姬松茸多糖增强免疫作用及急性毒性研究

王丽娟1,2，张彦青1,2，王 勇2，曹金燕2，李 娜2

（1.天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134；2.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

摘 要：目的：研究姬松茸多糖对小鼠免疫功能的调节作用及急性毒性作用。方法：通过观察姬松茸多糖对小鼠免疫器官的影响及对网状内皮系统廓清血流中惰性碳粒能力的影响，分析姬松茸多糖对哺乳动物的免疫调节作用；采用改进寇氏法研究姬松茸多糖的急性毒性。结果：1）姬松茸多糖（77～150 mg/kg，灌胃，连续7 d）能促进小鼠胸腺和脾脏的增殖，120 mg/kg的姬松茸多糖能使幼鼠胸腺增长13.1%，脾脏增长8.5%，使成年鼠胸腺增长4.0%，脾脏增长18.3%；150 mg/kg姬松茸多糖使小鼠碳粒吞噬指数提高21.7%，吞噬系数增加11.8%，表明姬松茸多糖对小鼠的免疫功能有促进作用。2）静脉注射姬松茸多糖的LD50为840.8 mg/kg，相当于成人一次静脉注射6.5 g，2 周后存活小鼠体质量平均增长61.1%；灌胃给予姬松茸多糖15.0 g/kg，小鼠无一死亡，仅出现轻微的不适，该剂量相当于成人一日摄入115.4 g姬松茸多糖，相当于食入姬松茸881～1 265 g。结论：姬松茸多糖能增强小鼠的免疫调节功能，且急性毒性甚微。

关键词：姬松茸多糖；免疫调节；急性毒性；改进宼氏法

Immune-Enhancing Effects and Acute Toxicity of Agaricus blazei Polysaccharide in Mice

WANG Li-juan1,2, ZHANG Yan-qing1,2, WANG Yong2, CAO Jin-yan2, LI Na2

(1. Tianjin Key Laboratory of Food Technology, Tianjin 300134, China; 2. School of Biotechnology and Food Science,
Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Abstract: Objective: This study aimed to examine the immune-regulatory effect and acute toxicity of Agaricus blazei polysaccharide in mice. Methods: The effects of Agaricus blazei polysaccharide on immunological organs in mice and the ability of the reticuloendothelial system to clear inert carbon particles from bloodstream were observed in order to explore the immunoregulatory effect on mammals. By using an improved Karber’s method, the acute toxicity of Agaricus blazei polysaccharide was studied. Results: Agaricus blazei polysaccharide (77–150 mg/kg, ig, 7 d) could promote cell proliferation in the thymus and spleen. Agaricus blazei polysaccharide at 120 mg/kg caused an increase in proliferation rates of thymus and spleen of 13.1% and 8.5% for juvenile mice and of 4.0% and 18.3% for adult mice, respectively. Agaricus blazei polysaccharide at 150 mg/kg increased the phagocytic index by 21.7% in the carbon particle clearance test, and enhanced the corrected phagocytic index by 11.8% in mice, indicating that Agaricus blazei polysaccharide can promote immune function in mice. The LD50 of Agaricus blazei polysaccharide by intravenous injection was 840.8 mg/kg, equivalent to intravenous injection of 6.5 g of Agaricus blazei polysaccharide into an adult one time. After two weeks, the body weight of the survived mice was increased by 61.1% on average. After oral administration of Agaricus blazei polysaccharide at 15.0 g/kg, only mild discomfort occurred and all mice were alive. This dose is relatively equivalent to an intake of 115.4 g of Agaricus blazei polysaccharide for adults per day, and is also equivalent to an ingestion of 881–1265 g of Agaricus blazei. Conclusion: Agaricus blazei polysaccharide can enhance immune function in mice with minimal acute toxicity.

Key words: Agaricus blazei polysaccharide; immunoregulation; acute toxicity; improved Karber’s method

中图分类号：R151.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）13-0258-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413051

姬松茸（Agaricus blazei Murrill）又称巴西蘑菇、小松菇，原产于美国加利福尼亚州南部、南美巴西等地，是当今世界上可栽培的珍稀食用菌之一，也是一种食药兼用的名贵真菌。姬松茸所含的多糖具有广泛的药理活性，在抗肿瘤活性[1-4]、增强机体免疫功能[5-6]、抗疱疹病毒[7]、影响造血功能和保护肝[8-9]等方面研究较多，而关于姬松茸多糖对哺乳动物免疫功能的影响及应用安全性的研究甚少，其急性毒性未见明确报道。本实验通过观察姬松茸多糖对小鼠碳粒吞噬廓清能力的影响及对小鼠免疫器官胸腺、脾脏指数的影响，分析和判断姬松茸多糖的免疫活性；并观察了灌胃与静脉给予姬松茸多糖的急性毒性作用，对姬松茸的食用安全性及姬松茸多糖的使用安全性做出初步评价，为进一步开发姬松茸提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1 动物

昆明种健康小鼠（合格证号：SCXK津2010-0002），
体质量11～15 g，3～5 周龄；体质量18～22 g，6～8 周龄，雌雄兼用 天津市实验动物中心。

1.2 材料与试剂

姬松茸多糖（纯度40%，配制成实验所需浓度
溶液） 天津市食品研究所；固体明胶 美国Sigma公司；印度墨汁 天津达科生物科技有限公司。

1.3 仪器与设备

UV-7504单光束紫外-可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；AUY120电子分析天平 日本岛津公司。

1.4 姬松茸多糖对小鼠免疫器官胸腺和脾脏指数的影响

取18～22 g和11～15 g小鼠各48 只，均雌雄各半；各按体质量分层随机分为4 组，即生理盐水组，姬松茸多糖低、中、高剂量组（成年鼠：姬松茸多糖低、中、高剂量组分别为96、120、150 mg/（kg•d）；未成年鼠：姬松茸多糖低、中、高剂量组分别为77、96、
120 mg/（kg•d）），每组12 只。各组均按20 mL/kg灌胃给药，每天一次，连续7 d。末次给药后1 h，处死小鼠并进行解剖，取出胸腺、脾脏，吸去表面血迹，用分析天平称其质量，按式（1）计算胸腺和脾脏指数。

胸腺（或脾脏）指数/（mg/g）=

脏器质量/mg

小鼠体质量/g

（1）

1.5 姬松茸多糖对小鼠网状内皮系统吞噬廓清血流中惰性碳粒能力的影响

昆明小鼠48 只，体质量18～22 g，雄性，分组与给药同1.4节。末次给药24 h后，小鼠尾静脉注射4 倍稀释的印度墨汁10 mL/kg，立即记时（注射不成功者舍弃），注射墨汁后30 s及6 min，分别于小鼠眶下采血0.05 mL，吹入4 mL 0.1% Na2CO3溶液中。处死小鼠，取肝脏、脾脏及胸腺，用分析天平称其质量。将溶血的Na2CO3溶液摇匀，在675 nm波长处进行比色，记录吸光度A，按照式（2）计算吞噬指数κ、按照式（3）计算吞噬系数（校正吞噬指数）α[10]及按式（4）计算各指数的增长率。

（2）

（3）

（4）

式中：t1、t2分别表示注入墨汁30 s和6 min；c1、c2表示t1、t2时刻血液中碳粒的浓度；m表示体质量/g；mt表示肝脾及胸腺总质量/g。将用药组与对照组进行比较，分析姬松茸多糖的免疫调节作用。

1.6 静脉注射姬松茸多糖的急性毒性

采用改进寇氏法。经预实验探索出姬松茸多糖静脉注射的100%致死剂量为1 200 mg/kg；0%致死量为560 mg/kg。根据预实验结果确定正式实验分4 个剂量组，并求出对数剂量组间距为 0.110 3，符合要求。

昆明小鼠50 只，体质量18～22 g，雌雄各半，随机分为5 组，每组10 只。1～4 组小鼠尾静脉注射不同剂量的姬松茸多糖，容量均为20 mL/kg，5 组注射等容量的生理盐水。注射后密切观察小鼠的反应及死亡情况。第2天起，每天观察2 次，连续观察14 d。注射后死亡的小鼠立即进行尸检，未死亡的小鼠14 d后进行解剖。统计各组小鼠的死亡数，按照式（5）～（7）计算LD50和LD50的95%可信限。

（5）

（6）

（7）

式中：Xm为最高剂量的对数；i为剂量对数的组间距；P为各组死亡概率（取小数）；n为各组例数，
s

（lgLD50）为lgLD50的标准误。

1.7 灌胃给药测定姬松茸多糖的最大耐受量

经预实验，灌胃给予姬松茸多糖25 mL/kg（0.2 g/mL），共3 次，仅见小鼠出现活动减少、呼吸略显急促，未见其他症状及改变。故正式实验测定小鼠对该剂量姬松茸多糖的耐受程度。

取小鼠20 只，雌雄各半，随机分为2 组，第1组为生理盐水，第2组为姬松茸多糖。各组均以25 mL/kg灌胃给药，24 h内给药3 次，间隔6 h，给药后密切观察小鼠的反应。第2天起每日观察2 次，连续观察14 d。记录小鼠的各项反应、死亡情况及每日摄食量，并于第7天和第14天称量各小鼠的体质量，按照式（8）计算食物利用率。

（8）

1.8 统计分析方法

数据以

±s表示，两组间的显著性检验采用t检验，以P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 姬松茸多糖对小鼠免疫器官胸腺和脾脏指数的影响

表 1 姬松茸多糖对幼年小鼠胸腺指数及脾脏指数的影响（

x

±s，n=12）

Table 1 Effects of Agaricus blazei polysaccharide on the proliferation of thymus and spleen in juvenile mice (

x

±s, n = 12)

表 2 姬松茸多糖对成年小鼠胸腺指数及脾脏指数的影响（

x

±s，n=12）

Table 2 Effects of Agaricus blazei polysaccharide on the proliferation of thymus and spleen in adult mice (

x

±s, n = 12)

由表1、2可知，姬松茸多糖能不同程度地促进小鼠胸腺和脾脏的增殖（与生理盐水组比，均无显著性差异），等剂量的姬松茸多糖对幼年小鼠胸腺指数增长的影响比较明显，而对成年小鼠则主要影响脾脏的增殖。

2.2 姬松茸多糖对小鼠网状内皮系统吞噬廓清血流中惰性碳粒能力的影响

表 3 姬松茸多糖对小鼠碳粒廓清能力的影响（

x

±s，n=12）

Table 3 Effects of Agaricus blazei polysaccharide on the ability of the reticuloendothelial system to clear inert carbon particles from bloodstream (

x

±s, n = 12)

注：与生理盐水组比较，*. P＜0.1；与生理盐水组比较，**. P＜0.05。

由表3可知，各剂量组姬松茸多糖对吞噬指数和吞噬系数的影响均呈规律性增加，具有较明显的剂量依赖性，表明姬松茸多糖能促进小鼠网状内皮系统的增殖，提高机体的非特异性免疫功能。

2.3 静脉注射姬松茸多糖的急性毒性

2.3.1 急性毒性反应

尾静脉注射姬松茸多糖后，出现颤抖、抽搐、呼吸急促、大小便失禁等反应，在注射10 s～1 min内死亡。将死亡小鼠解剖，肉眼观察小鼠的肝、肾、心脏、脾、肾上腺、胸腺等脏器，均未见异常改变。其余小鼠先出现活动减少、呼吸急促、对刺激反应迟钝、嗜睡等现象，但持续十几秒至10 min后逐渐恢复，其余各项观察指标未见异常。观察14 d后，各剂量组存活小鼠体质量平均增长59.7%，与生理盐水组相近。解剖后，各主要脏器未见明显改变，脏器指数各组无明显差别。

2.3.2 LD50及LD50的95%可信限

表 4 姬松茸多糖静脉注射LD50测定结果

Table 4 Results of LD50 by intravenous injection of Agaricus blazei polysaccharide

由表4可知，小鼠静脉注射姬松茸多糖的LD50为840.8 mg/kg，LD50的95%可信限为780.5～906.1 mg/kg。生理盐水组小鼠未见任何不良反应。

2.4 姬松茸多糖灌胃给药的最大耐受量

表 5 灌胃给予姬松茸多糖小鼠体质量及食物利用情况（

x

±s，n=10）

Table 5 Body weight and food utilization ratio affected by orally administered Agaricus blazei polysaccharide (

x

±s, n = 10)

由表5可知，小鼠灌胃后，各组均未见死亡。姬松茸多糖组部分小鼠的表现与静脉注射后相似，出现活动减少，呼吸急促，但仅持续数分钟，其余未见异常，2 周后体质量平均增长61.1%，与生理盐水组（67.2%）相近（P＞0.05），两组小鼠的食物利用率相等。24 h内灌胃姬松茸多糖15.0 g，相当于70 kg成人24 h内食入姬松茸多糖115.4 g，小鼠仅出现轻度不适反应，未见死亡，机体可耐受此剂量。

3 讨 论

3.1 姬松茸多糖对小鼠免疫功能的调节作用

胸腺和脾脏为机体主要的免疫器官。胸腺为初级淋巴器官，游走的造血干细胞进入胸腺，在此分化增殖成T淋巴细胞（T细胞），与细胞免疫有关。脾脏为次级淋巴器官，免疫活性细胞移行于此，并在此处因受免疫过程中异体抗原刺激而进一步增殖分化和成熟，脾脏中有T淋巴细胞和B淋巴细胞（B细胞），与体液免疫、细胞免疫均有密切关系。一些多糖可使胸腺或脾脏增重[10-11]。

网状内皮系统（reticuloendothelial system，RES）是机体最重要的防御系统，它具有强大而迅速的吞噬廓清异体颗粒或某些可溶性异物的能力。当静脉注射特定大小的惰性碳粒后，它即可被RES细胞吞噬而从血流中廓清。因此，可以借助测定血流中碳粒的消失速度来反映RES吞噬异物的能力[10]。

本实验观察了姬松茸多糖对小鼠免疫器官指数及对网状内皮系统吞噬功能的影响。结果显示，给小鼠灌胃姬松茸多糖77.0～150.0 mg/（kg•d），连续7 d可促进小鼠胸腺和脾脏的增殖，对未成年小鼠主要影响胸腺，对成年小鼠主要影响脾脏。90.0～150.0 mg/（kg•d）姬松茸多糖连续灌胃7 d，能促进小鼠网状内皮系统吞噬处理血流中惰性碳粒的能力。上述影响均具有较明显的剂量依赖性，反映了姬松茸多糖对小鼠的非特异性免疫功能与特异性免疫功能均有增强作用。

在日本、中国和韩国，许多食用菌类被用于治疗疾病，如抗肿瘤、抗炎等已有了几百年的历史。蘑菇多糖通过刺激免疫效应细胞，如造血干细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等，调节细胞因子如TNF-α等的分泌，增加信使NO的产生，直接或间接产生抗肿瘤、抗菌消炎等作用；姬松茸多糖还可通过调节激素的水平而抑制肿瘤组织的生长[12-15]。本实验研究结果也为姬松茸多糖的应用提供了一定依据。

3.2 姬松茸多糖的急性毒性

文献报道，腹腔注射姬松茸多糖1 g/kg，连续7 d，小鼠精神状态、饮食良好，无异常反应[9]。将含姬松茸多糖水提取物的饲料（相当于姬松茸2 654～2 965 mg/（kg•d））喂饲大鼠90 d，大鼠无一死亡，未引起明显的毒性[16]。

本实验中，给小鼠静脉注射一定剂量的姬松茸多糖后，部分小鼠出现抽搐、呼吸困难、大小便失禁等，并在1 min内死亡。死亡小鼠尸检，主要脏器肉眼未见病理改变，脏器指数与生理盐水组无明显差别。生存小鼠仅在注射后的短时间内出现活动减少、呼吸急促、对轻微刺激反应迟钝等，10 min内恢复正常。观察期内，小鼠体质量增长与生理盐水组相近。存活小鼠主要脏器未见病理改变。该实验结果显示，姬松茸多糖的LD50为840.8 mg/kg，相当于70 kg成人一次静脉注射姬松茸多糖6.5 g。

小鼠24 h内灌胃给予姬松茸多糖15.0 g/kg（分3 次，间隔6 h），在灌胃后的1 h内，个别小鼠出现轻度的不适。连续观察14 d，小鼠无一死亡，14 d后体质量平均增长61.1%。灌胃姬松茸多糖15.0 g/kg相当于70 kg成人24 h食入纯姬松茸多糖115.4 g。

有文献报道，从姬松茸中提取多糖的得率为9.12%～13.10%[17-18]。据此分析，成人摄入115.4 g纯姬松茸多糖相当于食入姬松茸约881～1265 g，无明显毒性反应；静脉注射姬松茸多糖的LD50为840.8 mg/kg，相当于6.418～9.219 g姬松茸中多糖的含量。

根据实验结果推测，姬松茸与姬松茸多糖的毒性属实际无毒级别[19]，食用安全、可靠，具有进一步研究与开发价值。

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