层层自组装法制备双重修饰脂质体及其
体外消化稳定性

刘 珍，邹立强，刘 伟*，刘玮琳，牛 静

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

摘 要：以粒径、电位、包覆率、沉淀量为指标，采用层层自组装法制备海藻酸钠（sodium alginate，AL）、壳聚糖（chitosan，CH）双重修饰脂质体海藻酸钠-壳聚糖-脂质体（AL-CH-L），研究AL-CH-L的物化性质、微观形貌及其体外消化稳定性。结果表明：0.6%壳聚糖和0.5%海藻酸钠制备的AL-CH-L平均粒径为（330.6±37.3）nm，分布集中，Zeta电位为（－15.8±0.7）mV，透射电镜观察双重修饰脂质体的外层成功包裹了海藻酸钠和壳聚糖聚合物，呈现典型的核-壳结构。以钙黄绿素为荧光标记物对未修饰和双重修饰脂质体进行体外消化实验，结果表明双重修饰脂质体表现出更高的体外消化稳定性。

关键词：双重修饰脂质体；壳聚糖；海藻酸钠；层层自组装；消化稳定性

Preparation and in vitro Digestive Stability of Double Modified Liposomes through Layer-by-Layer Self-Assembly

LIU Zhen, ZOU Li-qiang, LIU Wei*, LIU Wei-lin, NIU Jing

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Abstract: Sodium alginate (AL) and chitosan (CH) were coated onto liposome through layer by layer self-assembly technique. The physicochemical and morphological characteristics and in vitro digestive stability of AL-CH-L were observed. The results showed that 0.6% CH and 0.5% AL were the best choice to prepare AL-CH-L. Thus, the AL-CH-L revealed a size of (330.6 ± 37.3) nm with a centralized distribution and a zeta potential of (－15.8 ± 0.7) mV, and a polymer film was successfully coated on the surface of liposome as observed under a transmittance electron microscope (TEM). Meanwhile, an obvious core-shell structure was observed. The in vitro digestion experiment carried out using the fluorescence marker calcein showed better digestive stability of AL-CH-L when compared with common nanoliposomes.

Key words: double modified liposome; chitosan; alginate; layer by layer self-assembly; digestive stability

中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）15-0005-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415002

脂质体（liposome）是由磷脂双分子层形成的内部包含水相的封闭囊泡[1]，具有缓释性、细胞亲和性、组织相容性和靶向性等优点[2]，已成功应用于生物医药、化工农业等领域[3]。脂质体用于包裹营养素、酶、食品添加剂、食品抗菌剂等食品运载体系显示出诱人前景[4]，然而脂质体作为一种微粒分散体系，在贮藏过程中存在着颗粒絮凝、粒径易变大、药物渗漏等问题[2]。近年来，为了增加脂质体双层膜结构和体内外释放的稳定性，通过物理化学作用在脂质体表面包覆蛋白、多糖或者其他物质来修饰脂质体的研究成为热点。自组装技术是分离或交联的组分在适当条件下自发地形成有序结构的过程[5]，层层自组装技术是基于溶液中带有相反电荷的物质交替吸附形成自组装多层膜，由于这种技术操作条件的温和性（室温、常压和在水溶液中进行）和对物化性质的可控性，使得其发展迅速[6]。本实验在采用动态高压微射流技术制备纳米脂质体（nano liposomes，NL）改善其结构稳定性的基础上[7]，进一步采用聚电解质层层自组装技术，以海藻酸钠（algin，AL）中分子链上大量的羧基为负电荷，以壳聚糖（chitosan，CH）分子链上大量的伯氨基为正电荷，通过正、负电荷静电作用层层交替形成聚电解质膜，组装在纳米脂质体模板表面。壳聚糖和海藻酸钠是存在于自然界中天然线性多糖[8]，一些学者对壳聚糖-海藻酸钠复合物修饰运载体系进行了研究，如Ai Yuefei等[9]制备了壳聚糖-海藻酸钠微胶囊；Tarane等[10]制备了海藻酸钠-壳聚糖纳米颗粒，但是基于壳聚糖与海藻酸钠双重修饰脂质体的研究依旧甚少。

消化稳定性是评价脂质体性质以及应用的重要指标，其又分为体内消化稳定性和体外消化稳定性，其中体外消化稳定性主要是通过模拟人体胃肠液环境来展开研究。Parmentier等[11]利用模拟人体肠液以脂质体粒径和磷脂的消化变化来研究了脂质体的稳定性；Carafa等[12]利用一种多糖对脂质体进行修饰，研究了其在模拟胃肠道环境中的释放性；Filipovic-Grcic等[13]制备了壳聚糖-脂质体，证实了其在模拟胃液中的稳定性高于未修饰脂质体。前期实验通过考察不同来源磷脂制备的脂质体在体外消化过程中粒径、电位、微观结构和膜渗透性等的变化，研究了脂质体的结构完整性[14-15]。在前期实验的基础上，双重修饰脂质体的体外消化稳定性有待于进一步展开。

本实验采用动态高压微射流技术制备NL，以粒径、电位、分散系数、包覆率和沉淀量为指标，根据单因素实验得到最优质量浓度的CH-L后再优化制备海藻酸钠-壳聚糖-脂质体（AL-CH-L），并对AL-CH-L的物化性质（粒径、电位、分散系数、微观形貌等）进行表征；同时采用荧光标记技术，通过考察包覆于脂质体内部的荧光物质钙黄绿素的释放[16]和脂质体粒径、电位的变化比较了AL-CH-L和NL的体外消化稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆磷脂（P3644）、胆固醇（C75209）、壳聚糖（448869）、海藻酸钠（A0682）、胃蛋白酶（P7125）、胰液素（P1750）、钙黄绿素（C0875） 美国Sigma公司；乙醇、VE、吐温-80等均为分析纯；磷酸缓冲液（pH 7.4）。

1.2 仪器与设备

动态超高压均质机（微射流） 廊坊通用机械有限公司；RE-2000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；NICOMP380/ZLS激光纳米粒度分析仪 美国PSS公司；D37520高速冷冻离心机 美国Thermo Scientific公司；Delta320 pH计 瑞士梅特勒-托利多仪器(中国)有限公司；Tecnai G2 Spirit透射电镜 日本Jeol公司；Agilent 5500原子力显微镜 美国Agilent公司；电子分析天平 奥豪斯国际贸易有限公司；IKA RCT磁力搅拌器、漩涡混匀器 广州仪科实验室技术有限公司；超纯水系统 美国Millipore公司；FP-6200荧光光度计 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 空白NL的制备

根据Bangham等[17]方法制备粗脂质体：将磷脂、胆固醇、吐温-80和VE按照质量比6∶1∶1.8∶0.12混合加入无水乙醇中，在40 ℃条件下用磁力搅拌器混匀，待脂类物质完全溶解后于真空条件下旋转蒸发除去乙醇形成薄膜，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗膜，得到粗脂质体悬浊液。在120 MPa压力下经动态高压微射流处理二次即得到纳米脂质体[7]。

1.3.2 CH-L的制备

CH-L的制备参考Mady[18]、Gonzaléz-Rodríguez[19]等的方法，分别取不同质量浓度的pH 5.5的壳聚糖溶液（0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2 g/100 mL）按照体积比1∶1进行修饰脂质体，将脂质体缓慢滴入壳聚糖溶液中，边搅拌边加入，滴加完毕后使用NaOH、HCl稀溶液调节CH-L的pH 5.5，静置1 h让其充分反应。以粒径、电位和包覆率为指标，考察并分析确定最优质量浓度的壳聚糖，得到最优配方的CH-L。其中，利用试剂盒方法进行包覆率的测定[20]：取适量的壳聚糖包覆的脂质体溶液在
15 000 r/min转速下离心1 h，使包覆的CH-L充分沉淀。用等体积的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，得到CH-L溶液。通过测定离心前后的磷脂含量来确定CH-L的制备的优化工艺。按照式（1）计算包覆率。

（1）

式中：m为沉淀物中磷脂含量/g；m0为总磷脂含量/g。

1.3.3 AL-CH-L的制备

在优化条件下制备CH-L样品基础上，分别取不同质量浓度的pH 5.5的海藻酸钠溶液（0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2 g/100 mL）进行第2层修饰脂质体，按照体积比1∶1，将最优配方的CH-L，逐滴加入至海藻酸钠溶液中，边搅拌边加入，滴加完毕后使用NaOH、HCl稀溶液调节AL-CH-L溶液的pH值至5.5，静置1 h让其充分反应。得到的双重修饰脂质体在3 000×g离心15 min，过滤后称量沉淀物质量。以粒径、电位和沉淀量为指标，确定最优质量浓度的海藻酸钠。利用称量法按式（2）计算得到沉淀的质量。

m= m1－m0 （2）

式中：m1为离心管与沉淀的总质量/g；m0为离心管质量/g；m为沉淀的质量/g。

1.3.4 AL-CH-L的性质表征

1.3.4.1 平均粒径、分散系数和表面电荷的测定

取适量AL-CH-L用磷酸缓冲液稀释3倍，未修饰的脂质体稀释10倍，利用NICOMP380/ZLS激光纳米粒度分析仪测定平均粒径、分散系数及Zeta电位。

1.3.4.2 微观形貌的表征

利用原子力显微镜和透射电镜观察AL-CH-L和未修饰脂质体的微观形态特征。将稀释适当倍数后的样品滴加到云母片上，室温过夜干燥后置于原子力显微镜下观察。将适量稀释后的样品，滴于铜网上，使用2%醋酸铀负染4 min，过量的液体用滤纸吸干，室温干燥后置于透射电镜下观察脂质体形态。

1.3.5 AL-CH-L的体外消化稳定性研究

模拟胃液的制备：2 g氯化物溶解于蒸馏水中，加入浓盐酸，稀释至1 L，调节pH 1.2；模拟肠液的制备：6.8 g K2HPO4溶190 mL 0.1 mol/L NaOH中，胆汁质量浓度为0.2 mg/mL，稀释至1 L，调节pH 7.4。在消化实验之前，模拟胃液与模拟肠液放置在37 ℃恒温水浴中95 r/min持续搅拌[21]。

钙黄绿素的释放率[14]：制备荧光标记物钙黄绿素的纳米脂质体，方法参照1.3.1节，同时采用壳聚糖、海藻酸钠对其进行双重修饰得到AL-CH-L。AL-CH-L与模拟胃液或模拟肠液按体积比4∶3混合，未修饰的脂质体则按照体积比1∶3加入模拟胃液、模拟肠液，37 ℃恒温水浴振荡，分别从加入胃蛋白酶、胰蛋白酶液时开始计时，每隔0、1、5、15、30、60、120 min取出适当样品，使用荧光光度计在激发波长480 nm、发射波长525 nm处测定荧光强度，按式（3）计算钙黄绿素的释放率。

（3）

式中：It为时间t测定的荧光强度；I0为0 min时的荧光强度；Imax加入2%曲通破乳后测定的总荧光强度。

2 结果与分析

2.1 AL-CH-L的制备条件优化

图 1 CH-L的粒径、电位、包覆率随CH质量浓度的变化

Fig.1 Changes in particle size, zeta potential and coating efficiency of CH-L with chitosan concentration

CH修饰后改变了纳米脂质体的粒径分布、带电性和包覆率。由图1可知，未修饰的NL粒径为（79.8±3.8）nm，
表面带有负电荷为（－6.7±1.2） mV，随着CH质量浓度的增大，CH-L的平均粒径逐渐增大至（255.8±34.8） nm；Zeta电位由负电反转为正电，当CH质量浓度为0.6 g/100 mL时，电位增大至（2.3±0.7）mV。随后变化不大；同时，当CH质量浓度为在0.1 g/100 mL时，CH-L的包覆率曲线达到拐点随后趋于平稳。然而，由于0.1 g/100 mL CH修饰得到的CH-L带电量仅为
（－0.075±1.1）mV，接近中性，与AL的静电作用则很弱。综合分析粒径分布、带电性和包覆率等指标，确定使用0.6 g/100 mL的CH为制备单层修饰脂质体CH-L的最佳质量浓度。

CH是由甲壳素经脱乙酰作用得到的α-（1,4）-2-氨基-β-D-葡萄糖，结构中含有大量的伯氨基—NH2，由于CH-NH3+的pKa值为6.5[22]，在本实验中，制备的NL其疏水尾部聚集在一起，亲水头部暴露在水相，磷脂双分子层的表面极性头带有负电而使用pH 5.5的CH进行第一层修饰时，按Motwani等[23]报道，在此pH值条件下，CH氨基质子化得到－NH3+，形成阳离子聚合物，通过静电作用或疏水作用与脂质体的磷脂极性头结合[24]，从而在NL表面形成稳定的离子-聚合物层获得CH-L。

由于CH在胃液的强酸性环境中溶解性很强，单纯的采用CH修饰脂质体并不能满足提高其稳定性的需要，因此本实验采用AL再次修饰pH 5.5的CH-L。AL是β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸通过β-1,4糖苷键连接形成的一类线性链状阴离子聚合物[10]，呈碱性，当加入高pH值的AL时，CH的质子化程度减弱并且会沉淀析出，所以调节AL使其pH值为5.5，在此条件下AL的羧基离子化形成—COO－[23]。并且调节双重修饰后的溶液使其pH值依旧为5.5，在pH 5.5的条件下，CH的氨基质子化形成
－NH3+和AL羧基离子化形成—COO－，二者通过静电作用在修饰脂质体（CH-L）的外层上层层组装形成聚合物层（AL-CH）而获得双重修饰脂质体AL-CH-L。在实验中，AL修饰后，AL-CH-L的粒径分布和带电量发生再次改变，并且AL与游离的CH之间形成大量的聚合物导致了沉淀的产生。

图 2 AL-CH-L的粒径、电位、沉淀量随AL质量浓度的变化

Fig.2 Changes in particle size, zeta potential and sedimentation amount of AL-CH-L with sodium alginate concentration

由图2可知，当AL质量浓度低于0.5 g/100 mL时，得到的AL-CH-L的带电量较低；当AL质量浓度为0.5 g/100 mL时，AL-CH-L的粒径为（330.6±37.3）nm，带电量达到最大（－15.8±0.7）mV；当AL质量浓度继续增大至2.5 g/100 mL，粒径突变达到（3 229.7±203.4）nm，
且分散很不均匀，系数达到0.8。另外，从制备过程中沉淀量的变化曲线可知，当AL附着在CH-L外层时，沉淀量随着AL的质量浓度增加发生变化。在低质量浓度的AL加入时，AL修饰CH-L的程度较低，随着质量浓度增大到0.5 g/100 mL时，AL与CH-L的结合增强，同时AL与游离的CH作用同步增强，导致形成的沉淀量增加。随着体系中AL质量浓度的继续增大至1 g/100 mL，制备得到的AL-CH-L粒径达到（1 170.3±404.5） nm，并且其带电量低于0.5 g/100 mL AL-CH-L。此时AL与游离的CH作用愈加明显，其相互缠结的更为紧密，导致暴露的带电基团减少，体系中的带电量的减少引起聚合物之间相互排斥力的减弱，故而1 g/100 mL AL修饰时形成的相对沉淀量增加到最大。此后相对沉淀量一直减小，这可能是由于AL的质量浓度继续增大，缠结的沉淀更为紧致导致其吸收的水分更少，故而引起相对沉淀物的质量逐渐减小。由此综合分析确定0.5 g/100 mL AL制备
AL-CH-L效果最佳。

2.2 AL-CH-L的微观形貌

利用激光纳米粒度仪，原子力显微镜和透射电镜，以未修饰的NL作为对照组，对制备的层层自组装脂质体AL-CH-L的微观形貌进行了表征。

图 3 未修饰的NL（a）和AL-CH-L（b）的原子力显微镜3D图

Fig.3 Atomic force microscopic images of NL (a) and AL-CH-L (b)

由图3可知，NL颗粒清晰，粒径为（79.8±3.8）nm，大小及分布皆比较均匀（图3a）；而制备的AL-CH-L粒径较大，粒径为（330.6±37.3）nm（图3b）。溶液中除了突起的大颗粒AL-CH-L外，还有分散着许多附着物。实验中发现AL-CH-L制备过程中产生了些许沉淀物，原子力显微镜3D形貌同时也验证了制备过程中沉淀量的变化。

a

b

图 4 未修饰的NL（a）和AL-CH-L（b）的透射电镜图

Fig.4 Transmission electron micrographs of NL (a) and AL-CH-L (b)

由图4可知，未修饰脂质体NL呈球形，并且分布较均匀，可知其成型较好（图4a）；而双重修饰脂质体
AL-CH-L呈球形，结构完整，粒径明显大于未修饰的脂质体，并且呈现出典型的核-壳结构，内层为饱和度较高的亮白色，外层覆盖上较为透明的聚合物层（图4b）。据Mady等[18]报道，采用壳聚糖修饰薄膜分散法制备的脂质体也会出现这样的核-壳结构。

为进一步验证本实验中AL-CH-L的形成，选择实验中的AL-CH-L、CH-L和NL样品进行粒径分布的对比，结果如图5所示。

图 5 NL、CH-L和AL-CH-L的粒径分布

Fig.5 Particle size distribution of nanoliposome, CH-L and AL-CH-L

根据纳米粒度仪测得的NL、CH-L和最优配方下的AL-CH-L粒度分布图（图5）可知，修饰后的脂质体粒径明显高于未修饰的脂质体。NL的平均粒径为
（79.8±3.8）nm，CH-L的平均粒径为（158.2±4.4）nm，这与Mady等[18]报道的壳聚糖修饰后的脂质体粒径较修饰前增大（92±27.1）nm一致，而本实验在此基础上再次修饰上AL后，制备的AL-CH-L粒径增加到
（330.6±37.3）nm，明显大于壳聚糖-脂质体与纳米脂质体。可见，AL-CH聚合物层的存在，明显改变了脂质体微粒的大小及分布。

2.3 体外消化稳定性

在模拟人体胃肠液环境中，通过测定分析NL和
AL-CH-L随消化时间的性质变化（平均粒径、分散系数和Zeta电位）和包裹的荧光物质钙黄绿素的释放曲线，从而比较脂质体修饰前后的消化稳定性。结果如表1和
图6所示。

表 1 NL和AL-CH-L在模拟胃肠液中消化120 min后的粒径、分散系数和电位值

Table 1 Particle size, PDI and zeta potential of NL and AL-CH-L after 120 min of digestion in SGF and SIF

由表1结合2.2节的结果可知，在模拟人体胃液环境中消化120min后，NL和AL-CH-L的粒径和电位变化均较小，NL的粒径由（79.8±3.8）nm
变化为（80.2±6.3）nm，AL-CH-L的粒径由
（330.6±37.3）nm变化为（299.5±15.2）nm；NL的电位由（－6.7±1.2）mV变化为（－4.4±0.6）mV，AL-CH-L的电位由（－15.8±0.7）mV变化至（－17.9±0.2）mV，
可见其均呈现较好的稳定性，这与Rowland等[25]的报道一致，即大多数的脂质体在通过胃液低pH值的环境时受到的影响较小。在模拟人体肠液环境中消化120min后，两种脂质体则呈现不同的变化：NL粒径由（79.8±3.8）nm增大为（124.1±12.1）nm，
AL-CH-L的粒径则由（330.6±37.3）nm变化至（513.6±15.0）nm；NL的电位由
（－6.7±1.2）mV变化至（－32.2±6.0）mV，AL-CH-L的电位由（－15.8±0.7）mV变为（－22.2±0.2）mV，可见NL电位明显增大，其变化较AL-CH-L更为明显。AL-CH-L在肠液中粒径增大，可能是在pH 7.4的环境下，CH质子化的程度降低，带电量减少，CH与AL的静电结合作用则减弱，导致了结构的松散和溶液介质渗透进粒子内部，故而粒径增大；AL-CH-L消化120 min后带电量没有明显变化，NL的带电量则表现为明显增大，原因可能是NL在胰蛋白酶和胆酸盐的协同作用下，NL中磷脂的有序结构容易被破坏，引起脂质体的聚集融合，导致了粒径的增大，同时磷脂的水解产物覆盖在脂质体表面或者破坏后的脂质体与胆酸盐结合形成囊泡，导致了其带电量的增加[12]，而AL-CH-L在肠液中，因为受到AL-CH聚合物层的保护，其电位变化较小。

图 6 NL和AL-CH-L中钙黄绿素在模拟胃肠液中的释放

Fig.6 Calcein release from nanoliposome and AL-CH-L in SGF and SIF

由图6可知，在SGF中，两种脂质体的结构未受到太多破坏，钙黄绿素的释放量少且区别不是很明显，均表现出很好的稳定性。然而，在肠液中，消化15 min后，NL中钙黄绿素的释放为（35±9）%，而AL-CH-L中其释放率仅为（15±1）%，消化120 min后，NL中钙黄绿素释放率为（58±2）%，而AL-CH-L释放率仅为（38±2）%，并且从整个释放曲线可以看出，AL-CH-L中钙黄绿素的释放率始终明显低于NL。在NL中，脂质体中磷脂经过水解，形成了不稳定的微束结构[12]，导致了脂质体膜的通透性增强，故而钙黄绿素的释放增加。AL-CH-L中钙黄绿素释放率的逐渐增加，可能是因为AL属于肠溶性壁材，在胃液中，制备的AL-CH-L因AL的不溶性保护了脂质体，表现出结构较稳定；而在肠液中，AL逐渐溶解，包埋物也逐渐释放。综合分析可以看出，AL与CH在脂质体外层形成的保护层，可以在一定程度上提高脂质体在胃肠液中的稳定性。

3 结 论

壳聚糖和海藻酸钠作为天然多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒性，可作为脂质体安全的修饰剂材料。本实验采用层层自组装技术成功制备了海藻酸钠-壳聚糖双重修饰脂质体，通过原子力显微镜、透射电镜和激光纳米粒度仪对AL-CH-L的形貌和性质进行表征，并比较了修饰前后脂质体的体外消化稳定性，结果表明AL-CH-L较NL显示出更好的体外消化稳定性。后期可以研究包埋多种模型药物来进一步考察层层自组装脂质体的稳定性。

参考文献：

[1] WANG Ting, WANG Ning, WANG Tongyan, et al. Preparation of submicron liposomes exhibiting ef?cient entrapment of drugs by freeze-drying water-in-oil emulsions[J]. Chemistry and Physics of Lipids, 2011,164 (2):151-157.

[2] MOHANRAJ V J, BARNES T J, PRESTIGE C A. Silica nanoparticle coated liposomes: a new type of hybrid nanocapsule for proteins[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2010, 392 (1/2): 285-293.

[3] BARENHOLZ Y. Liposome application: problems and prospects[J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science , 2001, 6(1): 66-77.

[4] MOZAFARI M R, JOHNSON C, HATZIANTONIOU S, et al. Nanoliposomes and their applications in food nanotechnology[J]. Journal of Liposome Research, 2008, 18(4): 309-327.

[5] WHITESIDES G M, BONCHEVA M. Beyond molecules: self-assembly of mesoscopic and macroscopic components[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, 99(8): 4769-4774.

[6] YUAN Weiyong, FU Jinhong, SU Kai, et al. Self-assembled chitosan/heparin multilayer ?lm as a novel template for in situ synthesis of silver nanoparticles[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2010, 76(2): 549-555.

[7] YANG Shuibin, LIU Wei, LIU Chengmei, et al. Characterization and bioavailability of vitamin C nanoliposomes prepared by film evaporation-dynamic high pressure micro?uidization[J]. Journal of Dispersion Science and Technology, 2012, 33(11): 1608-1614.

[8] LI Sha, WANG Xiangtao, ZHANG Xiaobin, et al. Studies on alginate-chitosan microcapsules and renal arterial embolization in rabbits[J]. Journal of Controlled Release, 2002, 84(3): 87-98.

[9] AI Yuefei, GUO Shuang, ZHANG Qi, et al. preparation of chitosan/alginate microcapsules by high-voltage electrostatic method[J]. Frontiers of Chemistry in China, 2011, 6(1): 48-53.

[10] TARANE G, MOHAMMAD R K, EBRAHIM A, et al. Evaluation of alginate/chitosan nanoparticles as antisense delivery vector: formulation, optimization and in vitro characterization[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 77(3): 599-606.

[11] PARAMENTIER J, THOMAS N, MÜLLERTZ A, et al. Exploring the fate of liposomes in the intestine by dynamic in vitro lipolysis[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2012, 437 (1/2): 253-263.

[12] CARAFA M, MARIANECCI C, ANNIBALDI V, et al. Novel O-palmitoylscleroglucan-coated liposomes as drug carriers: development, characterization and interaction with leuprolide[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2006, 325(1/2): 155-162.

[13] FILIPPOVIC-GRCIC J, SKALKO-BASNET N, JALSENJAK I. Mucoadhesive chitosan-coated liposomes: characteristics and stability[J]. Journal of Microencapsulation, 2001, 18(1): 3-12.

[14] LIU Weilin, YE Aiqian, LIU Chengmei, et al. Structure and integrity of liposomes prepared from milk- or soybean-derived phospholipids during in vitro digestion[J]. Food Research International, 2012, 48(2): 499-506.

[15] LIU Wei, LIU Weilin, LIU Chengmei, et al. Medium-chain fatty acids nanoliposomes for easy energy supply[J]. Nutrition, 2011, 27(6): 700-706.

[16] SHIMANOUCHI T, ISHII H, YOSHIMOTO N, et al. Calcein permeation across phosphatidylcholine bilayer membrane: effects of membrane fluidity, liposome size, and immobilization[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2009, 73(1): 156-160.

[17] BANGHAM A D, STANDISH M M, WATKINS J C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids[J]. Journal of Molecular Biology, 1965, 13(1): 238-252.

[18] MADY M M, DARWISH M M, KHALIL S, et al. Biophysical studies on chitosan-coated liposomes[J]. European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 2009, 38(8): 1127-1133.

[19] Gonzaléz-Rodríguez M L, BARROS L B, PALMA J, et al. Application of statistical experimental design to study the formulation variables in?uencing the coating process of lidocaine liposomes[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2007, 337 (1/2): 336-345.

[20] ZARU M, MANCA M L, FADDA A M, et al. Chitosan-coated liposomes for delivery to lungs by nebulization[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2009, 71(1): 88-95.

[21] YE Aiqian, CUI Jian, SINGH H. Effect of the fat globule membrane on in vitro digestion of milk fat globules with pancreatic lipase[J]. International Dairy Journal, 2010, 20(12): 822-829.

[22] CHELLAT F, TABRIZIAN M, DUMITRIU S, et al. in vitro and in vivo biocompatibility of chitosan–xanthan polyionic complex[J]. Journal of Biomedical Materials Research, 2000, 51(1): 107-113.

[23] MOTWANI SK, CHOPRA S, TALEGAONKAR S, et al. Chitosan-sodium alginate nanoparticles as submicroscopic reservoirs for ocular delivery: formulation, optimisation and in vitro characterization[J]. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2008, 68(3): 513-525.

[24] GUO J, PING Q, JIANG G, et al. Chitosan-coated liposomes: characterization and interaction with leuprolide[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2003, 260(2): 167-173.

[25] ROWLAND R N, WOODLEY J F. The stability of liposomes in vitro to pH, bile salts and pancreatic lipase[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism, 1980, 620(3): 400-409.