冰岛刺参岩藻糖基化硫酸软骨素对高脂饮食诱导的糖尿病小鼠肾脏的保护作用

周晓春,王静凤,胡世伟,石 迪,薛长湖*

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东 青岛 266003)

 

摘 要:目的:研究冰岛刺参岩藻糖基化硫酸软骨素(fucolysated chondroitin sulfate from Cucumaria frondosaCf-CHS)对高脂饮食诱导的糖尿病小鼠肾脏的保护作用。方法:以高脂高糖饲料饲喂诱导Ⅱ型糖尿病小鼠模型,饲喂含不同剂量Cf-CHS的高脂高糖饲料连续19 周,检测空腹血糖并收集尿液,分别检测小鼠尿液中尿糖、微量白蛋白(microalbumin,mAlb)、尿总蛋白、尿素氮(urea nitrogen,UN)、尿酸(uric acid,UA)、肌酐(creatinine,Cr)浓度和β-N-乙酰葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-glucosaminidase,NAG)排泄率,摘取肾脏观察肾脏组织的显微结构。结果:Cf-CHS可显著降低糖尿病小鼠的尿糖、mAlb、尿总蛋白、UN、UA、Cr浓度和NAG排泄率
P<0.01),改善肾脏组织的显微结构。结论:Cf-CHS可显著改善糖尿病小鼠的肾脏功能。

关键词:糖尿病肾病;冰岛刺参;岩藻糖基化硫酸软骨素;尿蛋白;β-N-乙酰葡萄糖苷酶;肾脏保护

 

Protective Effect of Fucolysated Chondroitin Sulfate from the Sea Cucumber Cucumaria frondosa on Kidney of High Fat Diet-Induced Diabetic Mice

 

ZHOU Xiao-chun, WANG Jing-feng, HU Shi-wei, SHI Di, XUE Chang-hu*

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

 

Abstract: Objective: In this study, the protective effect of fucolysated chondroitin sulfate from the sea cucumber Cucumaria frondosa (Cf-CHS) on kidney was accessed in high fat diet-(HFD) induced diabetic mice. Methods: To establish diabetic models, mice were fed with HFD. The diabetic mice were administered with different doses of Cf-CHS daily for 19 weeks. Urine was collected to analyze the levels of glucose, microalbumin (mAlb), total protein, urea nitrogen (UN), uric acid (UA), creatinine (Cr) and the excretion of N-acetyl-β-glucosaminidase (NAG). Kidney tissue was collected to make microscope slides. Results: Cf-CHS could significantly (P < 0.01) decrease the levels of glucose, mAlb, total UN, UA, Cr, and NAG in urine and observably improve kidney tissue of diabetic mice. Conclusion: Cf-CHS has a remarkably protective effect on kidney of diabetic mice.

Key words: diabetes mellitus; Cucumaria frondosa; fucolysated chondroitin sulfate(CHS); urine protein; N-acetyl-β-glucosaminidase(NAG); kidney protection

中图分类号:R285.5 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)13-0236-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413046

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是常见的糖尿病微血管并发症[1],最终引起肾小球病变,目前已成为导致糖尿病患者死亡的主要原因之一。海参是传统的珍贵滋补品,海参多糖是海参体壁的主要成分之一,包括岩藻糖基化硫酸软骨素(fucolysated chondroitin sulfate,CHS)和海参岩藻聚糖硫酸酯两类[2-3]。其中CHS是一种带岩藻糖支链的酸性黏多糖,糖链上有部分羟基发生硫酸酯化(硫酸酯基类含量在32%左右)[4]。

研究发现,海参CHS具有抗凝血[5]、抗血栓[6-7]和抗肿瘤[8-9]等生理活性,对神经细胞、黏膜细胞、肾细胞等具有保护作用,且活性很大程度上与岩藻糖支链含量和硫酸基取代情况相关[9-11]。冰岛刺参(Cucumaria frondosa)是产于冰岛水域的深海野生海参,产量大,价格低廉,本课题组前期对不同种类海参体壁的CHS含量及单糖组成进行了分析比较,结果发现以冰岛刺参为主的寒带海参体壁含有丰富的CHS,岩藻糖含量较高[4],提示其可能具有生理活性。Hu Shiwei等[12]以冰岛刺参岩藻糖基化CHS(Cf-CHS)为研究对象,发现其可以明显改善Ⅱ型糖尿病小鼠的糖代谢。故本实验观察Cf-CHS对糖尿病并发症——糖尿病肾病有无影响,探讨其对以高脂高糖饲料诱导的糖尿病小鼠肾脏的保护作用,以期进一步发掘冰岛刺参的营养保健作用,为其高值化利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

冰岛刺参干品,购于青岛市水产品市场。

1.2 动物

C57BL/6J小鼠,雄性,体质量19~21 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK (京)2009-0007。

1.3 试剂

罗格列酮(rosiglitizone,RSG) 美国Sigma公司;氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride,CPC) 生工生物工程(上海)股份有限公司;葡萄糖试剂盒 北京中生北控生物科技股份有限公司;肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(urea nitrogen,UN)、尿酸(uric acid,UA)、β-N-乙酰葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-glucosaminidase,NAG)测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;尿微量白蛋白(microalbuminuria,mAlb)测定试剂盒 上海太阳生物技术有限公司;苏木精 上海
蓝季科学发展有限公司;醇溶性伊红 上海试剂三厂。

1.4 仪器与设备

Model680型酶标仪 美国Bio-Rad公司;GL-20M型高速冷冻离心机 上海卢湘离心机仪器有限公司;ALPHA 1-4 LO型冻干机 德国Christ公司;LABOROTA 4000型旋转蒸发仪 德国Heidolph公司;1100型高效液相色谱仪 美国Agilent公司;TSK-gel G4000 PWxl色谱柱 Tosoh Bioscience公司;BH-2型显微镜、DP72型显微照相系统 日本Olympus公司。

1.5 方法

1.5.1 Cf-CHS的制备和检测

参照文献[4]制备Cf-CHS。干冰岛刺参粉碎,丙酮浸泡脱脂 24 h,室温晾干。向干物中(以下提取步骤均以1 g干物计算)加入100 mg木瓜蛋白酶,60 ℃水浴条件下搅拌反应24 h,离心得上清。向上清液中加入1.6 mL质量分数10% 的CPC溶液,室温静置24 h后离心,弃上清。沉淀溶解于15 mL 3 mol/L NaCl-乙醇(10015,V/V)溶液中,4 ℃静置24 h,离心弃沉淀。向上清液中加入20 mL体积分数95%乙醇溶液继续沉淀。弃上清,蒸馏水溶解沉淀,用截留分子质量为10 kD的透析袋透析脱盐,浓缩,冻干,得海参粗多糖。粗多糖过DEAE-52阴离子交换柱,以0~1.4 mol/L NaCl缓冲盐溶液连续梯度洗脱,每7 mL收集一管。洗脱液过液相TSK4000柱检测组分单一的管,收集后透析,冻干,得Cf-CHS纯品。本课题组前期研究显示,Cf-CHS分子质量为14.76 kD,主要由葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和岩藻糖3 种单糖组成,且三者的物质的量比为1.001.501.16,其硫酸根含量为31.07%[11]。

1.5.2 动物分组及模型建立

C57BL/6雄性小鼠,4~5 周龄,适应性喂养7 d,随机分成正常对照组、模型对照组、阳性对照组、纯品Cf-CHS组、低剂量Cf-CHS+RSG组和高剂量Cf-CHS+RSG组。正常对照组饲喂正常饲料,其他组喂高糖高脂饲料。饲料配方参照美国营养学会1993年颁布的啮齿类实验动物纯化饲料标准(American Institute of Nutrition-93 purified diets for laboratory rodents,AIN-93)。正常饲料中不含糖类,蛋白质和脂肪分别占20%和5%,能量3.85 kcal/g;高糖高脂饲料糖类、蛋白质和脂肪的相对含量分别为20%、20%和25%,能量4.85 kcal/g。阳性对照组、纯品Cf-CHS组、低剂量Cf-CHS+RSG组和高剂量Cf-CHS+RSG组饲料中分别以体质量为基础添加RSG(1 mg/(kg•d))、Cf-CHS(80 mg/(kg•d))、
Cf-CHS+RSG(20 mg/(kg•d)+1 mg/(kg•d))和
Cf-CHS+RSG(80 mg/(kg•d)+1 mg/(kg•d))。喂养期间,每月尾静脉取血检测各组小鼠的空腹血糖,每组3 只。第18周检测数据显示不同组小鼠的空腹血糖出现显著性差异,提示造模成功。连续喂养19 周后收集标本。实验期间小鼠自由进食、饮水,每天记录摄食量,每3 d记录小鼠体质量。

1.5.3 标本收集

小鼠代谢笼单只适应24 h后,收集24 h 尿液,离心分装,4 ℃保存待测。小鼠末次给药后禁食不禁水5 h,尾静脉取血10 μL,参照试剂盒离心并测定血糖水平。

1.5.4 尿糖浓度的测定

参照试剂盒说明书测定。

1.5.5 尿mAlb、总蛋白含量的测定

尿总蛋白含量的测定采用双缩脲法;尿mAlb含量的测定参照试剂盒说明书进行。

1.5.6 尿Cr、UN、UA含量的测定

参照试剂盒说明书测定。

1.5.7 尿NAG排泄率的测定

参照试剂盒说明书测定尿NAG浓度。尿NAG排泄率为尿NAG浓度与24 h尿量的乘积。

1.5.8 肾脏组织的显微观察

小鼠脱颈椎处死,迅速摘取双肾,将肾皮质小块置于10%的中性甲醛中固定24 h,脱水、透明、常规石蜡包埋、切片、染色后,于光学显微镜下观察并拍照。

1.6 统计学分析

采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析,同时进行最小显著差异(least significant difference,LSD)两两比较。以P<0.05为差异显著。实验结果均以

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±s表示。

2 结果与分析

2.1 Cf-CHS对糖尿病小鼠空腹血糖和尿糖浓度的影响

表 1 Cf-CHS对糖尿病小鼠空腹血糖和尿糖浓度影响(

x

662272.jpg

± sn=10)

Table 1 Effect of Cf-CHS on the levels of fasting blood glucose and urinary glucose (

x

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± s, n = 10)

组别

空腹血糖浓度/(mmol/L)

尿糖浓度/(mmol/L)

正常对照组

9.27±0.40

0.58±0.02

模型对照组

13.12±0.82##

1.69±0.05##

阳性对照组

10.92±0.69*

0.98±0.03**

纯品Cf-CHS组

11.08±0.40*

1.22+0.03**

低剂量Cf-CHS+RSG组

10.95±1.14*

1.13±0.01**

高剂量Cf-CHS+RSG组

10.14±0.67*

0.92±0.07**

 

注:##. 与正常对照组相比,有极显著性差异(P<0.01);*. 与模型对照组相比,有显著性差异(P<0.05);**. 与模型对照组相比,有极显著性差异(P<0.01)。下同。

 

血糖升高和尿糖是糖尿病的主要临床症状之一。如表1所示,模型对照组小鼠的血糖和尿糖浓度显著均高于正常对照组(P<0.01),提示所造糖尿病小鼠模型成功。喂食含Cf-CHS的高脂饲料后,相对于模型对照组,3个实验组的血糖浓度和尿糖浓度均显著降低
P<0.05,P<0.01)。其中,纯品Cf-CHS小鼠的尿糖浓度降低了27.8%,低剂量Cf-CHS+RSG组和高剂量
Cf-CHS+RSG组分别降低了33.1%和45.6%。表明Cf-CHS具有与阳性药物类似的效果,可以显著改善糖尿病小鼠的尿糖症状。

2.2 Cf-CHS对糖尿病小鼠尿mAlb和总蛋白含量的影响

表 2 Cf-CHS对糖尿病小鼠mAlb、总蛋白、Cr、UN和UA含量的影响(

x

662208.jpg

± sn=10)

Table 2 Effect of Cf-CHS on the levels of mAlb, total protein, Cr, UN, and UA in urine (

x

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± s, n = 10)

组别

mAlb含量/(g/L)

总蛋白含量/(g/L)

Cr含量/(µmol/L)

UN含量/(mmol/L)

UA含量/(mg/L)

正常对照组

0.85±0.02

1.56±0.05

674.08±28.38

778.20±16.34

689.10±32.29

模型对照组

2.09±0.13##

2.72±0.15##

1 498.22±56.39##

1 876.52±15.11##

1 422.71±57.32##

阳性对照组

1.10±0.08**

2.21±0.04**

1 023.20±15.35**

1 140.28±59.31**

1 031.75±51.22**

纯品Cf-CHS组

1.31±0.06**

2.21±0.08**

1 030.01±53.42**

1 257.04±43.60**

1 308.49±44.56

低剂量Cf-CHS+RSG组

1.22±0.07**

2.07±0.06**

1 061.99±44.33*

1 031.99±17.02**

1 044.86±50.56**

高剂量Cf-CHS+RSG组

0.99±0.10**

1.76±0.04**▲▲

830.61±50.68**▲

871.93±33.59**▲

994.82±27.71**

 

注:▲. 与阳性对照组相比,有显著性差异(P<0.05);▲▲. 与阳性对照组相比,有极显著性差异(P<0.01)。下同。

 

尿mAlb及总蛋白是糖尿病肾脏病变的诊断指标,反映肾小球的滤过功能[13]。如表2所示,相比正常对照组,模型对照组小鼠的尿mAlb和总蛋白含量显著升高(P<0.01),表明小鼠出现了肾脏病变。相对于模型对照组,喂食Cf-CHS的纯品组、低剂量Cf-CHS+RSG组和高剂量Cf-CHS+RSG组小鼠的尿mAlb含量分别降低了37.3%、41.6%和52.6%(P<0.01),总蛋白含量分别降低了18.8%、23.9%和35.3%(P<0.01)。与阳性对照组相比,复配高剂量组降低尿总蛋白含量的作用更显著,差异具有统计学意义(P<0.01)。表明Cf-CHS可以显著抑制糖尿病小鼠尿微量白蛋白的排出,降低尿总蛋白的排出量,对糖尿病肾病有一定治疗作用,并且Cf-CHS可以协同增加RSG的降尿总蛋白作用效果。

2.3 Cf-CHS对糖尿病小鼠尿Cr、UN、UA含量的影响

Cr、UN和UA分别为体内肌酸、蛋白质和嘌呤代谢产物,3 种物质均经肾小球滤过后随尿排出,是反映肾小球受损的灵敏指标[14]。由表2可知,模型对照组小鼠尿液中三者的水平均显著升高(P<0.01),反映其肾小球已受损。与模型对照组相比,3 个实验组的尿Cr、UN和 UA水平均显著降低(P<0.01)。其中,纯品组、低剂量Cf-CHS+RSG组和高剂量Cf-CHS+RSG组的尿Cr含量分别下降了31.3%、29.1%和44.6%,UN含量分别下降了33.0%、45.0%和53.5%,UA含量分别下降了8.0%、26.6%和30.1%。与阳性对照组相比,Cf-CHS与RSG复配后降尿Cr、UN的作用显著,表明Cf-CHS有一定修复肾小球损伤的作用,且与RSG有一定的协同作用。

2.4 Cf-CHS对糖尿病小鼠NAG排泄率的影响

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图 1 Cf-CHS对糖尿病小鼠NAG排泄率的影响(

x

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± sn=10)

Fig.1 Effect of Cf-CHS on the excretion amount of NAG in urine of diabetic mice (

x

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± s, n = 10)

NAG是来自肾近端曲小管溶酶体水解酶,当肾小管细胞受损时尿NAG活性显著升高,反映肾小管早期损伤[15]。由图1可知,模型对照组的NAG排泄率比正常对照组显著升高,有极显著性差异(P<0.01)。饲喂含Cf-CHS的高脂高糖饲料后,与模型对照组相比,纯品
Cf-CHS组、低剂量Cf-CHS+RSG组和高剂量Cf-CHS+RSG组
的NAG排泄率均有所降低,分别降低了13.7%、45.3%和59.1%,作用效果极显著(P<0.01)。复配高剂量组比阳性对照组效果更优,差异具有统计学意义
P<0.05)。提示Cf-CHS能够降低糖尿病小鼠的尿NAG活性,抑制NAG排出,改善糖尿病肾病引起的肾小管损伤,与RSG复配后效果更显著。

2.5 Cf-CHS对糖尿病小鼠肾脏组织显微结构的影响

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a

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b

 

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c

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d

 

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e

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f

 

a.正常对照组;b.模型对照组;c.阳性对照组;d.纯品Cf-CHS组;e.低剂量Cf-CHS+RSG组;f.高剂量Cf-CHS+RSG组。

图 2 Cf-CHS对糖尿病小鼠肾脏组织形态学的影响(HE染色,×400)

Fig.2 Effect of Cf-CHS on kidney microstructure of diabetic mice (HE stain, ×400)

如图2所示,光镜下正常对照组小鼠肾小球外形饱满规则,肾小囊边界清晰,肾小管结构正常;模型对照组小鼠的肾小囊变窄,肾小球体积增大。以Cf-CHS干预后,3 个实验组小鼠的肾小球和肾小囊病变程度较模型组明显减轻,其中,高剂量Cf-CHS+RSG组小鼠的肾脏组织接近正常。

3 讨 论

糖尿病肾病是最严重最常见的糖尿病并发症之一,主要临床特征有尿蛋白和肾功能受损,特征性的病理改变是肾小球系膜区无细胞性增宽和肾小球基底膜弥漫性增厚,渐至肾小球硬化和肥大,末期肾功能衰竭[16-17]。DN的检测以尿指标为主,因尿液成分可以直接反映血液成分的变化和肾脏对血液的滤过能力。尿糖是尿液中糖含量的总称,只有当血糖很高时才能形成尿糖,而高血糖对糖尿病病人肾脏发生病变至关重要[18]。因此检测尿糖水平可以了解糖尿病的严重程度和发生肾病的危险。DN的主要诊断指标有尿mAlb、总蛋白、UN、Cr、UA和NAG等,其中尿mAlb、总蛋白、UN、Cr和UA是反映肾小球受损的指标,NAG反映肾小管受损程度[19]。而尿蛋白还对肾小球系膜有毒性作用,损害肾小管间质等[14-15]。

本实验以高脂高糖饲料饲喂小鼠以诱导Ⅱ型糖尿病模型,通过检测尿糖、尿mAlb、总蛋白、UN、Cr、UA和NAG等,综合评价糖尿病小鼠糖尿病和肾脏病变的严重程度。结果显示,模型对照组小鼠各项尿指标水平都显著升高,造模成功。饲喂含Cf-CHS饲料可显著降低尿液中糖、mAlb、总蛋白、UN、Cr、UA和NAG的水平,说明Cf-CHS可以有效抑制尿糖、尿蛋白和NAG等的排出,对糖尿病引起的肾脏病变有一定的修复作用。与糖尿病常规治疗药物RSG复配后,降低效果更为显著,提示Cf-CHS与RSG有一定的协同效应,进一步促进RSG对Ⅱ型糖尿病引起的肾脏变的修复作用。

糖尿病肾病的发生是多因素综合作用的结果,包括糖代谢异常、肾脏血流动力学的改变和多种细胞因子的作用[15]。本研究中的冰岛刺参硫酸软骨素富含岩藻糖支链,研究表明,岩藻糖分支结构与CHS的多种生物学活性相关,其特异性的空间排列是CHS抗凝活性的基础,还与抗血栓、降血脂、促进脐静脉内皮细胞增殖和移位、促进血管再生和抑癌活性等密切相关[9,16,20]。本研究结果显示,冰岛刺参岩藻糖基化硫酸软骨素可促进糖尿病肾病引起的肾细胞损伤的修复,可能与可改善糖尿病小鼠的高血糖症状,降低某些引起肾小球和肾小管病变的关键细胞因子的表达等有关,具体作用机制还需进一步实验探讨。

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收稿日期:2013-08-29

基金项目:公益性行业(海洋)科研专项(2011CX80201);山东省自主创新专项(2012CX80201);

国家自然科学基金面上项目(31371876)

作者简介:周晓春(1989—),女,硕士,研究方向为海洋生物活性物质。E-mail:yyaimeishi@163.com

*通信作者:薛长湖(1964—),男,教授,博士,研究方向为水产品加工。E-mail:xuech@ouc.edu.cn