高效液相色谱法测定3 种蛹虫草中
虫草素及比较分析

李 琴1，廖红华1，张 驰1,2,*

（1.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；

2.湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000）

摘 要：对3 种蛹虫草中虫草素含量进行高效液相色谱法测定并比较，以查看不同地区来源的蛹虫草中虫草素含量的区别，为选育高含量虫草素蛹虫草菌种及改变其培养条件指明方向。首先采用正交试验研究虫草素的提取条件，获得最适提取工艺，即料液比1∶80、提取时间5 h、提取温度70 ℃，在此条件下虫草素的得率达0.604%（以湖北地区的蛹虫草作为原料）。然后在此条件下分别对湖北地区（A）、云南地区（B）和本实验室培养（C）的蛹虫草中提取虫草素并进行测定，结果表明：样品C的虫草素含量远高于A（6.041 mg/g）和B（7.606 mg/g），为26.071 mg/g。
结果显示，不同产地的蛹虫草中虫草素含量有一定区别，这可能与培养蛹虫草所用的菌种和培养条件差异有关。本研究筛选出来的菌种以及获得的培养方法，对后续研究补硒栽培对蛹虫草中的活性成分虫草素含量的影响提供了技术基础。

关键词：蛹虫草；高效液相色谱法；虫草素

Comparative HPLC Determination of Cordycepin in Cordyceps militaris from Different Locations

LI Qin1, LIAO Hong-hua1, ZHANG Chi1,2,*

(1. College of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China;

2. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

Abstract: A comparative study was carried out to determine cordycepin as one of the active ingredients in the fruit bodies of Cordyceps militaris from different locations in China by HPLC. Using orthogonal array design, the optimal extraction conditions were obtained as follows: 1:80, 5 h and 70 ℃ for solid-to-solvent ratio, extraction time and temperature, respectively. Under the optimized conditions, the fruit bodies of Cordyceps militaris from Hubei province gave rise to a yield of cordycepin of 0.604%. HPLC analysis showed that the fruit bodies of Cordyceps militaris cultured in our laboratory contained 26.071 mg/g cordycepin, much higher than in those from Hubei and Yunnan provinces (6.041 and
7.606 mg/g, respectively). This difference was likely related to the strain and culture conditions. The strain and culture method proposed in this study have the potential to provide the technical foundation for future studies on the influence of selenium-supplemented culture medium on cordycepin content in Cordyceps militaris.

Key words: Cordyceps militaris; high performance liquid chromatography (HPLC); cordycepin

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）14-0118-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201414023

虫草素即3’-脱氧腺苷，分子式为C10H13N5O3，分子质量为249 u，碱性，针状或片状结晶[1]。虫草素是第一个从真菌中分离出的核苷类抗菌素，蛹虫草是300多种虫草中唯一能大量产生虫草素的虫草[2]。虫草素作为蛹虫草的次生代谢产物具有抗菌、抗病毒、干扰人体RNA及DNA合成，显著抑制多种肿瘤生长的作用[3-7]。虫草素还表现出免疫调节、抗衰老、扩张支气管、显著增强肾上腺素等药理作用功能[8-9]。另外，Bellomcik等[10]研究发现，虫草素还具有杀虫作用。有研究[11-13]采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法梯度洗脱测定蛹虫草中虫草素含量取得良好的效果，本研究首先对等度洗脱与梯度洗脱进行对比，发现在本实验室现有的条件下，等度洗脱对虫草素测定的保留时间不能很好的控制，其塔板数也低于梯度洗脱，因此在后续的实验中采用梯度洗脱，测定3 种蛹虫草中虫草素的含量并比较其差异性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3 种蛹虫草子实体分别来自于湖北地区（A）、云南地区（B）、本实验室培养（C）。将3 种样品分别进行烘干（40 ℃）、粉碎（40 目）并密封保存。

甲醇（色谱纯） 日本Dikma公司；虫草素标准品（批号MUST-11072701） 上海雅吉生物科技有限公司；

1.2 仪器与设备

KQ5200E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DZonEX-P860型高效液相色谱仪 戴安中国有限公司。

1.3 方法

1.3.1 虫草素的提取

以料液比、提取时间、提取温度为考察因素，采用正交试验对虫草素提取条件进行研究（以湖北地区的蛹虫草样品作为原料）[14]。

1.3.1.1 单因素试验

料液比对虫草素提取的影响：称取样品0.2 g，置于带塞试管中，选择1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100，10 个料液比水平，超声波处理30 min，60 ℃水浴提取2 h，提取液定容至25 mL。

时间对虫草素提取的影响：称取样品0.2 g，置于带塞试管中，料液比1∶50，选择2、3、4、5、6、7、8 h，7 个时间水平，超声波处理30 min，60 ℃水浴提取，提取液定容至25 mL。

温度对虫草素提取的影响：称取样品0.2 g，置于带塞试管中，料液比1∶50，选择40、50、60、70、80、90 ℃，6 个温度水平，超声波处理30 min，水浴提取5 h，提取液定容至25 mL。

1.3.1.2 提取虫草素的正交试验

以料液比1∶80、1∶90、1∶100三个水平，提取时间3、4、5 h三个水平，提取温度40、50、60 ℃三个水平选择L9（34）正交表进行三因素三水平正交试验。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）流动相：水-甲醇，柱温25 ℃，流速0.8 mL/min，波长260 nm。梯度洗脱如表1所示。

表 1 虫草素测定梯度洗脱顺序表

Table 1 Gradient elution for HPLC analysis of cordycepin

1.3.3 3 种蛹虫草中虫草素的含量测定

1.3.3.1 标准曲线的建立

精确称取10 mg虫草素标品，溶于10 mL容量瓶中，定容至刻度，即为1 mg/mL虫草素溶液。再分别取0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mL上述溶液于5 个10 mL容量瓶中，定容至刻度，经0.2 μm微孔滤膜压滤后，按1.3.2节中色谱条件进行测定。以虫草素标准溶液质量浓度（μg/mL）为X轴，峰面积为Y轴，绘制标准曲线。回归方程：Y=1.486 7X＋1.034，R2=0.999 1，结果表明：虫草素质量浓度在25～125 μg/mL范围内均与峰面积线性关系良好。

1.3.3.2 样品中虫草素含量测定

采用1.3.1节中获得的虫草素最佳提取条件对3 种蛹虫草的虫草素分别进行提取，并按照1.3.2节中的色谱条件对其虫草素得率进行测定。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草中虫草素提取条件的优化

2.1.1 料液比对虫草素得率的影响

如图1所示，随着提取剂比例的增加，虫草素得率随之增大，除1∶20和1∶30料液比水平之间差异不显著外，其余各个水平间有显著差异（P＜0.05）。

图 1 料液比对虫草素得率的影响

Fig.1 Effect of solid to liquid ratio on the yield of cordycepin

2.1.2 提取时间对虫草素得率的影响

如图2所示，随着提取时间的延长，虫草素得率逐渐升高，提取时间为2、3、4、5 h，4 个时间水平时，各水平之间虫草素得率有显著差异（P＜0.05）。当提取时间增加至5 h后，继续延长提取时间，得率无显著差异。

图 2 提取时间对虫草素得率的影响

Fig.2 Effect of extraction time on the yield of cordycepin

2.1.3 提取温度对虫草素得率的影响

如图3所示，当提取温度逐渐从40 ℃升至70 ℃，虫草素得率随温度的升高而逐渐增加。温度在40 ℃和50 ℃两个水平之间得率没有显著差异，而与60、70 ℃两个水平相比，各水平间具有显著差异（P＜0.05）。温度继续升高至80、90 ℃，得率反而减小，80 ℃和90 ℃两水平之间差异不显著。

图 3 提取温度对虫草素得率的影响

Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of cordycepin

2.1.4 虫草素提取条件研究的正交试验

根据表2极差分析结果可知，该正交试验研究的3 个因素：料液比（A）、提取时间（b）和提取温度（c）的R值均大于空列，说明这3 个因素对虫草素得率具有显著影响。其中因素C的R值最大，其次分别是b和A，表明对虫草素得率影响最大的因素是c，次之是b、A。为了分析A、b、c 三个因素各水平对虫草素得率的影响，对该正交试验进行方差分析。由表3可知，提取时间（b）和提取温度（c）的P值均小于0.05，而料液比（A）的P值大于0.05，说明因素b和c对试验结果有显著影响，因素A影响不显著，根据F值大小得出的三因素影响的主次性，与极差分析结果一致。提取虫草素的最合适工艺为A1b3c3，即料液比1∶80、提取时间5 h、提取温度70 ℃，在此条件下虫草素得率达0.604%。最佳工艺条件验证表明，5 次重复实验的平均值为0.615%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值为0.83%，方法重复性好，所获得的最适工艺条件稳定可靠。

取25 μg/mL标品，连续进样5 次，进行精密度实验，结果表明其峰面积RSD值为0.85%，色谱峰保留时间波动在0.01～0.07 min，精密度良好。

稳定性测定结果如表4所示，在不同的时间进样同一份样品，峰面积RSD值为0.20%，稳定性良好。回收率测定结果如表5所示，虫草素回收率在99.72%～100.45%之间，RSD值为0.29%，回收率实验良好，表明本实验中采用的色谱方法准确度较高。

表 2 虫草素提取L9（34）正交试验设计及结果

Table 2 Results of orthogonal array design L9(34) for
cordycepin extraction

试验号	A料液比	B提取 时间/h	C提取 温度/℃	D空列	虫草素得率/%
1	1（1∶80）	1（3）	1（50）	1	0.213±0.001
2	1	2（4）	2（60）	2	0.480±0.001
3	1	3（5）	3（70）	3	0.604±0.002
4	2（1∶90）	1	2	3	0.231±0.001
5	2	2	3	1	0.522±0.002
6	2	3	1	2	0.313±0.002
7	3（1∶100）	1	3	2	0.501±0.001
8	3	2	1	3	0.373±0.002
9	3	3	2	1	0.496±0.001
K1	1.297	1.732	0.899	1.231
K2	1.066	1.375	1.207	1.294
K3	1.370	1.413	1.627	1.208
1	0.432	0.577	0.300	0.410
2	0.355	0.458	0.402	0.431
3	0.457	0.471	0.542	0.403
R	0.101	0.119	0.243	0.029

表 3 虫草素提取条件研究正交试验方差分析表（L9（34））

Table 3 Analysis of variance for orthogonal array design L9(34)

表 4 稳定性测定

Table 4 Stability of the HPLC method

表 5 回收率测定（n=5）

Table 5 Spiked recoveries of cordycepin in real samples (n = 5)

2.2 3 种蛹虫草中虫草素含量的比较

采用HPLC测定蛹虫草样品（A：湖北地区的蛹虫草；B：云南地区的蛹虫草；C：本实验室培养）中的虫草素含量，A和B样品中虫草素含量分别为6.041、7.606 mg/g，远低于C样品中的含量26.071 mg/g，各样品HPLC色谱图如图4所示，虫草素标准品在本实验设置的色谱条件下保留时间为10.80 min，塔板数19 182，而等度洗脱（V（水）∶V（甲醇）=85∶15）[15]保留时间14.82 min，塔板数8 796，因此本实验采用梯度洗脱，峰形良好。测定样品时，虫草素与其他成分分离良好，对其进行回收率测定，平均回收率为99.99%，RSD为0.29%。

A.虫草素标准品

B.湖北地区的蛹虫草虫草素

C.云南地区的蛹虫草虫草素

D.本实验室培养的蛹虫草虫草素

图 4 蛹虫草虫草素HPLC色谱图

Fig.4 HPLC profiles of cordycepinstandard and
Cordyceps militaris samples

3 结论与讨论

本研究通过比较不同地区来源的蛹虫草在虫草素含量上的区别，为选育高含量虫草素蛹虫草菌种及改变其培养条件明确方向。首先通过对蛹虫草中虫草素的提取条件进行研究，获得最佳提取工艺：即料液比1∶80、提取时间5 h、提取温度70 ℃，在此条件下虫草素的得率达0.604%，在此条件下测定3 种蛹虫草样品（A：湖北地区的蛹虫草；B：云南地区的蛹虫草；C：本实验室培养）的虫草素含量，发现各样品中虫草素含量有一定差异，且样品C的虫草素含量明显高于A和B
（P＜0.05）。本实验采用的蛹虫草样品均为人工培养，虫草素含量差异的出现可能与菌种和培养环境的差别有关[16-18]，检测来自湖北地区的蛹虫草硒含量为49.25 μg/g，虫草素含量为6.041 mg/g，本实验室通过不同硒浓度梯度培养的蛹虫草硒含量在35.48～51.66 μg/g时，虫草素在25.930～26.931 mg/g，分析其原因发现，本实验室培养的蛹虫草与购自湖北地区的成品所采用的菌种分离于不同的母种，培养蛹虫草采用的培养条件也有差异。首先，人工培养蛹虫草技术已经实现并趋于成熟，而人工培养的蛹虫草菌种最初也是从野生蛹虫草菌中分离纯化出来的，然后进行扩大培养而获得的。野生蛹虫草生长的环境要求没有冬虫夏草苛刻，其分布的地区较广，各地区自然环境具有一定差异，所以分离出来的蛹虫草菌具有相应的一些差别，如次生代谢产物虫草素的分泌。当然，分离出来的菌种，经过人工诱变[19-20]，也可能会出现一些特别的蛹虫草菌种，如虫草素分泌丰富的蛹虫草菌种。其次，人工培养的蛹虫草各地区采用的培养基可能不同。现阶段，大多数采用大米作为培养基的主体，但其中的C、N含量，激素种类，激素比例等因素使得培养基的组成有很大差别，也可能导致蛹虫草中虫草素含量的不一致。最后，蛹虫草的人工培养工厂化已实现，对于蛹虫草质量品质的把握，虫草素作为检验其品质的指标之一，其含量高低必定会影响蛹虫草产品的市场销售额，因此，各生产基地有必要对所培养的蛹虫草进行抽样测定，并定期更新菌种，以获得高品质蛹虫草。对于补硒对蛹虫草中虫草素含量的影响，贲松彬等[21]研究发现在最优富硒培养条件下，蛹虫草中虫草素含量是非富硒菌丝体的5.8 倍，达2.22 mg/g。本实验室也作了初步研究，同一菌种采用不同硒浓度培养，比较硒和虫草素含量，发现在菌种所能耐受的硒浓度范围内，随着补硒浓度的增加，硒和虫草素含量都逐步增加。在一定硒浓度范围内，硒的增加有利于蛹虫草的生长代谢，蛹虫草的次生代谢产物虫草素分泌增多，在本实验的研究基础上，将做更深一步的研究验证。

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