荜茇宁对小鼠酒精性脂肪肝的预防作用

昭日格图，白朝鲁门，博格日勒图，娜日苏，领 小

（内蒙古大学化学与化工学院，内蒙古 呼和浩特 010021）

摘 要：目的：探讨荜茇成分荜茇宁（piperlonguminine，GBN）对小鼠酒精性脂肪肝肝损伤的预防作用。方法：将成年雄性昆明小鼠随机分为空白对照组、酒精性脂肪肝模型组以及GBN（低、高）剂量组。空白对照组以基础饲料喂养，其余各组以高脂饲料喂养并每天用白酒按0.8 mL/30 g灌胃；GBN低剂量（10 mg/（kg•d））和高剂量组（40 mg/（kg•d））组分别按设计的药物和剂量给予小鼠灌胃，给药体积为0.8 mL/30 g体质量，空白对照组、模型组给予相同体积的水灌胃，连续给药6 周。于实验第6周末，测定各组小鼠体质量、肝脏指数，检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）活力、总胆固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）含量，并做肝脏病理学检查。结果：GBN低、高剂量组肝脏指数分别为（4.42±0.50）%、（4.53±0.44）%，与模型组比较均显著降低；血清ALT与AST活力极显著降低（P＜0.01）；血清TC与TG含量极显著降低（P＜0.01）；同时病理组织学显示GBN能明显改善酒精性脂肪肝小鼠的肝细胞脂肪变性。结论：GBN够有效预防酒精性脂肪肝的发生或发展。

关键词：荜茇宁；酒精性脂肪肝；血脂；丙氨酸氨基转移酶；天冬氨酸氨基转移酶；肝脏组织切片

Preventive Effects of Piperlonguminine on Alcoholic Fatty Liver Disease in Mice

ZHAO Ri-ge-tu, BAI Chao-lu-men, BO Ge-ri-le-tu, NA Ri-su, LING Xiao

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

Abstract: This study aimed to investigate the preventive and therapeutic effects of piperlonguminine (GBN) on alcoholic fatty liver disease (AFLD) in mice. Adult male Kunming mice were randomly divided into four groups: normal control, model, GBN low dose and high dose groups. The mice in normal control group were fed with a normal diet, and those in the other groups were fed with high-fat diet, and, at the same time, administered with alcohol daily at a level of 0.8 mL/30 g bw.
The mice in GBN low and high dose groups were intragastrically administered with 0.8 mL/30 g bw of GBN at doses of 10 and 40 mg/(kg•d), respectively, and the normal control and model groups were given equal volume of distilled water, continuously for 6 weeks. After 12 h of fasting following the last administration, all the mice were sacrificed for the measurement of liver index, aspartate transaminase (AST), alanine transaminase (ALT), total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) levels in serum and the pathological histological observation of liver tissue. Compared with the model group, the low and high dose groups significantly decreased liver index to (4.42 ± 0.50)% and (4.53 ± 0.44)%, respectively. Also, the levels of AST, ALT, TC and TG in serum were significantly decreased (P ＜ 0.01). And pathological histology showed that GBN obviously improved hepatocyte fatty degeneration of alcoholic fatty liver in mice. In conclusion, GBN can effectively prevent the occurrence and development of alcoholic fatty liver.

Key words: piperlonguminine; alcoholic fatty liver disease; blood fat; alanine transaminase; aspartate transaminase; liver tissue slices

中图分类号：R151.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）13-0232-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413045

临床上依据饮酒与否，可将脂肪肝分为酒精性脂肪肝病（alcoholic fatty liver disease，AFLD）和非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）。人们生活方式和饮食结构的变化，导致脂肪肝的发病率急剧上升，我国部分地区人脂肪肝病的发病率已高达20%，而这其中纤维化的比例高达25%，约1.5%～8.0%的患者可发展为肝硬化，因此脂肪肝病已成为较严重的医学问题[1]。单纯性酒精引起脂肪肝的发病机制至今尚未明确，脂肪代谢异常、脂质过氧化损伤以及氧化应激等因素可能起一定的作用[2-3]。目前国内市场上在治疗酒精性脂肪肝方面还没有疗效十分显著的创新药，不过最近报道
3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂辛伐他丁可显著改善酒精性脂肪肝患者的肝功能[4]。

荜茇为一种药食两用植物，喜高温潮湿气候，主产于中国云南省。博日吉汗•格日勒图等[5-9]曾报道荜茇成分荜茇宁（piperlonguminine，GBN）具有降血脂作用。本实验探讨和研究了GBN对酒精性脂肪肝的预防作用。用小鼠酒精性脂肪肝动物模型进行GBN的体内保肝实验，探讨GBN是否具有保肝生物活性，为GBN防治酒精性脂肪肝提供一定的实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成年雄性昆明小鼠，体质量（20±2）g，许可证号：SCXK（京）2006-2009，级别SPF/AF，由北京维通利华实验动物中心提供。

荜茇宁（GBN）由内蒙古大学蒙药化学研究所制备，纯度＞98%，上述药物临用前用质量分数0.5%的羧甲基纤维素钠溶液制成相应浓度的混悬液。

草原白酒（酒精度52%） 内蒙古太仆寺旗草原酿酒有限责任公司；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）测定试剂盒 北京中生北控生物科技股份有限公司。

高脂饲料配方（质量分数）：胆固醇3%、猪油10%、胆酸钠0.5%、基础饲料86.5%（配方：面粉20%、米粉10%、玉米20%、麸皮25%、豆料20%、骨粉2%、鱼粉2%、食盐0.9%、维生素0.1%）。

1.2 仪器与设备

电子天平 梅特勒-托利多公司；奔腾加强型全自动生化分析仪 意大利奔腾公司；TDL-5-A离心机 上海创萌生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及给药方法

成年雄性昆明小鼠40 只，体质量（20±2）g，实验前在实验环境下（室温20～24 ℃，相对湿度50%～60%，自由饮水）饲喂3 d后，按体质量随机分成4 组，每组10 只，分别为空白对照组、酒精性脂肪肝模型组、GBN低剂量组和GBN高剂量组。空白对照组基础饲料喂养，其余各组以高脂饲料喂养，并每天用白酒（将酒精度52%白酒稀释为30%）灌胃（0.8 mL/30 g）；GBN低剂量组（10 mg/kg）和GBN高剂量组（40 mg/kg）分别按设计的药物和剂量给予小鼠灌胃，给药体积为0.8 mL/30 g体质量，空白对照组、模型组给予相同体积的水灌胃，连续给药6 周。

1.3.2 标本的采集和处理

第6周周末最后一次灌胃后，禁食12 h，称体质量。断头取血，解剖取肝脏称质量。计算其肝脏指数。采集的血液放置于4 ℃冰箱冷藏过夜，低温离心机3 500 r/min
离心10 min，取上层血清于－70 ℃冷冻保存备用。肝脏在称质量后立即放入体积分数4%甲醛溶液固定24 h保存，数周后用石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）法染色，光镜下观察组织病理学变化。

1.3.3 生化指标的测定

血清ALT、AST、TC、TG水平，严格按照中华人民共和国卫生部医政司全国临床检验操作规程操作。

1.4 统计学方法

数据均采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 GBN对脂肪肝小鼠体质量、肝脏质量以及肝脏指数的影响

表 1 GBN对酒精性脂肪肝小鼠体质量及肝脏指数的影响（

x

±s，n=10）

Table 1 Effects of GBN on the body weight and liver index (

x

±s, n =10)

注：**.与空白对照组相比，差异极显著（P＜0.01）；#.与酒精性脂肪肝模型组相比，差异显著（P＜0.05）；##.与酒精性脂肪肝模型组相比，差异极显著（P＜0.01）。下同。

由表1可知，实验始末各组小鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。然而与空白对照组比较，模型组长期饮酒（30%，0.8 mL/30 g）会导致肝脏质量和肝脏指数极显著增长（P＜0.01），因为酒精性脂肪肝的特征之一是肝肿大[10-12]，与模型组相比较，GBN高、低剂量组能极显著降低肝脏质量（P＜0.01）和显著降低肝脏指数
（P＜0.05），说明GBN高、低剂量组均能改善肝肿大。

2.2 GBN对酒精性脂肪肝小鼠肝脏细胞脂肪变性的影响

小鼠肝脏HE染色后显微镜下病理切片照片显示，空白对照组（图1A）小鼠的肝小叶结构清晰，肝内无脂肪变性、没有炎症和坏死的细胞，肝细胞索排列整齐，肉眼观察肝脏呈鲜红色，表明肝内没有明显的脂肪堆积。酒精性脂肪肝模型组（图1B）肝小叶结构不清晰，肝细胞普遍明显肿大，具有严重脂肪变性现象，核增大，肝细胞索排列无规律，肉眼观察肝脏颜色呈淡红色，表明肝内明显积聚了脂肪。GBN低剂量组（图1C）肝细胞普遍中度脂肪变性。GBN高剂量组（图1D）肝细胞普遍轻度脂肪变性。结果表明，与空白对照组比较，模型组的肝细胞脂肪变性明显；与模型组相比，各给药组的肝细胞脂肪变性明显减轻，说明GBN对酒精性脂肪肝具有一定的防治作用。

A

B

C

D

A.空白对照组；B.酒精性脂肪肝模型组；C.GBN低剂量组；D.GBN高剂量组。

图 1 各组小鼠肝脏HE染色后显微镜下病理切片照片（HE，×400）

Fig.1 Pathology slice images of mouse liver in each group under the microscope after HE staining (HE, × 400)

2.3 GBN对酒精性脂肪肝小鼠血清ALT、AST活力的影响

表 2 GBN对酒精性脂肪肝小鼠血清ALT、AST
活力的影响（

x

±s，n=10）

Table 2 Effects of GBN on serum levels of ALT and AST (

x

±s, n =10)

由表2可知，空白对照组血清ALT活力为（42.39±11.94）U/L；AST活力为（186±57）U/L，模型组血清ALT活力为（413.78±145.80）U/L；AST活力为（2 977±770）U/L，表明酒精灌胃法已对小鼠肝脏造成损伤，肝细胞可能发生炎症、坏死。酒精性脂肪肝模型制备成功。

本动物模型实验中，GBN样品可以显著降低转氨酶（ALT、AST）。表2中显示GBN高、低剂量组血清ALT活力为（76.17±67.78）、（117.62±96.12）U/L以及血清AST活力为（280±156）、（208±94）U/L。与模型组相比较，GBN（低、高）剂量组均能极显著降低血清ALT、AST活力（P＜0.01），表明GBN对酒精造成的肝损伤具有一定的预防作用。

2.4 GBN对酒精性脂肪肝小鼠血清TC、TG水平的影响

由表3可知，模型组 TG、TC含量比较空白对照组明显升高，有极显著性差异（P＜0.01）；给予GBN后，实验小鼠血清中的TC和TG含量比模型组明显降低，有极显著性差异（P＜0.01）。由此可知GBN具有抑制TC生成、促进TG氧化分解的作用，从而影响脂质分布、运转与清除。

表 3 GBN对酒精性脂肪肝小鼠血清TC、TG含量的影响（

x

±s，n=10）

Table 3 Effects of GBN on serum levels of TC and TG (

x

±s, n =10)

3 讨 论

3.1 荜茇宁对酒精性脂肪肝模型小鼠血脂的影响

甘油三酯是体内能量的重要来源，也是人体内含量最多的脂类，其合成的主要场所在肝脏。当肝脏功能受损时，可能会阻碍肝脏合成甘油三酯、磷脂或载脂蛋白，致使甘油三酯无法转运出肝脏。如此，机体脂类代谢紊乱、过氧化损伤、肝细胞甘油三酯蓄积，致使肝细胞脂肪变性及脂肪肝形成[13-14]。本课题组首次发现荜茇宁具有降血脂作用，并获得发明专利一项[15]。本实验发现模型组TG、TC含量比空白对照组明显升高，差异极显著
（P＜0.01）；给予GBN后，实验小鼠血清中的TC和TG含量比高脂模型对照组明显降低，差异极显著
（P＜0.01）。由此可知GBN具有抑制TC生成、促进TG氧化分解的作用，从而影响脂质分布、运转与清除。

3.2 荜茇宁对酒精性脂肪肝模型小鼠血清ALT、AST活力的影响

乙醇代谢过程中产生的活性氧可损害细胞膜以及线粒体膜，细胞膜通透性增强，使肝细胞中的转氨酶渗透至血液中，造成血液中ALT和AST活力的升高[16-17]。在生物体内，AST和ALT是反映肝细胞损害的常用酶学检查指标，是肝细胞损害的敏感标志[18]。本实验中，GBN样品各组可以显著降低血清中转氨酶（ALT、AST）。GBN高、低剂量组与模型组相比较血清ALT、AST指标，GBN（低、高）剂量组均能极显著降低血清ALT、AST活力（P＜0.01），表明GBN对酒精造成的肝损伤具有一定的预防作用。

3.3 荜茇宁对酒精性脂肪肝模型小鼠肝脏组织

肝脏在脂类的吸收、运输、合成、贮存、分解等过程中均起到重要的作用。长期摄入乙醇及高脂食物会导致肝脏脂肪代谢紊乱[19-21]。本实验中空白对照组小鼠的肝小叶结构清晰，肝内无脂肪变性、没有炎症和坏死的细胞，肝细胞索排列整齐，肉眼观察肝脏呈鲜红色，表明肝内没有明显的脂肪堆积。酒精性脂肪肝模型组小鼠肝小叶结构欠清晰，肝细胞普遍明显肿大，具有严重脂肪变性，核增大，肝细胞索排列无规律，肉眼观察肝脏颜色呈淡红色，表明肝内明显积聚了脂肪。GBN低剂量组肝细胞普遍中度脂肪变性。GBN高剂量组肝细胞普遍轻度脂肪变性。结果表明，与空白对照组比较，模型组的肝细胞脂肪变性明显；与模型组相比，各给药组的肝细胞脂肪变性明显减轻，说明GBN对酒精性脂肪肝具有一定的防治作用。

综上所述，本实验条件下，GBN可通过降低酒精性脂肪肝小鼠血脂水平，调节肝功能指标，从而有效的预防了酒精性脂肪肝的发生和发展。该病是一种可预防的疾病，具有可逆性，但由于人体长期饮酒对酒精易产生依赖性，所以患者能否做到酒精戒断是影响该病治疗效果的重要条件，只有在戒酒的基础上配合以药物治疗才能取得好的疗效，这就需要全社会对饮酒的危害性给予关注并进行广泛深入的宣传。

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