富硒小麦提取物中硒含量及其抗氧化特性

赵 萍，刘笑笑，王 雅，张 轶，郭 涛

（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050）

摘 要：为研究富硒小麦的富硒水平和硒的赋存形态，选用兰州高硒地区生产的富硒小麦为原料，通过超声、离心、透析的方法将富硒小麦中的有机硒和无机硒分离，用火焰原子吸收光谱法测定小麦硒水平。结果表明，富硒小麦硒的主要赋存形态是有机态，占总硒的84.36%。有机态硒主要为硒蛋白（54.46%），硒多糖次之，少量为硒核酸和其他有机态硒。在蛋白态硒中，清蛋白和谷蛋白硒含量较高，分别占总硒的19.46%和16.83%。抗氧化性分析结果表明，多糖相对于蛋白和核酸提取物，具有更长的诱导时间、更高的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和Fe3+还原力。皮尔逊相关性分析表明，小麦富硒提取物抗氧化能力与其硒含量之间表现为显著的正相关性。

关键词：富硒小麦；赋存形态；硒含量；火焰原子吸收光谱法；抗氧化能力

Selenium Content and Antioxidant Activity of Selenium-Enriched Wheat

ZHAO Ping, LIU Xiao-xiao, WANG Ya, ZHANG Yi, GUO Tao

(School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China)

Abstract: In order to investigate selenium (Se) levels and speciation in Se-enriched wheat, organic and inorganic selenium (Se) from wheat samples grown in Lanzhou were separated by ultrasonic pretreatment, centrifugation and dialysis and determined by flame atomic absorption spectrometry. The results showed that Se existed mainly in organic form, accounting for 84.36% of the total Se in Se-enriched wheat. The organic Se was mainly bound to protein (54.46%), followed by polysaccharide, and a small amount of Se was bound to nucleic acid or other organic components. Albumin and glutelin comprised 19.46% and 16.83% of total Se-containing proteins, respectively. The results of antioxidant activity showed that the polysaccharides had longer induction time and higher 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and reducing activity than protein extracts and nucleic acid extracts. Pearson correlation analysis indicated that the antioxidant capacity of Se-enriched wheat extracts had a significant positive correlation with Se contents.

Key words: selenium-enriched wheat; speciation; selenium content; flame atomic absorption spectrometry; antioxidant capacity

中图分类号：TS210.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）15-0094-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415019

自由基理论认为，在生物体内，氧化还原反应所产生的羟自由基，可以引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，损伤膜结构及功能并引起各类疾病[1]，超氧阴离子与羟基结合后的产物能损伤生命大分子而导致各种疾病。自由基是引起机体衰老的根本原因，因此消除体内多余自由基以延长寿命已成为共识[2]。

硒是生物体必需的微量元素[3]，也是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成成分，它可以保护机体不受由自由基引起的氧化性损伤的损害[4]，对机体的生长发育、免疫机能和抗氧化性发挥重要作用[5-6]。硒缺乏会导致心脏病、肌肉萎缩和人体机能的紊乱，这些情况也同样存在于一些动物物种当中[7]。通过膳食摄入硒（1 mg/d）是必需的[8]，但高浓度的硒会使人中毒。研究认为有机硒比无机硒的毒性低且吸收率高，有机硒在体内存在的形式主要有硒蛋白、硒多糖和硒核酸等[9]。

生长在高硒土壤上的植物硒含量显著高于缺硒或低硒土壤上生长的同种植物。兰州皋兰地区属于天然高硒地区，小麦是中国人最主要的食物之一。探讨富硒小麦硒的赋存形态、富硒水平、抗氧化能力及之间的关系，能够为充分开发和利用高硒地区的富硒小麦这一宝贵资源提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

陇春3030富硒小麦 产地：甘肃河西地区 甘肃省农业科学院提供；硒标准溶液 甘肃省质监局；Ni(NO3)2溶液：用体积分数为1%的HNO3配制，质量浓度为
10 mg/mL；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美国Sigma公司；VC 天津市医药工业技术研究所；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Z-5000火焰原子吸收光谱仪（带火焰发生装置、硒空心阴极灯） 日本岛津公司；CAPY 50紫外-可见分光光度计 美国瓦里安公司；743油脂氧化仪 瑞士万通公司；DG120粉碎机 瑞安市春海化学设备制造厂；TD-5-A离心机 上海安亭科学仪表制造厂；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；RE52-86A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 硒的测定方法

采用火焰原子吸收光谱法[10]，仪器工作主要参数为：硒空心阴极灯；波长196 nm，灯电流14.5 mA，狭缝宽度1.3 nm，火焰高度12.5 mm，空气流量5.0 L/min，乙炔流量1.5 L/min。

1.3.1 硒标准曲线的制备

分别取0、1、3、4、6 mL 质量浓度为100 ng/mL的硒标准储备液于25 mL比色管中，加入1 mL Ni(NO3)2溶液（质量浓度为10 mg/mL），定容至刻度。配制成质量浓度为0、4、12、16、24 ng/mL的硒标准液并测定吸光度。

1.3.2 富硒小麦样品含硒量的测定

精确称取待测样品1.000 0 g于定氮瓶中，加数粒玻璃珠，缓慢加入10 mL混合酸（HNO3与HClO4体积比为4∶1），冷消化过夜后于电炉上消化至产生大量白烟，将消化液转移至50 mL容量瓶中，洗涤定氮瓶，合并洗液，加2 mL Ni(NO3)2 溶液[11]，定容至刻度，测定硒含量。

1.3.3 无机硒含量的测定[12]

准确称取1.000 0g样品，置于圆底烧瓶内，加入用4 mol/L HCl 30 mL，然后于170 ℃条件下加热，回流20 min，冷却后用定量滤纸过滤杂质，定容，得滤液，测得滤液中的硒含量即为样品中无机硒含量。

1.4 富硒小麦富硒组分的提取

1.4.1 富硒小麦中蛋白组分的提取

1.4.1.1 富硒小麦中蛋白组分的提取工艺

1.4.1.2 蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[13]。

1.4.2 富硒小麦中多糖组分的提取

1.4.2.1 富硒小麦中多糖组分的提取工艺

1.4.2.2 多糖的测定方法

采用苯酚-硫酸法[14-15]并在此方法基础上加以改良。

1.4.3 富硒小麦中核酸组分的提取

1.4.3.1 富硒小麦中硒核酸的提取工艺

富硒小麦粉碎脱脂过筛→95 ℃水浴，NaCl提取→抽滤→浓缩上清液→脱蛋白→HCl调pH值至2.5→4 ℃静置12 h→离心→95%乙醇淋浇沉淀→真空冷冻干燥→核酸粉末

1.4.3.2 硒核酸含量的测定

采用紫外吸收法测定核酸含量[16-17]。

1.5 提取液脱蛋白方法的选择

分别采用Sevag法[18]和三氯乙酸法[18]对样品提取液进行脱蛋白，并比较两种方法蛋白清除率和硒的损失率。

（1）

式中：T为粗提液中硒含量与总硒含量之比；T1为脱蛋白液硒含量与总硒含量之比。

（2）

式中：R为粗提液中蛋白百分含量；R1为脱蛋白液中蛋白百分含量。

1.6 抗氧化性的研究

将富硒小麦不同提取物进行抗氧化实验，并与VC进行比较。

1.6.1 对DPPH自由基清除能力的测定

通过测定被测化合物清除DPPH自由基的能力来分析样品的抗氧化性。对参考文献[19]作少量修改，精确吸取不同质量浓度的样品溶液2.000 mL，与2.000 mL质量浓度0.025 mg/mL的DPPH溶液和2.000 mL无水乙醇混合，摇匀后放置30 min。以无水乙醇为对照，用分光光度计分别测定上述溶液在517 nm波长处的吸光度。用对应质量浓度的VC作比较实验。

（3）

式中：Ai为样液与DPPH溶液混合的吸光度；Aj为样液的吸光度；A0为DPPH溶液的吸光度。

1.6.2 总还原力的测定

被测化合物的总还原力参考文献[20]并作少量修改。分别取不同质量浓度的样液2.5 mL于试管中，以蒸馏水为空白对照，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH6.6）和2.5 mL 1 g/100 mL六氰合铁酸钾溶液，50 ℃水浴中保温20 min，快速冷却后加入2.5 mL 10%醋酸溶液。3 000 r/min条件下离心10 min。取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸馏水，0.5 mL 0.1 g/100 mL 三氯化铁溶液，充分混匀，混合物静止10 min后，在700 nm波长处测其吸光度。以吸光度表示还原能力。用对应质量浓度的VC作对照实验。

1.6.3 抗油脂氧化能力的测定

通过诱导时间来表示抗油脂氧化稳定性。使用油脂氧化仪测定诱导时间[21]：110 ℃，空气流速20 L/h。在每个反应管中添加3.00 g猪油、提取物样液和3 滴吐温。诱导时间与抗氧化能力呈正相关，即诱导时间越长，抗氧化能力越强。以VC作对照实验。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

通过回归分析得到标准曲线回归方程：蛋白质标准曲线y=0.007 1x＋0.005 4（R2=0.999 6）；葡萄糖标准曲线y=20.586 0x－0.005 8（R2=0.998 2）；硒标准曲线y=0.000 1x＋0.004 7（R2=0.993 7）。

2.2 多糖提取液脱蛋白不同方法的比较

表 1 两种方法脱蛋白效果的比较

Table 1 Comparison of the efficiency of two methods for protein removal

由表1可知，Sevag法具有较高的脱蛋白率和较低的硒损失率，通过方差分析得出2 种方法的脱蛋白率具有显著性差异（P＜0.001），硒损失率也具有显著性差异
（P＜0.005），因此本实验采用Sevag法对粗多糖进行脱蛋白。

2.3 富硒小麦中硒的赋存研究

2.3.1 硒在小麦籽粒中的赋存水平

用火焰原子法测定小麦各组分硒含量可知，富硒小麦粉的总硒含量为（41.14±0.02）ng/g，其中硒主要以有机态存在，其含量为（34.65±0.03）ng/g，占总硒量的84.36%，无机硒提取物硒含量为
（6.49±0.04）ng/g。由表2可知，富硒小麦中硒的主要赋存形态为：蛋白态硒、多糖态硒、核酸态硒。蛋白态硒主要结合于小麦的4 种蛋白质中，分别占有机硒比例为：麦清蛋白23.04%、麦球蛋白12.68%、麦醇蛋白为11.20%、麦谷蛋白19.93%。多糖态硒的3 种提取物硒含量分别占有机硒比例为：碱溶性多糖2.83%、水溶性多糖9.03%、酸溶性多糖4.42%。富硒小麦中硒主要赋存形态按含硒量大小依次排序为：麦清蛋白、麦谷蛋白、麦球蛋白、水溶性多糖、麦醇蛋白、酸溶性多糖、核酸提取物、碱溶性多糖。

表 2 富硒小麦不同赋存形态硒含量（以绝干计）

Table 2 Comparison of Se levels and speciation in Se-enrich wheat
(on a dry matter basis)

2.3.2 硒在小麦籽粒各组分中的分布比例

图 1 硒在小麦籽粒中的分布比例

Fig.1 Distribution of selenium species in Se-enriched wheat

由图1可知，富硒小麦硒含量主要为有机形式存在，占总硒量的84.36%；其中蛋白结合态硒占总硒含量高达54.46%，说明小麦籽粒中有机态硒主要是以硒蛋白的形式存在，多糖结合态硒占总硒15.75%，其他少量硒赋存于硒核酸和其他有机形式硒中。

2.4 抗氧化性的测定结果

2.4.1 DPPH自由基清除能力的比较

图 2 不同小麦提取物对DPPH自由基的清除能力

Fig.2 DPPH radical scavenging activities of organic Se compounds extracted from Se-enriched wheat

图 3 不同溶解性硒蛋白提取物对DPPH自由基的清除能力

Fig.3 DPPH radical scavenging activities of different Se-binding proteins extracted from Se-enriched wheat

由图2、3可知，富硒小麦含硒提取物对DPPH自由基均有一定的清除能力。以半数抑制量IC50值来评价样品清除自由基能力，IC50值越高表明样品清除自由基的能力越差，抗氧化性也就越差，DPPH自由基清除能力大小为：VC＞多糖提取物＞蛋白提取物＞核酸提取物。不同溶解性硒蛋白的抗氧化性强弱顺序为：麦清蛋白（IC50=0.914 mg/mL）＞麦谷蛋白
（IC50=0.974 mg/mL）＞麦球蛋白（IC50=1.061 mg/mL）＞
麦醇蛋白（IC50=1.214 mg/mL）。

2.4.2 总还原力的比较

图 4 不同小麦提取物的总还原力

Fig.4 Total reducing power of organic Se compounds extracted from Se-enriched wheat

图 5 不同溶解性蛋白提取物的总还原力

Fig.5 Total reducing power of different Se-binding proteins extracted from Se-enriched wheat

由于吸光度大小与抗氧化性强弱成正相关，由图4、5可知，抗氧化性强弱关系为：VC＞多糖提取物＞蛋白质提取物＞核酸提取物。样品质量浓度增加，吸光度也随之增加，吸光度越高表明抗氧化性越强。当样品质量浓度达到0.5 mg/mL时，VC和蛋白提取物抗氧化性强弱的顺序为：麦清蛋白＞麦谷蛋白＞麦球蛋白＞麦醇蛋白。

2.4.3 抗油脂氧化稳定性

图 6 不同小麦提取物对诱导时间的影响

Fig.6 Influence of different samples on induction time

由图6可知，不同的硒提取物的诱导时间有一定的差异，通过单因素方差分析得出抗氧化能力由强到弱排列：VC＞多糖提取物＞麦清蛋白＞麦谷蛋白＞麦球蛋白＞麦醇蛋白＞核酸提取物＞空白，与清除DPPH自由基能力和总还原力的测定结果一致。

2.5 抗氧化活性与硒含量的关系

表 3 富硒小麦含硒提取物抗氧化活性与其硒含量的相关性分析

Table 3 Correlation analysis of antioxidant activity with selenium content in different extracts of Se-enriched wheat

注：*.差异显著（P＜0.05）；**.差异极显著（P＜0.01）；表中数据为各检测项目与不同硒提取物硒含量相关回归方程的相关系数。

为了进一步了解小麦富硒提取物抗氧化活性和其硒含量之间的相关性，本实验分析了两者之间的皮尔逊（Pearson）相关系数，结果如表3所示，小麦中富硒提取物抗氧化性与其硒含量之间的相关性表现为显著的正相关性。表明富硒提取物中的硒对其抗氧化作用具有显著增强作用。

3 结 论

富硒小麦籽粒中硒主要以有机态存在，占总硒的84.36%。有机态硒中以蛋白硒（54.46%）为主要赋存形式，硒多糖次之，少量为硒核酸和其他有机态硒。在蛋白质结合硒中，清蛋白和谷蛋白中硒含量较高，分别占总硒的19.46%和16.83%；抗氧化性分析结果表明，硒多糖相对于蛋白和核酸提取物，具有更强的抗氧化能力，主要是由于它具有更长的诱导时间、更高的DPPH自由基清除能力和总还原力，这可能与多糖本身含有一些未知的具有抗氧化活性的成分有关。富硒蛋白提取物抗氧化活性依次为：麦清蛋白＞麦谷蛋白＞麦球蛋白＞麦醇蛋白。核酸提取物抗氧化能力不显著。富硒小麦蛋白、多糖以及核酸提取物中硒的化学结构目前来说仍不明确，硒对小麦油脂等其他有机部位的作用尚未研究，需要进一步的研究来确定在富硒小麦含硒提取物中硒的结构。

参考文献：

[1] 方允中, 李文杰. 自由基与酶基础理论及其在生物学和医药中的应用[M]. 北京: 科学出版社, 1994: 122-142.

[2] SCARTEZZINI P, SPERONI E. Review on some plants of Indian traditional medicine with antioxidant activity[J]. Ethnopharmacol, 2000, 71(12): 23-43.

[3] ROTRUCK J T, POPE A L, GANTHER H E, et al. Selenium biochemical role as a component of glutathione peroxidase[J]. Science, 1973, 179: 588-590.

[4] GUPTA U C, GUPTA S C. Selenium in soil and crops, its deficiencies in livestock and human: implications for management[J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 2000, 31: 1791-1807.

[5] RAYMAN M P. The importance of selenium to human health[J]. Lancet, 2000, 356: 233-241.

[6] 李萍, 朱滨, 刘开泰. 微量元素硒与人体健康[J]. 微量元素与健康研究, 1996, 13(4): 45-46.

[7] ZIN Z M, HAMID A A, OSMANA. Antioxidative activities of chromatographic fractions obtained from root, fruit and leaf of Mengkudu (Morinda citrifolia L.)[J]. Food Chemistry, 2006, 94: 169-178.

[8] FOSTER L H, SUMAR S. Methods of analysis used for the determination of selenium in milk and infant formulae: a review[J]. Food Chemistry, 1995, 53: 453-466.

[9] 吴永尧. 水稻对环境硒的富集和耐受能力研究[J]. 微量元素与健康研究, 1999, 16(4): 42-44.

[10] 蒲国强, 范衍琼, 冯婉丽. 火焰原子吸收光谱法同时测定饮用水中4种元素[J]. 现代预防医学, 2008, 35(5): 926-927.

[11] 梁保安, 张富捐. 火焰原子吸收光谱法测定兰州百合中的8种微量元素[J]. 光谱学与光谱分析, 2007, 27(4): 813-815.

[12] 梅光泉, 应惠芳. 微量元素硒与植物有机硒化合物[J]. 微量元素与健康研究, 2003, 20(6): 59-61.

[13] 李娟, 张耀庭, 曾伟, 等. 应用考马斯亮蓝法测定蛋白含量[J]. 中国生物制品学杂志, 2000, 13(2): 118-120.

[14] DUBOIS M GILLES K A, Hamilton J K, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-356.

[15] 崔乔, 尚德静. 硒多糖的研究进展[J]. 中国生化药物杂志, 2003, 24(3): 155-157.

[16] 张淑桂, 钱敏. 稀碱法提取酵母RNA的正交试验研究[J]. 云南化工, 1994(2): 10-12.

[17] 景桂兰, 刘祖昌, 李冬伟. 核酸含量的测定[J]. 广东微量元素科学, 1999(11): 48-49.

[18] FUKUDA K, UEMATSUT, HAMADA A, et al. The polysaccharide from Lampteromyces japonicus[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), 1975, 23(9): 5-9.

[19] vanAMSTERDAM F T M, ROVEI A, MAIRINO M, et al. A dihydropyridine calcium antagonist with antioxidant activity[J]. Free Radical Biology and Medicine, 1992, 12: 183-187.

[20] 赵萍, 王雅, 张轶, 等. 葵花籽粕乙醇提取物的抗氧化活性的研究[J]. 食品科学, 2007, 28(10): 219-222.

[21] VELASCO J, DOBARGANES C, HOLGADO F, et al. A follow-up oxidation study in dried microencapsulated oils under the accelerated conditions of the Rancimat test[J]. Food Research International, 2009, 42: 56-62.