北五味子木脂素对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

王春梅1，李 贺1，李 生1，陈宝芝1，吴金滢1，陈建光1，高晓旭2,*

（1.北华大学药学院，吉林 吉林 132013；2.北华大学林学院，吉林 吉林 132013）

摘 要：目的：研究北五味子木脂素（Schisandra chinensis lignans，SCL）对酒精诱导小鼠急性肝损伤的保护作用并初步探讨其作用机制。方法：将50 只小鼠随机分为正常对照组、酒精性肝损伤模型组、SCL低剂量组
（25 mg/（kg•d））、SCL高剂量组（50 mg/（kg•d））、阳性对照组（联苯双酯150 mg/（kg•d）），灌胃给药预处理15 d。末次给药1 h，造模组小鼠给予50%乙醇12 mL/kg一次性灌胃，正常对照组给予同体积蒸馏水。12 h后处死小鼠，检测血清中谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性，甘油三酯（triglyceride，TG）水平，肝组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性；HE染色观察肝脏病理学改变。结果：SCL可明显降低酒精致肝损伤小鼠血清ALT和AST活性以及TG水平（P＜0.05），同时使小鼠肝组织MDA含量和NOS活性显著下降，GSH含量提高（P＜0.05）；苏木素-伊红染色结果显示SCL可显著改善酒精引起的小鼠肝细胞水肿、坏死，中央静脉充血等病理损伤。结论：SCL对小鼠酒精性肝损伤具有明显的保护作用，其机制可能与抗氧化有关。

关键词：北五味子木脂素；肝损伤；酒精；氧化应激

Protective Effect of Lignans from the Fruits of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. on
Ethanol-Induced Acute Liver Injury in Mice

WANG Chun-mei1, LI He1, LI Sheng1, CHEN Bao-zhi1, WU Jin-ying1, CHEN Jian-guang1, GAO Xiao-xu2,*

(1. School of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013, China; 2. School of Forestry, Beihua University, Jilin 132013, China)

Abstract: Objective: This study aimed to explore the protective effect of lignans from the fruits of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. (SCL) on acute liver injury induced by ethanol in mice and to reveal the underlying mechanism. Methods: A total of 50 mice were randomly divided into normal control, model, low-dose SCL (25 mg/(kg•d)), high-dose SCL
(50 mg/(kg•d)) and positive control (bifendate, 150 mg/(kg•d)) groups. The mice were intragastrically administered with corresponding drugs, respectively, for 15 days. Then 50% ethanol (12.0 mL/kg) was given to the mice in model groups 1 hour after the last administration. The mice in the normal control group were administered with an equal volume of distilled water. All the mice were sacrificed 12 hours later, and their blood samples were collected. The activities of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) and triglyceride (TG) level in serum as well as the contents of malondialdehyde (MDA) and reduced glutathione (GSH) and nitric oxide synthase (NOS) activity in liver tissues were measured. Hematoxylin and Eosin (HE) staining was performed for observing pathological changes of the liver tissues. Results: SCL significantly decreased the activities of ALT and AST and TG levels in serum (P ＜ 0.05). Meanwhile, the MDA content and NOS activity in liver tissues were reduced significantly whereas the GSH content was significantly increased by SCL (P ＜ 0.05). Moreover, HE staining showed that SCL significantly improved the liver cell edema, necrosis, and central venous congestion. Conclusions: SCL confer a significant protective effect on alcohol-induced acute liver injury in mice, which might be attributed to their anti-oxidant capacity.

Key words: Schisandra chinensis lignans; liver injury; alcohol; oxidative stress

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）13-0262-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201413052

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期酗酒导致的肝脏疾病，其病程进展包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎以及酒精性肝硬化[1]。随着我国经济发展和人们生活方式的改变，ALD发病率呈逐年上升趋势, 成为仅次于病毒肝炎的第二大肝病[2]。虽然对该病的治疗研究和临床经验逐渐增多，但目前除戒酒和支持治疗外尚无理想的防治药物，因此寻找对酒精性肝损伤有保护作用的药物意义重大。五味子（Schisandra chinensis）系木兰科植物五味子的成熟果实，尤其北五味子是著名的长白山道地药材，具有益气生津、补肾养心、收敛固涩等作用[3]。五味子被誉为“护肝降酶之王”，作为我国传统保肝药，多与其他中药配伍用于急、慢性肝损伤的治疗，可以促进损伤肝细胞的修复、降低血清转氨酶活性[4-6]。五味子主要活性成分有木脂素、多糖、萜类等。研究表明五味子木脂素成分对四氯化碳诱导的肝损伤有保护作用[7-9]，藤茎提取物及藤茎总三萜类通过降低血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平可有效防治小鼠酒精性肝损伤[10-11]。但对来源于北五味子种子的总木脂素成分是否具有保护酒精性肝损伤的作用，其机制如何，尚未见报道。本实验采用酒精诱导小鼠急性肝损伤模型，从肝脏病理、肝细胞损伤、肝脏功能及脂质过氧化等方面观察北五味子木脂素（Schisandra chinensis lignans，SCL）对肝脏的保护作用及并探讨其作用机理，以为北五味子开发为防治酒精性肝病的保健食品和药品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级健康ICR小白鼠，雄性，体质量（20±2）g，由吉林大学实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（吉）：2010-0005。分笼饲养，饲料充足，饮水不限，室温20～25 ℃，适应环境5 d后使用。

1.2 材料与试剂

北五味子木脂素由北华大学林学院食品科学与工程实验室优选新品种，采用超临界CO2流体萃取，模仿口服药物在胃肠道的转运过程，选用特定pH值依次连续提取（半仿生法提取）；经分子蒸馏，其蒸馏温度110 ℃、进料速率65 L/h、真空度0.7 Pa；再通过AB-8大孔树脂处理，总木脂素流量1.52 mg/mL、洗脱速率1 mL/min乙醇体积分数95%、洗脱率78.9%）；采用硅胶柱层析法，200～300 目硅胶，以石油醚-乙酸乙酯（60∶1，V/V）洗脱，得木脂素组分，采用紫外分光光度法，在570 nm波长处检测总木脂素，其纯度为93.5%。

联苯双酯滴丸 浙江万邦药业有限公司；谷丙转氨酶、谷草转氨酶、甘油三酯（triglyceride，TG）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）测定试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器与设备

Infinite M200TECAN酶标仪 瑞士Tecan集团公司；JY92-IID超声波细胞粉碎仪/粉碎机 宁波新生生物科技股份有限公司；S10手提式高速分散器 宁波新生生物科技股份有限公司；ESJ110-4B电子分析天平 沈阳龙腾电子有限公司。

1.4 动物分组与处理

ICR小鼠50 只，雄性，18～22 g，随机分为5 组，分别为正常对照组、酒精性肝损伤模型组、SCL低剂量组、SCL高剂量组、阳性对照药（联苯双酯）组。常规饲料喂养，自由饮水。SCL治疗组以体质量为基础分别给予SCL 25 mg/（kg•d）和50 mg/（kg•d）灌胃，阳性对照组给予联苯双酯滴丸150 mg/（kg•d）灌胃，正常对照组和模型组给予同体积蒸馏水灌胃，每日一次，连续15 d。末次给药1 h后，模型组及给药组小鼠给予50%乙醇12 mL/kg灌胃，正常对照组小鼠给予同体积蒸馏水灌胃，禁食，不禁水。

1.5 指标测定

上述小鼠造模12 h后摘眼球取血，每只小鼠约取血0.8～1.0 mL，分离血清，分装入Eppendorf 管，－70 ℃冻存。断髓处死小鼠，迅速剖腹取出肝脏，于冷的生理盐水中洗净血液，滤纸吸干，剪下肝左叶置于10%中性福尔马林中固定，待做病理。取肝组织100 mg，加入9 倍量的生理盐水于冰水浴中制成10%组织匀浆，离心后取上清液置4 ℃保存。按试剂盒说明书进行ALT、AST、TG、MDA、GSH及NOS的检测。

1.6 肝脏病理检测

将标本置入10%甲醛溶液固定后，0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）浸泡过夜，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋，制成4 m石蜡切片。经二甲苯脱蜡及梯度乙醇复水后，进行苏木素-伊红（HE）染色，再进行梯度乙醇脱水，脱水后将组织切片中的乙醇用二甲苯置换出来。最后滴加中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。

1.7 统计分析

采用SPSS 13.0 软件进行统计学处理，数据以

±s表示，多组间比较用单因素方差分析（One Way ANOVA）方法，两组间比较采用最小显著差（least-significant difference，LSD）t 检验，P＜0.05有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 SCL对小鼠体质量的影响

表 1 SCL对各组小鼠体质量的影响（

x

±s，n=10）

Table 1 Effect of SCL on bodyweight in mice (

x

± s, n = 10)

由表1可知，与正常对照组相比，各组小鼠体质量未见明显差异。

2.2 SCL对小鼠血清ALT、AST活性和TG水平的影响

表 2 SCL对各组小鼠血清ALT、AST活力和TG含量的影响
（

x

±s，n=10）

Table 2 Effect of SCL on serum ALT and AST activities and TG content in mice (

x

±s, n = 10)

注：a.与正常对照组相比，差异极显著（P＜0.01）；b.与正常对照组相比，差异显著（P＜0.05）；c.与酒精性肝损伤模型组相比，差异极显著
（P＜0.01）；d.与酒精性肝损伤模型组相比，差异显著（P＜0.05）。下同。

由表2可知，与正常对照组比较，模型组小鼠血清ALT、AST和TG水平均显著升高（P＜0.05或
P＜0.01），表明小鼠急性肝损伤模型制备成功。与模型组比较，SCL高剂量组及阳性药物联苯双酯组小鼠血清ALT和AST水平均明显降低（P＜0.05或P＜0.01），SCL高剂量组血清TG水平降低（P＜0.05），提示SCL对酒精诱导的小鼠肝损伤有保护作用。联苯双酯降低ALT效果优于SCL，但对升高的TG没有影响。

2.3 SCL对小鼠肝组织MDA、GSH含量及NOS活性的影响

表 3 SCL对各组小鼠肝组织MDA、GSH含量及NOS活力的影响
（

x

±s，n=10）

Table 3 Effect of SCL on the levels of MDA and GSH and NOS activity in liver tissues in mice (

x

±s, n = 10)

MDA、GSH及NOS是反应肝脏脂质过氧化的指标。由表3可知，与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织MDA和NOS水平显著升高，而GSH水平明显降低
（P＜0.01），表明酒精致肝损伤小鼠肝脏抗氧化能力降低，氧化应激增加。与模型组比较，SCL低剂量、高剂量和联苯双酯均可显著降低肝组织MDA含量（P＜0.05或P＜0.01），升高GSH水平（P＜0.05或P＜0.01），SCL高剂量可降低NOS活性（P＜0.01），提示小鼠肝脏的氧化应激状况得以改善。

2.4 SCL对小鼠肝脏病理形态的影响

A

B

C

D

E

A. 正常对照组；B. 酒精性肝损伤模型组；C. SCL低剂量组；D. SCL高剂量组；E. 联苯双酯组。

图 1 SCL对小鼠肝脏病理形态的影响（HE染色，×100）

Fig.1 Effect of SCL on liver pathomorphology in mice (HE staining, × 100)

由图1可知，正常对照组肝小叶结构完整，肝细胞条索排列规则，肝中央V及汇管区结构形态正常，肝细胞形态圆形，核位于中央，胞浆分染，形态正常（图1A）。模型组肝细胞水肿，可见肝细胞局部坏死，表现为胞浆染色变混，中央V扩张充血，病变以中央V周围为主，小叶结构完整（图1B）。SCL低剂量组和高剂量组肝小叶结构完整，肝细胞形态基本正常（图1C、1D）。阳性对照组肝细胞形态基本恢复正常（图1E）。

3 讨 论

采用酒精灌胃法建立小鼠急性肝损伤模型，周期短、易复制、死亡率低、稳定性好，且符合人类饮酒所致肝损伤的特点[12]。因此本研究采用50%乙醇12 mL/kg
一次性灌胃建立小鼠急性肝损伤模型，结果显示模型组小鼠血清ALT和AST水平均显著升高，病理结果也显示肝细胞水肿、小叶中央静脉充血等改变，提示造模成功。而给予北五味子木脂素治疗后，小鼠血清ALT和AST出现了不同程度的降低，肝细胞水肿及中央静脉充血减轻，说明北五味子木脂素对酒精所致的小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用。

氧化应激一直被认为是酒精性肝病的重要致病因素[13-14]。乙醇进入机体后首先经肝细胞中的乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）代谢为乙醛，再经乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）代谢为乙酸。乙醇在代谢过程中会产生大量的还原型辅酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），引起NADH/NAD+比例升高、增加了呼吸链中传递的电子流，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）过度产生。此外，酒精还对多种抗氧化物酶和非抗氧化物造成损伤，导致氧化应激，促进酒精性肝病的发生、发展。同时酒精也可激活细胞色素P450，使反应性氧中间产物和脂质过氧化终产物形成增多，从而介导自由基脂质过氧化引起肝脏损伤，并使体内还原型GSH耗竭[15-18]。MDA是反映组织损伤时出现的过强氧化作用的指标之一，组织中含量越高，氧化活性越强，组织受损程度越大[19]。NOS是机体合成一氧化氮（nitric oxide，NO）的关键酶，当NO及活性氧水平均较高时，二者可发生氧化反应，生成细胞毒性很强的过氧亚硝基阴离子，发挥自由基对肝细胞的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、蛋白质和脂质的毒性，引起严重的肝损伤[20]。本实验结果显示模型组小鼠肝组织MDA和NOS明显升高，而GSH水平下降，表明在灌酒后小鼠氧化应激因子迅速发生了改变，引起了肝细胞损伤。北五味子木脂素治疗显著降低了肝组织MDA和NOS水平，并升高GSH水平，对抗自由基脂质过氧化反应，阻止肝细胞脂质过氧化，维持细胞质膜的正常结构，保护肝细胞免受损伤。

机体摄入大量乙醇后，会使三羧循环障碍和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢，乙醇可致α-磷酸甘油增多而促进甘油三酯合成，致使脂肪在肝细胞内沉积。肝脏中蓄积的大量TG以极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）的形式运出肝脏，进入血液，使血中TG含量也相应增加[1]。本实验结果表明模型组小鼠血清TG水平明显升高，北五味子木脂素治疗可降低血中TG水平，改善肝脏的脂肪代谢。

综上所述，北五味子木脂素对酒精诱导的急性肝损伤具有显著的保护作用，其作用机制可能与抗自由基脂质过氧化反应有关。这些结果为将北五味子开发为对肝损伤有保护作用的保健食品和药品提供了重要的实验依据。

参考文献：

[1] ORMAN E S, ODENA G, BATALLER R. Alcoholic liver disease: pathogenesis, management, and novel targets for therapy[J]. Journal Gastroenterology and Hepatology 2013, 28(1): 77-84.

[2] TILG H, DAY C P. Management strategies in alcoholic liver disease[J]. Nature Clinical Practice Gastroenterology & Hepatology, 2007, 4(1): 24-34.

[3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2010: 61-62.

[4] 王骆冰, 闫秀川, 曾贞, 等. 扶正化瘀片与黄芪汤合用对实验性肝硬化大鼠的治疗作用[J]. 中国中药杂志, 2010, 35(13): 1740-1744.

[5] 赵辉平, 李峰, 王胜春, 等. 柴胡、丹参和五味子配伍对CCl4所致肝硬化大鼠的作用及其机制[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2005, 14(6): 610-614.

[6] 陈玮莹, 温博贵, 郑瑞明, 等. 五味子对CCl4中毒大鼠肝细胞核基质蛋白和结构的保护作用[J]. 免疫学杂志, 2006, 22(4): 455-459.

[7] XIE Y, HAO H, KANG A, et al. Integral pharmacokinetics of multiple lignan components in normal, CCl4-induced hepatic injury and hepatoprotective agents pretreated rats and correlations with hepatic injury biomarkers[J]. Journal Ethnopharmacology, 2010, 131(2): 290-299.

[8] KO K M, IP S P, POON M K, et al. Effect of a lignan-enriched fructus schisandrae extract on hepatic glutathione status in rats: protection against carbon tetrachloride toxicity[J]. Planta Medica, 1995, 61(2): 134-137.

[9] HWANG I S, KIM J E, LEE Y J, et al. Protective effects of gomisin A isolated from Schisandra chinensis against CCl4-induced hepatic and renal injury[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2013, 31(4): 8884-898.

[10] 胡彦武. 五味子藤茎对小鼠酒精性肝损伤血清转氨酶的影响[J].食品与药品, 2008, 10(11): 53-54.

[11] 孟先军, 邓静, 朱力杰, 等. 北五味子藤茎总三萜对小鼠酒精性肝损伤的保护作用[J]. 食品科学, 2013, 34(15): 228-231.

[12] 齐慧慧, 宋佳, 陈岳祥. 小鼠急性酒精性肝损伤模型的建立[J]. 世界华人消化杂志, 2012, 20(9): 759-763.

[13] SID B, VERRAX J, CALDEROL P B. Role of oxidative stress in the pathogenesis of alcohol-induced liver disease[J]. Free Radical Research, 2013, 47(11): 894-904.

[14] MIRANDA-MENDEZ A, LUQO-BARUQUI A, ARMENDARIZ-BORUNDA J. Molecular basis and current treatment for alcoholic liver disease[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2010, 7(5): 1872-1888.

[15] DAY C P. Treatment of alcoholic liver disease[J]. Liver Transplant, 2007, 13(11): 69-75.

[16] WU D, CEDERBAUM A I. Alcohol, oxidative stress, and free radical damage[J]. Alcohol Research & Health, 2003, 27(4): 277-284.

[17] DEY A, CEDERBAUM A I. Alcohol and oxidative liver injury[J]. Hepatology, 2006, 43(2): 63-74.

[18] CEDERBAUM A I, LU Y, WU D. Role of oxidative stress in alcohol-induced liver injury[J]. Archives Toxicology, 2009, 83(6): 519-548.

[19] NAIK S R. Antioxidants and their role in biological functions: an overview[J]. Indian Drugs, 2003, 40: 501-516.

[20] MININ E A, BUCHWALOW I B, WELLNER M, et al. L-Arginine-NO-cGMP signaling following acute liver injury in the rat[J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2005, 57(2): 161-171.