工蜂采集蜂胶的行为观察及胶源植物的研究

胡 浩1,2，董 捷2，张红城2，曾晓雄1,*

（1.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；
2.中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部农产品加工中心蜂产品加工分中心，北京 100093）

摘 要：蜂胶中大约50%成分来自植物树脂，不同地区的蜂胶具有不同的植物来源。本实验通过对工蜂采集蜂胶的行为进行观察，并运用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对加拿大杨树芽的树脂（简称加杨芽脂）、采胶工蜂后足上的树脂和蜂箱中蜂胶的多酚类成分进行分析。结果表明：加杨芽脂、工蜂后足上的树脂和蜂胶不仅在物理状态上非常接近，而且在化学成分及其相对含量上也很相似。因此，中国蜂胶的胶源植物是黑杨派中欧洲黑杨以及它的杂交品种——加拿大杨。

关键词：高效液相色谱；蜂胶；胶源植物；加拿大杨芽脂

Behavior Observation of Worker Bees Collecting Propolis and Plant Origin of Propolis

HU Hao1,2, DONG Jie2, ZHANG Hong-cheng2, ZENG Xiao-xiong1,*

(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;

2. National R&D Centre for Bee Product Processing, Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

Abstract: Propolis is generally made up of 50% plant resins, and its variety depends on plant origins in the location where honeybees collecte propolis. In this study, it was observed that honeybee workers collected resin from the bud of Populus canadensis Moench, carried the red resin with their hind legs and then removed the pieces of red resin inside the hive. Furthermore, the bud resin of Populus canadensis Moench, resinous substance collected from honeybees’ hind legs and propolis in bee houses were extracted separately with aqueous ethanol solvent for the analysis of polyphenolic components via high performance liquid chromatography (HPLC). The results suggested that their similarity displayed not only in physical properties but also chemical components as well as relative content of each component. Thus, the plant origin of Chinese propolis can be Populus canadensis Moencha, a hybrid variety of Populus nigra L.

Key words: high performance liquid chromatography; propolis; plant origin; bud resin of Populus canadensis Moench

中图分类号：S896 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）15-0054-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415011

蜂胶是工蜂采集植物组织分泌的树脂，并混合蜂蜡、花粉和自身分泌物等物质，最终得到的一种具有特殊气味的黏性混合物[1]。蜂胶的化学成分复杂，并具有多种生物学活性[2]，如抗氧化[3]、抗癌[4]、抗血糖[5]、抗菌[6]等。蜜蜂用蜂胶填补蜂箱的缝隙来加固蜂箱以及涂抹在蜂箱表面来抑菌，从而提高整个蜂群抵抗病原微生物的能力[2,7]。不同气候条件下生长的产胶植物不同，蜜蜂采集蜂胶的植物来源也不一样[8-11]。不同的胶源植物导致了蜂胶的化学成分存在差异，从而最终影响到蜂胶的生物学活性[12]。目前研究报道北半球温带地区的蜂胶属于杨树型，其植物来源是杨属中的黑杨派杨树；黑杨派又分为欧洲黑杨和美洲黑杨两个种，以欧洲黑杨作为蜂胶的胶源植物最为常见[13]。我国饲养的采胶蜜蜂主要是意大利蜜蜂（Apis mellifera），其在欧洲采集欧洲黑杨的树脂生产蜂胶[14]。原产于我国本土的黑杨很少，仅在阿尔泰地区有欧洲黑杨的天然林分布，及新疆地区生长着美洲黑杨的一个小种[15]，但我国引种的黑杨派间杂交品种，如加拿大杨（简称加杨）、健杨、72杨等分布很广泛[16]。我国杨树人工林70%以上都是黑杨派杂交树种[16]。我国的杨树资源非常丰富，从新疆到东部沿海，从黑龙江、内蒙古到长江流域均有分布，现已成为世界上杨树人工林面积最大的国家。目前，虽然普遍认为我国的蜂胶属于杨树型[17-18]，但关于工蜂采集蜂胶的一系列过程以及具体采自何种杨树，至今尚无详细报道。本实验通过观察在北京香山地区意大利蜜蜂的工蜂采集蜂胶的行为，以及采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析蜂胶、采胶工蜂后足上的树脂和加拿大杨树芽的树脂（简称加杨芽脂）的多酚类成分，来研究蜂胶的植物来源。从而为建立中国蜂胶化学成分的质量标准提供相应的依据，具有重要的实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

加杨芽脂：在北京植物园内采集分泌芽脂的新鲜加拿大树芽，置于－80 ℃冰箱中1 h，取出置于密封袋中轻轻敲打，脱落下来的红色物质即为加杨芽脂，置于
－20 ℃中贮存；采胶工蜂后足上的树脂 用镊子在从蜂箱中捕获的采胶工蜂的后足上刮取，置于－20 ℃中贮存；蜂胶：用刮刀刮自于饲养在中国农业科学院蜜蜂研究所（北京植物园，香山）内的蜜蜂蜂箱中，并置于
－20 ℃中贮存。

甲醇（CR） 美国Fisher公司；乙醇 北京试剂公司；乙酸（色谱级） 西陇化工股份有限公司；实验中所用的标品均购自Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

Milli-Q Intergral纯水/超纯水一体化系统 美国Merk Millipore公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；KQ-50DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TDL-5 型低速离心机 上海安亭科学仪器厂；微量移液器 德国Eppendorf公司；HZS-H型水浴摇床 哈尔滨市东明医疗仪器厂；LC-6AD高效液相色谱仪（配有二极管阵列紫外检测器(PDA)、SIL-自动进样器、CTO-10A柱温箱、LCsolution数据处理系统） 日本岛津公司；SONY DSC-T900
相机 日本Sony公司。

1.3 方法

1.3.1 蜜蜂采集蜂胶行为的观察

本实验于2013年6月1日—7月31日期间对饲养在中国农业科学院蜜蜂研究所内的6箱蜜蜂进行观察，并用照相机记录工蜂采集树脂及其携带树脂回巢后在蜂箱中的行为。期间内每周检查3次蜂箱，每次观察的时间段分布在上午9时至下午18时之间。如在蜂箱中发现有携带树脂的蜜蜂，则进行观察记录，并收集粘在工蜂的后足上的树脂样品。此外，在北京植物园中分别采集新鲜的毛白杨（Populus tomentosa Carr）、河北杨（Populus hopeiensis Huet Chow）、小叶杨（Populus simonii Carr）、钻天杨（Populus nigra varitalica）、加拿大杨（Populus canadensis Moench）的树芽，插在距离蜂箱周围1 m的空地上，连续10 d对工蜂采集蜂胶的行为进行观察（每天必须是新鲜采集的树芽）。

1.3.2 蜂胶、采胶工蜂后足上的树脂和加杨芽脂的处理

准确称取0.5 g蜂胶、采胶工蜂后足上的树脂和加杨芽脂于10 mL的容量瓶中，用75%乙醇溶液定容到10 mL。超声3 h，功率100 W，温度25℃。超声完后，在40 ℃、100 r/min水浴摇床中提取12 h。离心收集提取液，0.22 µm微孔膜过滤，待用；上样前稀释6 倍。

1.3.3 HPLC色谱条件

HPLC条件：Shim-Pack PREP-ODS（250 mm×
4.6 mm，5 μm）色谱柱；柱温箱温度35 ℃；检测波长280 nm；进样量10 μL；流动相：B相 甲醇（0.1%乙酸），A相 水（0.1%乙酸），梯度洗脱程序如下：0～25 min，22%～36% B；25～55 min，36%～52% B；55～90 min，52%～63% B；90～115 min，63%～70% B；115～135 min，70%～75% B；135～150 min，75%～80% B；流速为1 mL/min。

2 结果与分析

2.1 工蜂采集蜂胶行为的观察

蜜蜂具有3对足，分别是前足、中足和后足，它们的大小和形状都不一样，最具特色的是前足上的净角器及工蜂后足上的花粉采集器和花粉框[19]。花粉框是用来承载花粉的，但也用来运输蜂胶。目前已经报道蜂胶是工蜂用上颚从植物组织上采集下来，在装入花粉框中时，并不使用花粉钳，而是使用前足和中足把树脂收集起来，直接放在后足花粉框内[19-20]。

a

b

c

d

a.在加拿大杨树芽上采集树脂的工蜂；b.后足上携带大量树脂的采胶工蜂；c.通过来回摆动后足卸下树脂的采集蜂；d. 粘在蜂箱上的粘满蜂胶的覆布。

图 1 工蜂采集蜂胶行为的观察

Fig.1 Photographs of resin-collecting activity of worker bees

图1为记录工蜂采集蜂胶行为的照片。观察表明工蜂采集蜂胶并不像采蜜和花粉那样每天都会大量采集，而是间隔一段时间采集一次。同时还发现，对于本实验所用的5种杨树树芽中，工蜂只采集加杨树芽分泌的树脂作为其蜂胶的植物来源。加杨是黑杨派中欧洲黑杨和美洲黑杨的杂交品种，其具有和欧洲黑杨树脂成分相近的树脂，同时加杨能在树芽上分泌大量的树脂，而其他杨树分泌树脂的量和化学成分都具有很大差异[21]。此外，加杨在我国分布范围很广，其他种类的杨树则分布则相对集中[15]。因此，引进我国的蜜蜂在长期进化过程中选择加杨替代欧洲黑杨作为新的胶源植物，并不会随意选择其他杨树来替代加杨作为胶源植物[22]。

通过观察发现，工蜂首先找到表面分泌有树脂的加杨树芽，然后通过口器上颚咬住并来回撕扯得到树脂，通过前足、中足把树脂最终传递到放入后足的花粉框中（图1a）。从图1b可以明显地看到，采集蜂胶的工蜂返回蜂巢时，在其两只后足上有液态的红色物质。从外观上可以判断此物质不是花蜜或花粉，只可能是树脂。因为蜜蜂采集花蜜是通过吸食到胃部来运输的，花蜜不可能出现在后足上；蜜蜂采集花粉虽然也是由后足上的花粉框运输，但其是颗粒的并成团状，此物质是液态的，而且具有很大的黏性，所以也不是花粉。图1c中心处的工蜂（箭头指出）正在用后足前后摆动来卸掉后足上的树脂。通过观察发现，采集蜂胶的工蜂回巢后，会在蜂脾上反复地来回走动。一方面工蜂在寻找到合适的位置，用前足把身体固定在蜂脾上，采用后足来回摆动磨蹭并和腹部产生一些摩擦，靠自身的力量卸下树脂。其次是利用走动，通过部分卸下来的粘在蜂脾上的树脂，拉扯下一部分仍粘在后足上的树脂，这也解释了在蜂脾上梁上为什么会散落很多一滴滴的红色树脂。最后，采胶工蜂通过来回走动，引起蜂脾上其他工蜂的注意，从而其他工蜂会聚集在其周围，用上颚咬住其后足上的树脂，并拉扯下来，由于树脂黏性很大，此时常会被拉成一条很细长的丝。通过以上3种方式，工蜂最终能完全卸下后足上的树脂，但整个过程是很耗时费力的。从图1d可以看出，最终散落在蜂脾及蜂脾上梁的树脂，再由工蜂用上颚运输，并与蜂蜡、花粉和自身的分泌物混合一起制成蜂胶涂抹在蜂箱内壁上及空隙处。蜂胶具有很大的黏附力，蜂箱上的覆布会被紧紧地黏在蜂箱上。

在两个月的观察中发现，雨后蜂箱中的蜂胶会明显增多，而且一般在雨后次日容易观察到蜜蜂的采胶行为（图1中照片拍摄于雨后次日上午）。这可能是因为雨后蜂箱中的缝隙会增大、增多，造成蜂箱渗水；此外，雨后蜂箱也较潮湿，容易染菌。因此工蜂在雨后次日采胶比较多，可能与其生活习性有关。另一方面，也可能和加杨树芽分泌树脂的生理习性有关[16]，雨后加杨芽脂的分泌量会增加，且比晴朗天气时的黏性要小，利于工蜂采胶。

图2是在北京植物园内采集的分泌树脂的新鲜加杨树芽。杨树的树脂是由特定组织分泌的，属于构成型树脂[22]。大多数杨树树脂由杨树托叶中的表皮细胞分泌出来，并贮存在表皮细胞与托叶表面上包裹着一层角质层间的空间内；当分泌达到一定量的时候，角质层会破裂，表皮细胞分泌的树脂就会流出到树芽的表面[22]。加杨树分泌树脂的过程属于这种类型。加杨芽脂富含酚酸和黄酮类物质[23]，属于酚类树脂，其大部分化学成分是非挥发性的，具有保护加杨的嫩芽和幼叶避免受到害虫的啃食及抑制水分快速挥发等生理作用[22]。通过对加杨树芽分泌树脂的观察，发现每年的5—8月加杨树上新生的嫩芽表面会包裹着大量液滴状的红色树脂。在图2可明显看出，绿色加杨树芽的表面上粘有一滴红色的树脂。加杨芽上的树脂与图1b中采胶工蜂后腿上携带的树脂在颜色和状态上都很相似，也都具有很强的黏性。此外二者还都具有相似的芬香气味。因此从物理性质上观察，工蜂后足上的树脂很可能是来自加杨芽脂。

图 2 加杨树芽分泌的树脂

Fig.2 Photograph of bud resin secreted by Populus canadensis Moench

2.2 加杨芽脂、工蜂后足上的树脂和蜂胶的HPLC图谱

1.水杨苷；2.3,4-二羟基苯甲醛；3.水杨醇；4.香草酸；5.咖啡酸；6.香兰素；7. P-香豆酸；8.阿魏酸；9.异阿魏酸；10.苯甲酸；11.水杨酸；12.柚皮素；13.芦丁；14.3,4-二甲氧基肉桂酸；15.肉桂酸；16.桑色素；17.4-甲氧基肉桂酸；18.5-甲氧基短叶松素；19.短叶松素；20.槲皮素；21.木犀草素；22.山姜素；23.山奈酚；24.亚桂皮乙酸；25.芹菜素；26.异鼠李素；27.松属素；28.短叶松素-3-乙酸酯；29.柯因；30.咖啡酸苯乙酯；31.高良姜素；32.山奈素；33.球松素；34.柚木柯因；35.肉桂酸肉桂酯。

图 3 混合标准品（a）、加杨芽脂（b）、工蜂后足树脂（c）和
蜂胶（d）的HPLC图谱

Fig.3 Chromatograms of standard mixture (a), ethanol extracts from bud resin of Populus canadensis Moench (b) and resin collected from honeybee hind legs (c) and propolis (d)

由图3可知，加杨芽脂、工蜂后足树脂和蜂胶中都富含酚酸、黄酮和相应的酯类[23-25]。除蜂胶中短叶松素-3-乙酸酯的峰（76 min）较后足上的树脂和加杨芽脂中的高外，三者的图谱非常接近，无论是在化学物质的种类，还是在各物质间的相对含量上。使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件》计算三者间的相似度，得到加杨芽脂与工蜂后足上的树脂的相似度为0.977，蜂胶与加杨芽脂为0.896，蜂胶与工蜂后足上的树脂为0.911，三者之间的相似度都比较高。加杨芽脂与工蜂后足上的树脂的相似度非常高（0.977），说明二者的化学成分非常接近，基本上是同一种物质，表明工蜂采集的就是加杨芽脂。蜂胶与工蜂后足上的树脂的相似度（0.911）比蜂胶与加杨芽脂的（0.896）要高，这说明工蜂后足上的树脂比加杨芽脂在化学组分上更接近蜂胶。从上面研究可以发现，工蜂采集蜂胶的过程是由加杨芽脂到工蜂后足上的树脂，再到蜂箱中的蜂胶。在这个过程中，可能是工蜂在采集加杨芽脂的时候就混入了少量的其他物质，才导致了采胶工蜂后足上的树脂与蜂胶的成分更为接近。因此，从三者的HPLC图谱可以判断，工蜂是采集加杨芽脂作为蜂胶。但要更详细地说明三者之间相似度的关系，则需要建立相应的指纹图谱。本课题组目前已经完成了中国蜂胶指纹图谱；由于工蜂采集蜂胶及加杨分泌树脂具有季节性，工蜂后足树脂和加杨芽脂的指纹图谱正在完善中。

2.3 加杨芽脂、工蜂后足上的树脂和蜂胶醇提物中多酚类成分的定量

通过标准品建立标准曲线，对加杨芽脂、工蜂后足上的树脂和蜂胶醇提物的成分进行定量分析。从表1可以看出，三者的醇提物在多酚成分种类及含量上都很接近，其中主要成分包括3,4-二甲氧基肉桂酸、松鼠素、短叶松素-3-乙酸酯和柯因等物质，这些基本是杨树型蜂胶的特征成分[12,19]。加杨芽脂的总酚酸和总黄酮含量分别是153.63 mg/g和154.84 mg/g，与采胶工蜂后足上的树脂的总酚酸含量（169.39 mg/g）和总黄酮的含量（157.45 mg/g）
很接近，并且二者的多酚类成分种类也非常接近。蜂胶中的总酚酸和总黄酮分别是95.43 mg/g和123.82 mg/g，比加杨芽脂和工蜂后足树脂的总酚酸和总黄酮都要低，但所含的物质种类和各物质含量之间的比例与它们中的都很接近。然而在单个成分含量比较中，加杨芽脂和后足上树脂中的短叶松素-3-乙酸酯相对于松属素的含量比大约都为1∶1，蜂胶中的短叶松素-3-乙酸酯相对于松属素的含量比大约为2∶1，蜂胶中的短叶松素-3-乙酸酯的含量有所增加。此外，前二者中的5-甲氧基短叶松素和短叶松素与松属素的含量比大约都为2∶1∶4，而蜂胶中的则为1∶1∶4，说明蜂胶中的5-甲氧基短叶松素的含量有所下降。推测蜂胶中短叶松素-3-乙酸酯含量的增高可能是由于蜂胶在贮存过程中部分5-甲氧基短叶松素发生了一系列的反应，生成短叶松素-3-乙酸酯。但其中具体是怎样的过程，以及是否还存在其他物质对短叶松素-3-乙酸酯含量的增高有所贡献，则需进一步研究。

表 1 加杨芽脂、工蜂后足树脂和蜂胶醇提物中多酚类化合物的含量

Table 1 Polyphenolic contents of ethanol extracts from bud resin of Populus canadensis Moench and resin collected from honeybee hind legs and propolis

mg/g

注：—. 未测定到该物质。

蜂胶中约含55%的树脂、30%的蜂蜡、10%的挥发性油和5%的花粉等物质[1]。由表1可知，蜂胶与加杨芽脂及后足上树脂的总酚酸和总黄酮含量的比例大概分别为3∶5∶5和4∶5∶5。通过换算得到蜂胶中的总酚酸约占加杨芽脂或后足上树脂总酚酸的60%，约占总黄酮的80%。这样的比例与蜂胶中含有55%的树脂的结论的比较接近，说明蜂胶是蜜蜂在采回蜂巢的树脂中添加了大约一半的其他物质所制得的。此外，蜂胶中总酚酸与总黄酮的含量比例大约为3∶4，而加杨芽脂和工蜂后足上的树脂中的含量比为1∶1，大体接近；但蜂胶中总黄酮相对总酚酸较多，这可能是因为蜜蜂在蜂胶中添加了富含黄酮类的物质或蜂胶在蜂箱的贮藏过程中物质发生了某些变化所造成的。虽然蜂胶、加杨芽脂和后足上树脂中的各个化学组分的含量存在一定差异，但三者的化学组分在整体上还是非常相似的。因此从多酚类成分的含量上，也可推断出工蜂是采集加拿大杨树芽分泌的芽脂作为蜂胶的植物来源。

总之，加拿大杨是黑杨派中欧洲黑杨和美洲黑杨的杂交品种，其具有和欧洲黑杨树脂成分相近的树脂，同时加杨能在树芽上分泌大量的树脂，而与其他杨树分泌树脂的量和化学成分相比，都具有很大差异[23]。此外，加杨在我国分布范围很广，其他种类的杨树则分布则相对集中[16]。因此可以认为引进我国的意大利蜜蜂，在长期进化过程中有目的地选择加杨替代欧洲黑杨作为新的胶源植物，而不会随意地选择其他杨树作为胶源植物[25]。

3 结 论

通过对饲养在北京香山地区蜂箱中工蜂采集蜂胶的行为，进行观察。发现了工蜂用口器采集加杨芽脂、在后足花粉框中携带树脂以及在蜂箱中卸下后足上树脂的过程。再通过HPLC对加杨芽脂、采胶工蜂后足上的树脂和蜂胶的化学成分进行分析并定量，发现三者在多酚类成分组成和含量上也基本一致。本实验结果表明，中国蜂胶的胶源植物是黑杨派中欧洲黑杨以及它的杂交品种——加拿大杨树。

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