白藜芦醇通过降低LYRM1 mRNA表达抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖

张 翔，黎文明，钟贤武，郑 琳，李明慧，冯 翔*

（广东省营养膳食与健康重点实验室，中山大学公共卫生学院，广东 广州 510080）

摘 要：目的：观察白藜芦醇（resveratrol，Res）对3T3-L1前脂肪细胞增殖活性的影响，并探讨其机制。方法：对3T3-L1前脂肪细胞进行培养，分别设置对照组以及25、50、75、100 μmol/L的Res干预组，噻唑蓝
比色法观察不同剂量干预对细胞增殖活性的影响；实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞中LYR Motif containing 1（LYRM1）基因mRNA的表达情况；Western blotting实验检测细胞中促凋亡蛋白Bak和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。结果：Res干预可使3T3-L1前脂肪细胞增殖活性降低；细胞中LYRM1 mRNA水平降低，Bak蛋白表达含量升高，Bcl-2蛋白表达含量降低，均具有剂量依赖效应。结论：Res可以抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖，这可能与Res降低细胞内LYRM1 mRNA表达，影响线粒体功能并启动凋亡程序有关。

关键词：白藜芦醇；3T3-L1前脂肪细胞；细胞增殖；LYRM1；Bcl-2家族

Suppressive Effect of Resveratrol on 3T3-L1 Preadipocyte Proliferation by Reducing LYRM1 mRNA Expression

ZHANG Xiang, LI Wen-ming, ZHONG Xian-wu, ZHENG Lin, LI Ming-hui, FENG Xiang*

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Food, Nutrition and Health, School of Public Health, Sun Yat-Sen University,

Guangzhou 510080, China)

Abstract: Purpose: To investigate the effect of resveratrol (Res) on proliferation of 3T3-L1 preadipocyte and its potential molecular mechanisms. Methods: 3T3-L1 preadipocytes were plated in plastic dishes and treated with or without indicated levels of Res (25, 50, 75, and 100 μmol/L). Cell toxicity of different doses of Res was assayed by MTT test. The mRNA expression of LYRM1 was determined by real time polymerase chain reaction (RT-PCR), and the expressions of pro-apoptotic protein Bak and anti-apoptotic protein Bcl-2 were confirmed by Western blot. Results: Res treatments dose-dependently suppressed the proliferation potential of preadipocyte, via reduced expression of LYRM1 mRNA, increased Bak protein expression and decreased Bal-2 protein expression. Conclusion: Res treatments suppressed 3T3-L1 preadipocyte proliferation, which may be associated with reduced LYRM1 expression and then mitochondrial dysfunction, finally leading to progressive apoptotic process.

Key words: resveratrol; 3T3-L1 preadipocyte; proliferation; LYRM1; Bcl-2 family

中图分类号：Q946.8 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）13-0250-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413049

肥胖是全球流行最为广泛的一种疾病，各种慢性疾病发病风险增加与之密切相关。但是到目前为止，几乎没有可以降低体质量但又不产生严重副作用的治疗药物[1]。近年来，植物化学物的减肥功效越来越受到关注。白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种存在于多种植物中的多酚化合物，包括葡萄、浆果、花生等，对癌症、衰老、Ⅱ型糖尿病和心血管疾病均有一定的治疗作用[2]。

随着对肥胖研究的逐渐深入，肥胖基因成为近些年研究的新突破点。LYR Motif containing 1（LYRM1）是最新发现的一个基因位点，在细胞增殖和凋亡中都扮演比较重要的角色[3]。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡过程中起重要作用的一组蛋白质，大体可以分为促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白两类，Bak和Bcl-2是其中的典型代表。本课题组既往研究发现，Res可抑制3T3-L1前脂肪细胞的生命周期，同时特异性地启动沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，sirt1），上调丝苏氨酸蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）磷酸化水平最终诱导细胞凋亡，且呈一定的时间-剂量依赖关系[4-5]。本研究拟采用小鼠3T3-L1前脂肪细胞为研究对象，着眼于新的肥胖基因靶点——LYRM1，检测Res对细胞增殖活性的影响以及对LYRM1 mRNA和Bak、Bcl-2蛋白表达的影响，为探讨Res影响3T3-L1前脂肪细胞增殖的机制提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3T3-L1细胞株 中国科学院上海细胞库。

Res、Res溶剂二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美国Sigma公司；高糖DMEM培养基 美国
Gibco公司；胎牛血清 美国Hyclone公司；双抗（青链霉素） 广州纽普诺博生物制品有限公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 广州艾斯金生物科技有限公司；RNA提取试剂 美国Invitrogen公司；细胞裂解液 Beyotime公司；牛血清白蛋白 美国Amresco公司；蛋白定量分析试剂盒 美国Thermo公司；逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（real time polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒 日本TaKaRa公司；兔抗Bak单克隆抗体、兔抗Bcl-2单克隆抗体 美国CST公司；兔抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗 美国Santa Cruz公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪 美国Bio-Tek公司；微量振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪 德国Eppendorf公司；T-gradient 96梯度
PCR仪 德国Biometra公司；Vii7荧光定量PCR仪 美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 3T3-L1前脂肪细胞的培养

高糖DMEM培养基中添加体积分数10%的胎牛血清和体积分数1%的双抗配成完全培养基，于37 ℃、5% CO2、95%湿度条件下培养3T3-L1前脂肪细胞，取对数生长期的细胞用于实验。

1.3.2 MTT法测定细胞生长曲线

将处于对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞以5×1010 个/L
的密度接种于96 孔培养板，每孔体积100 μL。待细胞贴壁后换成含0、25、50、75、100 μmol/L Res的完全培养基，每组设置3 个重复，在Res干预24、48 h后分别加入5 mg/mL的MTT溶液，每孔10 μL，继续培养3 h。取出96 孔培养板，轻轻吸去培养基，加入150 μL DMSO溶解沉淀，置于微量振荡器上避光振荡10 min后，酶标仪490nm波长处测定光密度值。

1.3.3 RT-PCR检测LYRM1 mRNA表达

以同样的密度接种于5 个培养皿中，于对数生长期分别加入含0、25、50、75、100 μmol/L Res的完全培养基，培养24 h。采用TRIzol一步法提取细胞总RNA并定量，按照逆转录试剂盒操作说明将RNA逆转录为cDNA，进一步采用RT-PCR检测各剂量干预组中LYRM1 mRNA表达水平。LYRM1、参照基因β-actin引物序列见表1。采用ΔΔCt法计算LYRM1 mRNA的相对表达量。

基因mRNA相对表达量=2Ct（参照基因）- Ct（目的基因）

表 1 LYRM1、β-actin基因引物序列

Table 1 Nucleotide sequences for the primers of the genes LYRM1 and β-actin

注：引物来源于参考文献[6]。

1.3.4 Western blotting检测Bak、Bcl-2蛋白表达

以同样的密度接种于5 个培养皿中，于对数生长期分别加入含0、25、50、75、100 μmol/L Res的完全培养基，培养24 h。加入细胞裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）法进行总蛋白定量。配制10%分离胶和4%浓缩胶，上样，恒压100 V、80 mA电泳90 min，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），湿式转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1.5 h，暗房中滴加发光底物混合物2 mL于聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用X光片曝光、显影、定影。Western blotting结果采用软件Quantity One进行定量。

1.4 数据处理

采用SPSS16.0统计软件，计量单位以

±s表示，各组比较采用One-Way ANOVA检验，组间两两比较采用最小著差（least-significant difference，LSD）法。检验水准设为0.05，P＜0.05认为有差异具有统计学意义。作图软件采用GraphPad Prism 5.0。

2 结果与分析

2.1 Res对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖活性的影响

由表2可知，对照组细胞生长状态良好，干预结束时显微镜下观察，可见最大干预剂量组细胞密度低于对照组，且干预48 h较干预24 h差别更明显。干预24 h时，25 μmol/L Res干预组的3T3-L1前脂肪细胞增殖活性与对照组细胞相比有显著性差异（P＜0.05），其余干预剂量组细胞增殖活性与对照组相比有极显著性差异（P＜0.01）。而干预48 h时，各个干预剂量组的细胞增殖活性与对照组细胞相比，均表现出极显著性差异
（P＜0.01）。

表 2 不同剂量Res对3T3-L1前脂肪细胞增殖活性的影响（

x

±s，n=3）

Table 2 Effect of resveratrol on proliferation of 3T3-L1 preadipocyte (

x

±s, n = 3)

注：*.与对照组相比，差异显著（P＜0.05）；**.与对照组相比，差异极显著（P＜0.01）。下同。

2.2 Res对小鼠3T3-L1前脂肪细胞中LYRM1 mRNA表达的影响

图 1 Res对3T3-L1前脂肪细胞中LYRM1 mRNA表达的影响

Fig.1 Effect of resveratrol on the expression level of LYRM1 mRNA of 3T3-L1 preadipocyte

由图1可知，不同剂量Res干预3T3-L1前脂肪细胞24h后发现，LYRM1 mRNA的表达量随着干预剂量的升高而逐渐降低，降低幅度明显，各个剂量干预组与对照组相比均具有极显著差异（P＜0.01）。

2.3 Res对小鼠3T3-L1前脂肪细胞中Bak、Bcl-2蛋白表达的影响

图 2 Res对3T3-L1前脂肪细胞中Bak、Bcl-2蛋白表达的影响

Fig.2 Effect of resveratrol on the expression levels of Bak and Bcl-2 proteins of 3T3-L1 preadipocyte

由图2可知，不同剂量Res干预细胞24 h后，促凋亡蛋白Bak和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量发生了改变。其中，随着干预剂量的升高，Bak的表达随之升高，25 μmol/L干预组较对照组差异不具有统计学意义，50、75、100 μmol/L干预组与对照组相比明显升高，具有极显著性差异（P＜0.01）。而Bcl-2的表达随干预剂量的升高而降低，其中25、50 μmol/L干预组与对照组相比，差异不具有统计学意义，75、100 μmol/L干预组中Bcl-2的表达水平明显降低，具有极显著性差异（P＜0.01）。二者的表达量与干预浓度呈一定的剂量-效应关系。

3 讨论与结论

肥胖是由于脂肪细胞过度增殖、分化导致中性脂肪过度沉积引起的一种慢性代谢性疾病，脂肪细胞的数目和体积都与肥胖发生的程度密切相关。3T3-L1前脂肪细胞又称为3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞，是国际上公认的研究脂肪代谢的细胞模型，一般可采用鸡尾酒法将3T3-L1
前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。既然脂肪细胞数目的增多可以造成肥胖的发生，如果可以减少前脂肪细胞的数目，那么分化形成的成熟脂肪细胞数目必然减少。依照该思路，肥胖发生的风险也会随之降低。

Res是一种非黄酮类的多酚类植物化学物，在葡萄特别是葡萄皮中含量颇丰富。近些年的研究发现其在抗肿瘤方面有一定的功效。同时，也有研究通过提取葡萄皮中的Res作用于3T3-L1脂肪细胞，发现Res可以减少细胞内脂滴沉积，并抑制细胞的分化[7]。以动物为受试对象，Res可增加大鼠原代脂肪细胞的抗氧化能力，改善胰岛素抵抗[8]；同时也可减轻KKAy小鼠体质量，降低体内脂肪含量[9]，并改善小鼠胰岛素抵抗和糖耐量异常[10]。本研究着眼于3T3-L1前脂肪细胞的增殖能力，希望通过Res干预，可以降低脂肪细胞的增殖速率。在MTT实验中发现，不论干预时间是24 h或是48 h，不同剂量的Res干预组与对照组相比OD490 nm值均有所降低，并随着干预剂量的升高，降低趋势愈加明显。这间接表明，Res作用于细胞后，细胞的增殖速率有所降低，并且干预浓度越高，增殖速率越慢。

LYRM1基因是应用抑制性差减杂交技术，从肥胖者与健康人群腹膜脂肪组织中筛选出来的差异表达基因。在脂肪细胞分化的后期，LYRM1的表达量显著上调[11]。自该基因发现以来，对其的研究多为将其沉默或过表达后观察效应指标，而以其他物质干预后观察其表达量改变的研究尚未见报导。以肥胖者和正常人的网膜脂肪组织为研究对象的一项研究发现，肥胖者组织中LYRM1表达较正常人明显增高，且将LYRM1过表达后发现其可以促进细胞增殖[12]。本研究通过不同浓度Res干预3T3-L1前脂肪细胞24 h后发现，Res可明显降低LYRM1在脂肪细胞中的表达，且随着干预浓度的升高，基因表达降低愈加明显。而由于目前LYRM1基因还没有商业化抗体，暂无法对其蛋白表达水平进行检测。联系基因LYRM1本身的功能不难发现，Res可能以该基因为作用靶点，进而达到降低脂肪细胞增殖活性的作用效果。

促凋亡蛋白Bak和抑凋亡蛋白Bcl-2主要存在于线粒体膜上，Bak能被家族中其他的蛋白激活，并在线粒体外膜上形成能释放膜间凋亡因子的孔道，从而导致细胞凋亡。而Bcl-2可以在整个过程中以不同的方式抑制细胞凋亡[13]。研究表明，在成脂分化过程中，Bcl-2表达上调，而Bcl-2过达可降低成熟脂肪细胞的凋亡敏感性[14]；同时Bcl-2过表达可改变线粒体膜通透性，抑制细胞色素C和凋亡诱导因子的释放，从而抑制凋亡的启动[15]。通过对单纯性肥胖的大鼠进行针刺干预来模拟日常生活中的针灸减肥发现，干预组大鼠脂肪细胞内的Bcl-2表达水平降低，脂肪细胞凋亡减少[16]。考虑到蛋白表达水平与细胞成分的生理学作用联系更为紧密，故本研究在蛋白水平对Bak和Bcl-2进行检测。结果发现，Res作用于脂肪细胞可引起促凋亡蛋白Bak的表达升高，并引起抑凋亡蛋白Bcl-2的表达降低，二者都可使细胞保持在较低的增殖水平。研究发现，在LYRM1基因沉默的小鼠脂肪细胞中，线粒体的功能得到改善，ATP生成增多，ROS生成减少[17]；将LYRM1过表达后则发现脂肪细胞中线粒体功能受到损伤，以ATP合成减少、线粒体膜通透性降低、ROS水平升高和抑制葡萄糖转运为表现[18]。线粒体作为细胞凋亡信号的关键点，在接收到来自死亡因子的信号后，外膜发生通透化，分裂蛋白表达增多，融合蛋白表达减少，同时线粒体表面Bcl-2家族成员Bax和Bak被活化，继而引发细胞释放细胞色素c，启动凋亡程序[19-20]。由此可以推测，线粒体很可能是联系LYRM1和Bcl-2家族蛋白的一个枢纽。而在本实验中，LYRM1以何种方式影响线粒体功能从而改变Bak和Bcl-2的表达尚需进一步研究。

综上所述，白藜芦醇可抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖，而这一功能可能是通过降低LYRM1表达，影响线粒体功能进而启动凋亡信号通路完成的。这为白藜芦醇的开发和应用提供了理论依据。

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