湘葛一号茎叶中5 种异黄酮成分的
高效液相色谱法定量分析

叶惠煊，李 芝，李小军，黄玮超，谢 霞，刘向前*

（湖南中医药大学药学院，湖南省中药现代化研究重点实验室，湖南 长沙 410208）

摘 要：建立高效液相色谱法同时测定湘葛一号地上部分中5 种异黄酮成分含量的方法。采用AT•LICHROM C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长250 nm，柱温30 ℃。葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素分别在5.00～50.00（r=0.999 4）、1.00～10.00（r=0.999 2）、3.64～36.40（r=0.999 9）、0.50～5.00 μg/mL（r=0.999 8）和0.10～1.00 μg/mL（r=0.999 4）范围内线性良好，检测限分别为0.94、0.24、0.43、0.08 ng/L和0.05 ng/L，定量限分别为2.85、0.73、1.29、0.25 ng/L
和0.15 ng/L。精密度、稳定性和重复性良好，平均回收率分别为100.11%（相对标准偏差（RSD）为1.39%）、99.54%（RSD为1.47%）、98.06%（RSD为0.32%）、101.52%（RSD为1.89%）和101.05%（RSD为0.32%）。该方法快速、准确，操作简单，可用于湘葛一号地上部分5 种异黄酮成分含量的同时测定。

关键词：湘葛一号；高效液相色谱法；葛根素；大豆苷；染料木苷；大豆苷元；染料木素

Simultaneous Determination of Five Isoflavones in Stems and Leaves of Pueraria thomsonii
Benth ‘Xiangge No.1’ by HPLC

YE Hui-xuan, LI Zhi, LI Xiao-jun, HUANG Wei-chao, XIE Xia, LIU Xiang-qian*

(Modernization Laboratory of Traditional Chinese Medicine and Drug, College of Pharmacy,

Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

Abstract: An HPLC method was presented for the simultaneous determination of five isoflavones simultaneously in the aerial (leaves and stems) parts of Pueraria thomsonii Benth ‘Xiangege No.1’. The chromatography was performed on an AT•LICHROM C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) with a mobile phase of methanol-water by gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min, and the detection wavelength was set at 250 nm and the column temperature at 30 ℃. The calibration curves for puerarin, daidzin, genistin, daidzein and genistein were linear in the range of 5.00–50.00 (r = 0.999 4), 1.00–10.00 (r = 0.999 2), 3.64–36.40 (r = 0.999 9), 0.50–5.00 (r = 0.999 8) and 0.10–1.00 μg/mL (r = 0.999 4), respectively. The LODs were 0.94, 0.24, 0.43, 0.08 and 0.05 ng/L, and the LOQs were 2.85, 0.73, 1.29, 0.25 and 0.15 ng/L. The method had good precision, stability and reproducibility, and the mean recoveries for puerarin, daidzin, genistin, daidzein and genistein were 100.11% (RSD = 1.39%), 99.54% (RSD = 1.47%), 98.06% (RSD = 0.32%), 101.52% (RSD = 1.89%) and 101.05% (RSD = 0.32%), respectively. In conclusion, this study has proposed a rapid, accurate and simple method which allows the simultaneous determination of five isoflavones in the aerial parts of Pueraria thomsonii Benth.

Key words: Hu’nan Pueraria thomsonii Benth; high performance liquid chromatography; puerarin; daidzin; genistin; daidzein; genistein

中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）14-0141-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201414027

葛根作为一种重要的药食同源植物，富含葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素等异黄酮类化合物[1]，除具有解肌退热、生津止渴、透疹、通经活络等药用功效外[2]，
还广泛用作食品原料或添加剂[3]。湘葛一号（Hu’nan Pueraria thomsonii Benth）[4]是我国第一个通过杂交选育的葛根新品种，产量高，性状好，目前已在湖南多地大面积推广栽培。

目前，国内外学者对葛根的化学成分[5-9]及其药理作用[10-14]已有比较多的报道，但对其废弃的地上部分鲜有报道。大量的葛根地上部分被废弃，破坏环境且造成极大的资源浪费，如何对葛根废弃的地上部位的合理利用是我们需要思考的问题。现今，已有对三七[15-16]、酸枣[17]、川芎[18]、当归[19]等药、食用资源的地上废弃部分的化学成分进行了研究，并取得了一定的进展。为了综合开发利用葛根资源，系统研究湘葛一号的使用价值，在本课题组研究基础上[20]，本实验进一步采用高效液相色谱法同时测定了不同采收期湘葛一号地上部分茎和叶中葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素5 种异黄酮类化合物，为充分利用湘葛一号地上部分提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

湘葛一号地上部分的茎和叶，于2011年5月至12月采至湖南省常德市湘葛一号种植基地，所有样品粉碎过60 目筛后备用。

葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素（质量分数≥98%，批号分别为110752-200511、111738-200501、111709-200501、111505-200402、111704-200501） 中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1200高效液相色谱仪 美国Agilent公司；AUW220D分析天平 日本岛津公司；FW177中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；予华HH-S型水
浴锅 巩义市英峪予华仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

表 1 梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution program

色谱柱：AT•LICHROM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（V/V），梯度洗脱；流速1 mL/min；检测波长250 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。梯度洗脱程序见表1。在上述色谱条件下，各待测成分分离度良好，色谱图见图1。

1.葛根素；2.大豆苷；3.染料木苷；4.大豆苷元；5.染料木素。

图 1 混合对照品（A）、湘葛一号茎（B）、湘葛一号叶（C）的
高效液相色谱图

Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A), and isoflavones in stems (B) and leaves (C) of Pueraria thomsonii Benth

1.3.2 混合对照品溶液的制备

分别取葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素和染料木苷对照品适量，精密称定，置于同一25 mL量瓶中，加入适量甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.050 0、0.010 0、0.036 4、0.005 0、
0.001 0 mg/mL的混合标准品溶液，备用。

1.3.3 供试品溶液的制备

取湘葛一号茎粉末（201112 S）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数50%乙醇50 mL，密塞，称定质量，80 ℃水浴加热回流50 min，放冷，再称定质量，用体积分数50%乙醇补足减少的质量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

精密量取混合对照品溶液各1、2、4、6、8、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，按1.3.1节色谱条件分别进样10 μL。以峰面积为纵坐标，混合对照品质量浓度为横坐标进行线性回归。按信噪比的3 倍和10 倍考察检测限和定量限，结果见表2。

表 2 5 种异黄酮成分的线性关系

Table 2 Linear equations for five isoflavones

2.2 精密度实验

取同一混合对照品溶液，连续进样6 次，测定峰面积。计算得葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.11%、2.27%、2.63%、2.07%和0.67%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性实验

稳定性实验包括日内稳定性与日间稳定性。取同一供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、8、12、24 h及2、3、4、5、6 d后进样，计算得葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的峰面积RSD分别为0.87%、1.92%、0.72%、1.54%和2.56%，表明供试品溶液在24 h内稳定。计算得葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的峰面积RSD分别为0.55%、0.74%、0.87%、1.28%和2.65%，表明供试品溶液在6 d内稳定。

2.4 重复性实验

取201112 S粉末6 份，按1.3.3节方法制备供试品溶液，分析计算得葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素峰面积的RSD分别为1.45%、1.63%、1.88%、0.64%和1.26%，表明本法重复性良好。

2.5 加样回收实验

取201112 S粉末6 份，每份约1 g，精密称定，分别精密加入适量的对照品混合溶液，按照1.3.3节方法制备供试品溶液，依次测定，分别计算各对照品的平均回收率。结果表明，葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的平均回收率分别为100.11%、99.54%、98.06%、101.52%和101.05%，RSD分别为1.39%、1.47%、0.32%、1.89%和0.32%。

2.6 样品测定

分别精密吸取一年内不同采收期湘葛一号不同部位供试品溶液10 μL，进样测定。分别采用外标法计算葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量。具体数据见表3。

表 3 湘葛一号不同部位含量测定结果比较（n=3）

Table 3 Comparison of isoflavone contents in stems and leaves of Pueraria thomsonii Benth (n = 3)

mg/g

注：S. 湘葛一号茎；L. 湘葛一号叶；LT. 湘葛一号芦头；—. 未检出。

3 讨论与结论

在制备供试品溶液时，笔者考察了不同提取方法（超声和回流），不同提取溶剂（甲醇、体积分数30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇），不同提取时间（30、40、50 min和60 min），不同提取温度（40、50、60、70、80 ℃和90 ℃）等方法。结果表明，本实验最佳提取条件为提取溶剂体积分数50%乙醇、提取温度80 ℃、回流时间50 min。

对一年生不同采收期的湘葛一号茎的主要异黄酮成分含量的比较分析发现：葛根素含量12月＞11月＞9月＞5月＞
10月＞7月＞8月＞6月；大豆苷含量12月＞5月＞11月＞
9月＞8月＞10月＞7月＞6月；染料木苷含量12月＞9月＞11月＞8月＞10月＞5～7月；大豆苷元含量12月＞11月＞8月＞6月＞7月＞10月＞9月＞5月；染料木素含11月＞
12月＞8月＞10月＞5月＞7月＞9月＞6月。总体看出，12月份的茎总异黄酮含量最高，6、7月份的含量相对较低。而5～12月份的湘葛一号叶中5 种异黄酮成分含量虽然均较低，但也呈现一定的动态变化，具体原因有待进一步研究。

由于湘葛一号的植物学特性[21]，其芦头（块根近茎部位约三分之一处）纤维较高，粉性少，在采收时都要将其削除，造成大量的浪费。故本实验还进一步对9月份湘葛一号芦头进行检测（表3），实验发现芦头中除染料木素未检测到外，其余4 种异黄酮成分含量均较高。值得注意的是，其葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量显著高于同时期的茎和叶部，极具综合利用价值，故今后课题组将对不同产地、不同采收期湘葛一号芦头作为研究重点。

本实验方法建立的同时测定湘葛一号地上部分异黄酮成分含量检测方法快速、简便、灵敏度高，可用于湘葛一号废弃部位的含量控制。湘葛一号的茎叶中，尤其是茎中含有相对较高的异黄酮类成分，完全能够变废为宝，作为提取分离这些有效成分的新资源。

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