肠球菌素的分离提取及其在牛乳杀菌中的应用

都立辉，施荣华，张 虹，鞠兴荣

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，江苏 南京 210023）

摘 要：从发酵奶酪制品中分离出1 株耐久肠球菌（Enterococcus durans）41D，其培养过程中产生能抑制李斯特菌生长的肠球菌素。本实验通过pH值吸附法将该肠球菌素分离提纯，产率约为45.7%。并进一步研究发现，当在牛乳中添加终浓度为256 AU/mL的肠球菌素时，不同的处理方式（高温杀菌，巴氏杀菌）不影响实验期间（15 d）肠球菌素抑菌活性的发挥。该肠球菌素在牛乳中应用时能够有效抑制单增李斯特菌的生长并对牛乳有较好的保存效果。

关键词：肠球菌素；分离；提纯；应用

Purification of the Bacteriocin Produced by Enterococcus durans and Its Application in Milk Sterilization

DU Li-hui, SHI Rong-hua, ZHANG Hong, JU Xing-rong

(Jiangsu Key Laboratory of Quality Control and Further Processing of Cereals and Oils, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China)

Abstract: One Enterococcus durans strain designated 41D was isolated from fermented cheese products. The strain produced bacteriocin that can inhibit the growth of Listeria monocytogenes. In this study, a pH absorption method was used to separate and purify the bacteriocin with a yield of about 45.7%. Further investigation suggested that when the bacteriocin was added into milk samples at a final concentration of 256 AU/mL, its antibacterial activity was not affected by different treatments including high-temperature sterilization and pasteurization during the experiment period. When applied in milk, the bacteriocin could effectively inhibit the growth of Listeria monocytogenes. These results have provided the basis for the development of new natural food preservatives using this bacteriocin.

Key words: bacteriocin; absorption; purification; application

中图分类号：TS201.6 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）15-0001-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415001

细菌素是一类由细菌产生的具有抑菌活性的蛋白质或多肽，多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均可产生此类物质[1]，其对目标细菌的抑制具有低浓度和高效性的特点[2]。目前的分类方法将乳酸菌细菌素分为两类[3]：Ⅰ类羊毛硫细菌素[4]和Ⅱ类不含羊毛硫细菌素（包括小分子热稳定多肽以及大分子热不稳定细菌素）。其中Ⅱ类细菌素进一步细分为4 个亚类[5-6]，分别为Ⅱa亚类（类片球菌素），具有抑制李斯特菌属细菌生长的活性；Ⅱb亚类（双肽细菌素）；Ⅱc亚类（环形细菌素）和Ⅱd亚类（非片球菌素线性细菌素）。食品级微生物来源的细菌素作为生物防腐剂的应用符合消费者对于安全、健康和天然的要求。自从乳酸链球菌素（Nisin）通过世界粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO）和世界卫生组织（World Health Organization，WHO）认证，获得首次商业应用以来[7-8]，细菌素的研究一直是相关领域的研究热点[9-10]。

牛乳是一种营养丰富而全面、含有多种人体所需维生素和矿物质等营养成分的全价食品。据报道，中国乳业的发展极为迅猛，过去5 年间牛乳的消费量平均增长了15%，其中液态奶的平均增长率为30%左右。所以，牛乳作为一种适合于各种人群、有着广泛消费群体的大众食品，正越来越受到消费者的重视。由于牛乳的营养成分丰富而全面，所以它也成为容易被微生物利用的一种天然培养基，很多食品腐败菌和病原菌都能在其中生长，使鲜乳及其产品的保存期限大为缩短，质量受到影响[11]。

李斯特菌在环境中无处不在，尤其肉类、蛋类、禽类、乳制品、蔬菜是其良好的宿主。该菌适应能力很强，在4 ℃的环境中仍可生长繁殖[12]，且通常的热加工处理不能使之灭活。该菌属中的单核细胞增生李斯特菌是一种危害性严重的病原菌，由它引起的李斯特菌病致死率超过25%[13-14]。

因此抑制李斯特菌的生长，对控制其对食品的污染，确保食品质量安全具有至关重要的意义。本实验着眼于从发酵乳制品中分离出的一株耐久肠球菌所产生的新型细菌素，前期研究证实该细菌素属于Ⅱa亚类细菌素，具有较强的抑制李斯特菌活性[15-16]。本实验通过对其分离纯化方法以及其在乳制品中的应用进行研究，以期为未来新型的天然食品防腐剂开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

耐久肠球菌41D，由美国农业部东部研究中心馈赠，本实验室保存；单增李斯特菌 江苏省疾病预防控制中心馈赠；牛乳 市售。

TYL培养液：胰蛋白胨3%、酵母粉1%、牛肉膏0.5%、K2HPO4 0.5%，用磷酸调节pH值到6.5。

J-26XP落地式高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；高温灭菌锅 上海申安医疗仪器厂；隔水式恒温培养箱、超净工作台 上海三发科学仪器有限公司；大孔树脂 美国Sigma公司；脑心浸出液肉汤（brain heart infusion broth，BHI） 青岛高科园海博生物技术有限公司；异丙醇 天津科密欧试剂有限公司；其他试剂为分析纯。

1.2 TYL培养基的预处理

按配方配制TYL液体培养基，使用经70%、pH 2.0的异丙醇漂洗并经超纯水平衡的大孔吸附树脂，除去TYL液体培养基中可能与之吸附的杂质。然后再分装3 瓶每瓶300 mL，121 ℃、20 min高温高压灭菌后备用。

1.3 菌株的活化与培养

按1%初始接种量接种保存在－70 ℃的含有10%甘油的肠球菌41D菌株于TYL培养基中，37 ℃厌氧过夜培养用以活化肠球菌。然后再以1%的接种量将活化的肠球菌转接于3 瓶300 mL的TYL培养基中，在隔水式恒温培养箱中37 ℃静置培养18 h。

1.4 肠球菌素的吸附法分离提取与纯化

参照文献[17-19]的方法，本研究中肠球菌素的吸附法分离纯化过程如下：将培养18 h后的肠球菌发酵液收集，4 ℃、12 000 r/min离心20 min取上清液，再通过以70%、pH 2.0的异丙醇漂洗并经超纯水平衡的大孔树脂，使细菌素吸附在大孔树脂上，之后用500 mL、70%、pH2.0的异丙醇洗脱细菌素。同时用100 mL、70%、pH 2.0的异丙醇重新悬浮菌体沉淀，洗涤黏附在肠球菌上的细菌素，4 ℃、12 000 r/min离心20 min取上清。合并两次洗脱液后以75 ℃恒温旋转蒸发至25 mL，通过1 000 D的透析袋透析过夜。再次75 ℃旋转蒸发至25 mL。

1.5 肠球菌素的活性和效价的测定

以单增李斯特菌作为指示菌，从旋转蒸发得到的25 mL肠球菌素中取100 μL进行2 倍稀释（在EP管中加入100 μL的超纯水，然后取100 μL肠球菌素加入超纯水中，混匀后逐级向下稀释），取稀释好的细菌素溶液5μL，滴加到接种体积分数0.5%新鲜的单增李斯特菌的BHI固体培养基上，通过琼脂扩散法检测该梯度细菌素稀释液的抑菌效果。用有抑菌效果的最高稀释倍数表示肠球菌素的效价。为了确定分离纯化效果，取培养18 h时的菌液1 mL，4 ℃、12 000 r/min 离心20 min取上清按上述同样方法测定提纯前的细菌素效价，并计算其细菌素的得率。

肠球菌素的活性/（AU/mL）=2n×（1 000/5） （1）

式中：n为对单增李斯特菌有抑菌效果的最大稀释倍数。

（2）

1.6 不同杀菌方式对肠球菌素抑菌活性的影响

取100 μL的肠球菌素加入装有5 mL牛乳的试管中（终浓度为256 AU/mL），对其分别进行巴氏杀菌（70 ℃水浴，30 min）和高温高压灭菌（121 ℃，15 min）处理，冷却至室温后再加入0.1%的李斯特菌，分别于25 ℃培养箱中培养1、3、5、7、9、10、15 d，然后进行10 倍稀释，取100 μL在BHI固体培养基上涂布，检测牛乳样品中的李斯特菌数量，同时与未进行灭菌处理的样品进行对比。

1.7 不同肠球菌素添加量对其抑制单增李斯特菌的影响

分别取0、100、200、500 μL肠球菌素添加于5 mL的牛乳中巴氏杀菌后再向其中加入0.1%的单增李斯特菌，混匀后分别放入4 ℃和25 ℃培养箱中进行培养，然后在培养1、3、5、7、9、10、15 d后，取样检测样品中的单增李斯特菌菌数。

1.8 不同添加量的肠球菌素在牛乳中的稳定性

分别添加100、200、500 μL的肠球菌素（终浓度分别为：256、512、1 280 AU/mL），于5 mL的牛乳中，将其分别放入4 ℃和25 ℃培养箱中孵育。然后在第1、3、5、7、9、15天取100 μL进行2 倍稀释，取稀释液5 μL，垂直滴加在接种有0.5%新鲜的单增李斯特菌的BHI固体培养基上，检测其抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 肠球菌素的效价分析与分离纯化结果

表 1 细菌素的提取纯化结果

Table 1 Extraction and purification of the bacteriocin

细菌素的效价测定采用2 倍稀释法，在一定浓度范围内，根据抑菌圈的个数能粗略地表示出细菌素的浓度[20]。从发酵液中提取和纯化的细菌素结果见表1。通过吸附法分离纯化后的细菌素的总活有所降低，但效价显著提高，几乎是未分离纯化前的15 倍，得率为45.7%。经过pH值吸附法处理后其效价明显增加，少量添加即可达到高效抑制李斯特菌生长的目的。此吸附法根据pH值沉降原理，当pH 6.0时，大孔树脂吸附细菌素，pH 2.0时使用异丙醇解吸附这一特性进行肠球菌素提取。此方法具有步骤少，成本低，回收率高的特点，与常用的硫酸铵沉淀法比较，此方法重现性好，杂质少[21]。与离子交换柱层析，凝胶过滤层析相比，此吸附法有步骤少，成本低，适合大规模生产的特点。

2.2 不同杀菌方式对肠球菌素抑菌活性的影响

将100 μL的肠球菌素加入到5 mL牛乳中（终浓度为256 AU/mL），现阶段牛乳的处理方式主要是巴氏杀菌和高温高压杀菌法。故本实验考察了这两种方式对肠球菌素的影响，结果见图1。

图 1 不同杀菌方式对肠球菌素抑菌活性的影响

Fig.1 Effects of different heat treatments on the inhibitory activity of the bacteriocin

由图1可知，使用巴氏杀菌和高温高压杀菌对肠球菌素处理后与未经处理的对照相比，其抑制单增李斯特菌的效果几乎没有影响。这一结果说明本实验提取的肠球菌素稳定性好，经过常规的处理后没有影响。本实验用到的肠球菌素含有43 个氨基酸残基，分子质量较小，约5 kD，含有2 个半胱氨酸（Cys）残基，可能形成1 对分子内的二硫键。半胱氨酸以二硫键的形式存在不仅可能对肠球菌素的活性产生影响，而且二硫键还赋予它很高的热稳定性[22-23]，因此本肠球菌素具有成为热加工食品添加剂的巨大潜力。

2.3 不同肠球菌素添加量对其抑制单增李斯特菌的影响

向牛乳中加入不同量的肠球菌素后，在4 ℃和25 ℃条件下，其抑制单增李斯特菌生长的情况见图2，无论在4 ℃还是25 ℃条件下，加入肠球菌素后单增李斯特菌的数量均明显减少，且随着肠球菌素添加量的增加，单增李斯特菌的数目减少得更加剧烈。4 ℃的牛乳中的李斯特菌的数量显著低于25 ℃的情况。在4 ℃时，当肠球菌素添加量为500 μL时（终浓度1 280 AU/mL），其中添加的单增李斯特菌被完全抑制，在整个实验周期各检测时间的活菌数均为0。由此可见，肠球菌素在牛乳中能够抑制李斯特菌的生长，并且随着肠球菌素添加量的增加其抑制效果越好。

图 2 不同肠球菌素添加量在25 ℃（A）和4 ℃（B）条件下对其抑制单增李斯特菌的影响

Fig.2 Inhibitory effects on Listeria monocytogenes of different amounts of the bacteriocin at 25 ℃ (A) and 4 ℃ (B)

2.4 不同添加量的肠球菌素在牛乳中的稳定性

表 2 不同温度和添加量对肠球菌素在牛乳中稳定性的影响

Table 2 Stability of the bacteriocin as a function of temperature and concentration

AU/mL

在牛乳中加入不同量的肠球菌素后，在不同温度下的保存效果如表2所示，经过15 d后，不同添加量的肠球菌素在牛乳中的效价基本没有变化。说明本肠球菌素在牛乳中有良好的保存效果，稳定性较好。

3 结 论

3.1 本实验采用的吸附法分离提取肠球菌素具有重现性好，产品杂质少的优点。通过吸附法分离纯化后的细菌素的总活力有所降低，但效价显著提高，几乎是未分离前的15 倍，细菌素得率为45.7%。

3.2 提取纯化的肠球菌素加入牛乳后，巴氏杀菌和高温高压杀菌都不影响该肠球菌素抑制单增李斯特菌生长的效果，并且在整个实验周期内，肠球菌素的效价没有变化。无论在4 ℃还是25 ℃条件下，肠球菌素均能抑制牛乳中单增李斯特菌的生长，且随着添加量的增加其抑菌效果也增加。值得指出的是：在4 ℃时，向牛乳中加入本实验提取的500 μL肠球菌素（终浓度1 280 AU/mL）能完全抑制单增李斯特菌的生长。

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