越受到生物研究领域的重视。而本实验室多年研究发现,酪蛋白糖巨肽作为一种食源性短肽,对结肠炎和结肠癌都具有一定的改善作用[11]。

本研究进一步明确乳源CGMP的生物学功能,在确定最佳剂量乳源CGMP能有效改善大鼠结肠损伤情况的前提下,以结直肠癌大鼠为模型,采用液相芯片法作为技术手段,进一步探讨乳源CGMP在细胞因子水平上对大鼠结肠损伤改善的情况,为乳源CGMP作为改善结直肠癌的功能性食品提供更完善的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雄性Wistar大鼠,体质量在80~100 g,合格证号:0017037,购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide,CGMP) 新西兰Tatua公司;二甲肼(1,2-dimethylhydrazine,DMH) 日本东京化成株式会社;Milliplex大鼠细胞因子检测试剂盒 美国Merck Millipore公司;内毒素、活性氧簇检测试剂盒 美国IBL-America公司;亚甲基蓝 美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及结直肠癌大鼠模型的建立

SPF级纯种Wistar雄性大鼠60 只,质量80~100 g。在动物房适应性喂养1 周后,随机分为5 组:正常组、模型组、CGMP低剂量组、CGMP中剂量组和CGMP高剂量组,每组12 只。所有动物在整个实验期间均饮用纯净水,定期更换垫料以保持清洁与干燥。实验室温度控制在(23±2)℃,空气相对湿度为(60±10)%,室内照明以自然采光为主,环境较安静。

实验第1周,除正常组外,其余各组大鼠腹腔注射DMH,剂量为30 mg/(kg•周)(注射剂量经预实验摸索而定)。实验第2周始,选择边造模边干预的方法进行研究,即在给Wistar大鼠腹腔注射DMH的同时给予灌胃CGMP进行干预。实验组各组大鼠腹腔注射DMH的同时,CGMP低、中、高剂量组每天灌胃相应剂量的CGMP,剂量分别为10、50、100 mg/(kg•d),正常组不作处理。实验期间,连续灌胃至15 周,期间每周记录大鼠体质量,根据体质量调整灌胃和注射的量,15 周后处死大鼠采集样品。

1.2.2 样本采集与处理

1.2.2.1 血清采集

15 周后,大鼠眼眶静脉采血,于4 ℃、2 000 r/min冷冻离心10 min后,取上清液,置于-20 ℃冰箱冻存。

1.2.2.2 结肠组织处理

处死大鼠,解剖取结肠,置于10%中性福尔马林固定液中进行固定。

1.2.2.3 组织提取液制备

处死大鼠,解剖取结肠,准确称取0.1 g后,置于组织匀浆器中,加入磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution,PBS),研磨后得到10%的匀浆组织液,于4 ℃、5 000 r/min冷冻离心20 min后,取上清液,置于
-20 ℃冰箱冻存。

1.2.3 大鼠的异型隐窝灶(aberrant crypt foci,ACF)计数

处死大鼠后,分别在盲肠、结肠交界和骨盆处剪开取出全结肠,纵向剖开后漂洗去除肠内容物,将肠段尽可能平展于两层滤纸之间,在10%中性甲醛中固定24 h;固定后的标本于0.2%亚甲基蓝溶液中染色,40~60 s后转移到玻片上,40 倍光学显微镜下计数ACF个数。

1.2.4 大鼠CGMP干预后的病理分析

结肠组织石蜡切片制作,参见文献[12]。

1.2.5 氧化应激分析和内毒素分析

按试剂盒说明书测定各组血清中活性氧簇和内毒素的水平。

1.2.6 细胞因子的检测

采用液相芯片法检测CGMP干预后大鼠结肠组织及外周血中8 种细胞因子的变化,见表1。

表 1 8 种细胞因子

Table 1 List of cytokines tested in this study

细胞因子

种类

IFN-γ

Th1类细胞因子

TNF-α

Th1类细胞因子

IL-2

Th1类细胞因子

IL-12p70

Th1类细胞因子

IL-4

Th2类细胞因子

IL-5

Th2类细胞因子

IL-6

Th2类细胞因子

IL-10

Th2类细胞因子

 

 

96 孔板设置背景孔、标准品孔、对照孔和样品孔,背景孔和样品孔中加入测定缓冲液25 μL,标准品孔和对照孔中加入相应试剂25 μL,背景孔、标准品孔和对照孔中加入25 μL基质溶液,样品孔中加入样品25 μL。涡旋后,每孔加入25 μL混合的珠子,室温下振荡孵育2 h。清洗后,加入25 μL检测抗体,室温下振荡孵育1 h。每孔加入25 μL链霉亲和素-藻红蛋白。室温下振荡孵育30 min,清洗后加入125 μL鞘液,振荡30 min后读板。

1.3 统计学分析

使用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析处理,进行单因素方差分析,处理结果以

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±s表示,定义P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 CGMP对大鼠一般状态及体质量变化的影响

表 2 CGMP对大鼠体质量变化的影响

Table 2 Effect of CGMP on body weight change in rats

%

组别

第2周

第4周

第6周

第8周

第10周

第12周

第14周

正常组

29.45±2.53

82.11±6.89

121.95±10.51

148.88±15.22

168.66±16.42

182.22±19.19

192.56±18.61

模型组

28.78±3.58

83.66±9.46

120.66±15.02

149.60±19.17

166.19±21.56

177.69±20.54

180.22±24.18

CGMP低剂量组

31.15±1.75

80.96±5.98

120.55±10.65

145.06±13.75

162.95±16.21

173.32±15.49

176.25±15.35

CGMP中剂量组

30.78±4.00

80.44±11.35

119.62±19.81

147.31±25.93

165.27±30.63

178.95±32.93

180.97±37.46

CGMP高剂量组

28.94±2.66

73.96±9.97

111.09±14.47

136.25±19.36

150.85±23.59

162.23±24.93

166.14±24.29

 

注:表中数据为各周体质量与第1周体质量相比的变化率。

 

由表2可知,各组大鼠体质量均有增长趋势,经SPSS方差分析,每周实验大鼠体质量组与组之间的差异不显著(P>0.05),即正常组与模型组体质量之间没有显著性差异,各剂量组与正常组及模型组相比体质量之间也不具有显著性意义。即CGMP对大鼠体质量影响没有显著性差异。

2.2 CGMP对大鼠结肠组织形态的影响

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A

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B

 

657905.jpg

C

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D

 

657026.jpg

E

 

A.正常组;B.模型组;C. CGMP低剂量组;
D. CGMP中剂量组;E. CGMP高剂量组。

图 1 各组大鼠结肠病理组织切片(HE,×40)

Fig.1 Histological images of colon samples of rats from 5 groups
(HE staining, ×40)

各组大鼠结肠组织石蜡切片经40倍显微镜放大后的形态如图1所示。正常组大鼠结直肠黏膜光滑,细胞无水肿现象出现,腺体规则,未发生病变。而模型组大鼠结直肠黏膜出现局灶性增厚,未发现恶性肿瘤,细胞核增大,出现水肿现象,炎性细胞增生明显,腺管扩张,杯状细胞增多,上皮细胞层增厚,腺窝之间间隙增宽以及不规则的腺管结构。而3 个剂量CGMP组均有不同程度的改善,且低剂量组改善情况最好。

2.3 CGMP对大鼠内毒素、活性氧簇水平的影响

内毒素和活性氧簇的活力可以准确反应结肠的氧化损伤程度,本研究中CGMP对大鼠内毒素和活性氧簇活力的影响见图2、3。

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*.与正常组相比,差异显著(P<0.05);**.与正常组相比,差异极显著(P<0.01);#.与模型组相比,差异显著
(P<0.05);##.与模型组相比,差异极显著(P<0.01)。下同。

图 2 CGMP对大鼠内毒素水平的影响

Fig.2 Effect of CGMP on endotoxin levels of rats

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图 3 CGMP对大鼠活性氧簇水平的影响

Fig.3 Effect of CGMP on reactive oxygen species levels of rats

由图2、3可知,与正常组相比,模型组的内毒素和活性氧簇水平均有显著性升高,具有极显著性差异
(P<0.01),而3 个剂量CGMP组的内毒素和活性氧簇水平差异不显著。与模型组相比,3 个CGMP剂量组的内毒素和活性氧簇水平均有显著性降低,具有极显著性差异(P<0.01),而CGMP高剂量组的内毒素和活性氧簇水平降低效果最佳。即CGMP可以在一定程度上改善结肠的氧化损伤程度,且CGMP中剂量改善效果最佳。

2.4 CGMP对各组大鼠ACF的影响

确认结肠样品ACF主要依据为:腺管染色加深,面积扩大;管腔口呈锯齿状、裂隙状等多种形状;上皮层增厚;腺管极性消失,细胞核大多表现为不典型增生征象[13-15]。通过制作病理切片计数异型隐窝灶,探讨CGMP对二甲肼处理的大鼠异型隐窝灶的影响,各组大鼠异型隐窝灶形状见图4。

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A

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B

 

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C

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D

 

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E

 

A.正常组;B.模型组;C. CGMP低剂量组;D. CGMP中剂量组;E. CGMP高剂量组。

图 4 各组大鼠异型隐窝灶

Fig.4 Aberrant crypt foci (ACF) of each group of rats

异型隐窝灶区别于正常腺窝的特征是肠腺和肠腺周围带大、染色加深和具有裂纹开口等。实验结束后处死大鼠,取结肠组织,分析各组大鼠异型隐窝灶数目,结果如图4所示,正常组大鼠结肠组织未见ACF的出现,模型组和各剂量CGMP组大鼠结肠组织均有ACF出现。分析ACF数目,结果如图5所示。

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图 5 各组大鼠异形隐窝灶个数变化

Fig.5 Changes in ACF number in each group of rats

由图5可知,正常组没有异型隐窝灶的形成,与正常组相比,模型组的异形隐窝灶的个数极显著高于正常组(P<0.01),各剂量组均发现了二甲肼诱导的异型隐窝灶的形成,与正常组相比,各剂量组异型隐窝灶个数具有显著性差异,与模型组相比,灌胃CGMP显著抑制了异型隐窝灶的形成(P<0.05),即CGMP能在一定程度抑制二甲肼处理的大鼠异型隐窝灶的形成。

2.5 CGMP对各组大鼠细胞因子网络的影响

2.5.1 血清中细胞因子的变化

表 3 血清中细胞因子的变化

Table 3 Changes in serum cytokines levels

pg/mL

组别

Th1类细胞因子

 

Th2类细胞因子

IL-2

IL-12p70

IFN-γ

TNF-α

 

IL-4

IL-5

IL-6

IL-10

正常组

37.67±4.8##

39.00±4.86##

46.42±6.16##

39.83±5.19##

 

11.17±2.27##

13.33±3.64##

10.83±1.77##

29.33±8.06##

模型组

12.00±1.53**

13.17±1.34**

22.67±1.60**

12.83±1.46**

 

31.17±4.58**

31.33±5.96**

34.17±3.06**

57.67±5.13**

CGMP低剂量组

14.67±2.16**

14.50±2.07**

19.50±2.49**

13.83±2.14**

 

19.50±1.87*##

19.67±2.34*#

19.00±2.10*#

50.25±7.48**

CGMP中剂量组

16.5±3.45**

16.50±1.87**

21.50±4.55**

15.5±1.52**

 

14.67±1.21

17.17±4.36##

12.83±1.94##

40.83±9.79*#

CGMP高剂量组

23.67±2.94**#

22.00±3.16**#

27.92±4.13**#

21.33±3.60**#

 

11.83±2.86

16.17±2.86##

13.00±2.37##

32.00±4.85##

 

 

由表3可知,与正常组相比,模型组大鼠血清中IL-2等Th1类细胞因子水平均明显降低,IL-4等Th2类细胞因子水平明显升高,即可以认为在DMH处理的大鼠体内细胞免疫存在Th1向Th2漂移。而与模型组相比,3 个剂量的CGMP组大鼠血清中Th1类细胞因子水平升高,Th2类细胞因子水平降低,即CGMP可以在一定程度上对二甲肼处理后的大鼠的Th1/Th2类细胞因子的失衡有改善作用,且以高剂量CGMP效果最佳。

2.5.2 结肠组织中细胞因子的变化

表 4 结肠组织中细胞因子的变化

Table 4 Changes in colonic cytokines levels

pg/mL

组别

Th1类细胞因子

 

Th2类细胞因子

IL-2

IL-12p70

IFN-γ

TNF-α

 

IL-4

IL-5

IL-6

IL-10

正常组

100.08±10.94##

23.42±4.5#

65.83±5.64##

27.92±1.74##

 

35.83±4.21##

24.00±2.45

22.08±1.5

130.67±7.28##

模型组

57.92±5.85**

19.83±1.72*

38.08±4.70**

18.50±1.64**

 

55.17±4.36**

29.83±4.07*

24.50±3.94

198.92±10.75**

CGMP低剂量组

47.83±10.34**#

18.00±1.55*

57.33±2.94*#

20.50±2.66*

 

43.42±2.50*#

29.25±5.47*

22.50±2.51

149.67±11.79*##

CGMP中剂量组

65.75±7.95**##

19.67±1.86*

59.00±4.52##

20.67±3.88*

 

37.83±6.91##

27.42±2.33

22.00±2.76

145.58±9.05*##

CGMP高剂量组

73.83±6.79*##

22.00±4.52

60.50±2.61##

23.67±3.56#

 

37.17±2.56##

25.92±3.14#

24.33±3.44

123.92±5.12##

 

 

由表4可知,与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中IL-2等Th1类细胞因子水平均明显降低,IL-4等Th2类细胞因子水平明显升高,即可以认为在DMH处理的大鼠体内细胞免疫存在Th1向Th2漂移。而与模型组相比,3 个剂量的CGMP组大鼠结肠组织中Th1类细胞因子水平升高,Th2类细胞因子水平降低,即CGMP可以在一定程度上对二甲肼处理后的大鼠的Th1/Th2类细胞因子的失衡有改善作用,且以高剂量CGMP效果最佳。

3 讨 论

结直肠癌肿瘤动物模型包括诱发性模型、移植性模型及转基因模型[16-18]。诱发性模型操作简单,重复性好,短时间内可以大量复制,基本模拟了癌变过程,实验中应用较广,目前建立结直肠癌诱发模型最常用DMH和及其代谢产物氧化偶氮甲烷[19]。本实验选择边造模边干预的方法进行研究,即在给Wistar大鼠腹腔注射DMH的同时给予灌胃CGMP进行干预。虽然结肠组织未见实体肿瘤出现,但ACF的出现可证明出现了癌前病变,因此认为模型建造成功。

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和蛋白的复合物,在正常机体内,肠黏膜可以有效防止微生物及毒素的侵入。当机体受到严重创伤、烧伤、感染、放化疗和接受长期传统的肠外营养时,肠黏膜会发生通透性升高,导致细菌和内毒素易位,引起内毒素血症。快速检测血液、脏器内毒素含量可以为临床相关疾病的诊断预后提供参考。于耕红等[20]的研究证明内毒素与溃疡性结肠炎的病情严重程度相关,其水平随病情加重而上升,可以作为活动期的监测指标。罗锦花等[21]研究发现严重烫伤破坏了肠道黏膜屏障功能,引起细菌、内毒素移位,应用中药膳食干预,能有效预防肠源性感染。本研究结果表明,灌胃CGMP可以显著抑制二甲肼处理的大鼠内毒素水平,其机制为CGMP作为一种食源性短肽,具有促进双歧杆菌增殖的生物学活性,可改善二甲肼处理的大鼠肠道菌群失调的状态。因此,对结直肠癌的发生发展具有缓解作用。

活性氧簇是一类含氧的、具有化学活性物质的总称。主要包括超氧阴离子、过氧化氢、氢氧自由基等,它们广泛存在于机体内并参与调节机体许多生理病理过程[22]。正常情况下,活性氧簇在代谢过程中产生(例如细胞呼吸链中),并保持平衡。它参与人体许多生理过程,是细胞主要的信号分子。大量研究显示低水平活性氧簇在干细胞特性维持中起重要作用[23]。检测细胞活性氧簇的含量,可以了解活性氧簇在细胞一些生理和病理状态中的变化,分析药物效应和相关机制。游宇等[24]研究发现,在炎症性肠病小鼠体内,活性氧簇水平显著升高,参苓白术散通过抑制氧化应激及随后触发的炎症反应而起到抗炎症性肠病的作用。本研究结果表明,灌胃CGMP可以显著抑制DMH处理的大鼠活性氧簇水平,其机制可能与CGMP可以改善大鼠结肠黏膜水肿有关。因此,CGMP可以有效改善大鼠结肠黏膜损伤,缓解结直肠癌的发生和发展。

大鼠经DMH干预后其结肠内内毒素和活性氧簇的指标与结肠组织和血清中细胞因子存在病理状态,即炎症状态。而炎症状态是结直肠癌发生发展的一个阶段。

CRC的发生发展是一个复杂的病理学程,涉及多步骤多阶段的变化,从正常隐窝到异型隐窝灶,在分裂成腺瘤,腺瘤进一步扩大最后发展成为结直肠癌[25-26]。饮食因素在CRC的发生过程中的作用近年来被高度关注,摄食高动物蛋白以及脂肪与结直肠癌的发生呈明显的正相关,而大量摄食蔬菜和水果则明显的抑制结直肠癌的发生发展,而近年来国内外生物活性肽的研究日愈活跃,越来越多的生物活性肽被发现分离,这些肽类不仅能够用来作为氨基酸供体,而且被证明具有广泛的生理功能,例如,抗血栓肽类,抗肿瘤多肽,免疫调节肽等[27]。

ACF是由Bird等[28]在1987年观察鼠大肠癌模型时首次发现和提出的。ACF不同于正常腺管之处在于:腺管扩大,上皮层增厚,腺管之间间距增大以及不规则的管腔和轻微的隆起。它的这些特征可以通过组织切片和美蓝染色后电子显微镜下观察而加以辨别[29]。研究发现,无论是在致癌物诱导的啮齿类动物还是人类大肠癌变过程中,ACF均是大肠癌变的一种癌前损伤,作为镜下可见的最早的大肠癌前病变,人们把ACF作为结直肠癌的早期诊断观察指标之一并用它来评价化合物和食品的抗癌和致癌作用以及相应的作用机制等[30-38]。作为镜下可见的最早的大肠癌前病变,人们把ACF作为结直肠癌的早期诊断观察指标之一并用它来评价化合物和食品的抗癌和致癌作用以及相应的作用机制等[39-41]。为了探讨CGMP对结肠癌形成的作用及作用机理,本研究通过对DMH处理的大鼠灌胃CGMP,观察其对ACF形成的影响。结果显示,未经DMH处理的正常大鼠未没有出现ACF,而经DMH处理的大鼠均发现有ACF的形成,但灌胃了CGMP的大鼠其ACF的个数显著低于模型组,且随着CGMP的剂量的升高,ACF的数目减少,说明CGMP对ACF具有一定的抑制作用。

机体Th1/Th2平衡状态失调后,与肿瘤免疫逃逸,细菌、病毒等微生物感染有一定关系,并参与变态反应性疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的发生[42]。较多的证据表明,Th1/Th2极化是免疫应答调节中的关键环节,Th1/Th2极化异常或缺陷与许多疾病有关,因而Th1/Th2极化已成为研究的新热点[43]。高赟等[10]研究发现在胃肠癌患者与对照组相比IL-2/IL-4比值降低,证实在胃肠癌患者体内细胞免疫为Th1向Th2漂移状态。陈贵平等[9]研究发现,大肠癌患者PBMC中Th1型细胞因子IL-2表达明显低于正常组,Th2型细胞因子IL-4和IL-10表达率明显高于正常组;外周血血清细胞因子蛋白水平检测,发现大肠癌患者血清中IL-2,明显低于正常组,IL-10明显高于正常组,与国内外许多研究结果相同[44-46]。本研究通过对DMH处理的大鼠灌胃乳源CGMP,采用液相芯片技术分析DMH处理的大鼠血清和结肠组织提取液中8 种细胞因子的水平,分析结果发现在DMH处理的大鼠体内细胞免疫存在Th1向Th2的漂移,乳源CGMP对这种状态有一定的改善作用,且呈剂量依赖性。由此可以推断,CRC的发生和发展与
Th1/Th2的失衡是密切相关的,而乳源CGMP可以使大鼠机体内细胞免疫由Th2向Th1逆转,为CRC的免疫治疗提供了一定的理论依据。

4 结 论

乳源CGMP具有改善大鼠结肠组织损伤的功能,其机制为乳源CGMP 可以在一定程度上改善结肠的氧化损伤程度,且中剂量CGMP改善效果最佳。可以有效地抑制DMH处理的大鼠体内异型隐窝灶的形成,并呈剂量依赖性,而且CGMP可以下调大鼠体内IL-4等Th2类细胞因子的异常升高,促进IL-2等Th1类细胞因子的分泌,改善大鼠体内处于失衡状态的细胞因子网络,从而改善结直肠癌发生发展。对于CGMP对大鼠结肠组织形态的影响,低剂量效果好,而在其他结果中又有剂量依赖性,这可能是因为量效关系。

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收稿日期:2014-03-24

基金项目:国家自然科学基金面上项目(30771524;31071522)

作者简介:陈庆森(1957—),男,教授,硕士,研究方向为发酵生物技术、功能成分与肠道健康的关系。E-mail:chqsen@tjcu.edu.cn