玉米半胱氨酸蛋白酶突变体W308C的原核表达和酶学性质表征

刘回民,程国栋,陈方奇,郑明珠,詹冬玲,刘景圣*

(吉林农业大学食品科学与工程学院,小麦和玉米深加工国家工程实验室,吉林 长春 130118)

 

摘 要:通过对玉米半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease from Zea mays,zmCP1)同源模建和底物对接研究发现,W308位点在木瓜蛋白酶家族(C1家族)高度保守,且位于zmCP1催化三联体残基N306位点附近,与绝大多数底物形成π-π键,可参与底物和酶活性中心的结合,是该酶的关键位点;结合Rosetta design程序设计,对W308位点进行突变,获得W308C突变体,并在大肠杆菌BL21中表达。酶学性质表征实验结果表明:突变体W308C的最适温度为55 ℃,最适pH 6.0;在70、80、90 ℃下的半衰期为75.33、57.24、40.29 min,分别是野生型的1.21、1.19、1.01倍;突变体W308C和野生型的特异性常数Kcat/Km分别为11.02、5.92 L/(μmol•min),催化活性提高了0.86倍。

关键词:半胱氨酸蛋白酶;突变体;原核表达;酶学性质

 

Prokaryotic Expression and Characterization of Cysteine Protease Mutant W308C from Zea mays

 

LIU Hui-min, CHENG Guo-dong, CHEN Fang-qi, ZHENG Ming-zhu, ZHAN Dong-ling, LIU Jing-sheng*

(National Engineering Laboratory for Wheat and Corn Deep Processing, College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

 

Abstract: Through homologous modeling and docking studies of cysteine protease from Zea mays (zmCP1), W308 was highly conserved in papain super family (C1 family), near the Asn306 which was the residues of catalytic triad, had π-π interaction with most of the ligands, and was the key residue for zmCP1. By using Rosseta design program, the mutant W308C was obtained and expressed in E.coli BL21. The characterization of enzymatic properties indicated that the optimal temperature and pH were 55 ℃ and 6.0, respectively. T50 of W308C at 70, 80, and 90 ℃ were 75.33, 57.24, and 40.29 min, respectively, which were 1.21, 1.19 and 1.01 times higher than wild type. Kcat/Km of W308C and wild type was 1.02 and
5.92 L/(μmol•min), respectively, showing an activity level 1.86 times higher than that of wild type.

Key words: cysteine protease; mutant; prokaryotic expression; enzymatic properties

中图分类号:Q786 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)15-0122-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415025

微生物是商业用酶的主要来源,但植物来源的酶因其较好的安全性而被广泛应用于食品行业、制药等领域[1]。自19世纪40年代以来,来源于灌藦、牛角瓜属、阿鲁藤属、猕猴桃属等植物中的半胱氨酸蛋白酶已被分离鉴定。其中木瓜蛋白酶家族(C1家族)半胱氨酸蛋白酶因其在具有较宽的适用温度和pH值范围而倍受关注。在食品行业中,C1家族半胱氨酸蛋白酶可用于肉类嫩化、啤酒澄清、饼干松化[2]。在医学中,可用于伤口愈合、消炎、止痛等[3]。此外,C1家族蛋白酶还具有美白、改善肌肤等美容功能,还可用于牙膏中的美白剂以及饲料添加剂[4]。

玉米半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease from Zea mays,zmCP1)为C1家族的一员,序列比对结果如图1所示。该蛋白酶通常以酶原的形式存在,大多数为内切酶,少数为外切酶,含有10~26 个氨基酸残基组成的前导肽,前导肽结合到内质网后,通过分子内或分子间蛋白水解而激活酶的活性区域[5-6]。C1家族中的很多蛋白的3D结构都已经被解析,包括木瓜蛋白酶、猕猴桃素、木瓜蛋白酶Ⅳ、组织蛋白酶B等[7-11]。尽管该家族酶的一级结构和三级结构具有很高的同源性,但是在稳定性、活性和底物特异性上有很大差别[5]。

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1S4V. 蓖麻半胱氨酸蛋白酶,同源性59%;1AEC. 中华猕猴桃素,同源性51%;1PCI. 木瓜半胱氨酸蛋白酶,同源性42%;2FO5. 大麦半胱氨酸蛋白酶,同源性56%;3P5W. 软猕猴桃素,同源性55%。

图 1 zmCP1的同源序列比对

Fig.1 Sequence alignment of zmCP1 with homologous proteins

目前有关C1家族的研究主要集中在酶类的提取、纯化和性质研究和其在种子萌发中的生理功能等方面[9, 12-13],但是对该酶空间结构改造的研究尚未见报道。美国国立生物技术信息中心已收录的C1家族酶类的序列有6 909条,已确定的有223 种,而结构已知的有40 种。通过同源序列比对(图1)可以看出,高粱、水稻、猕猴桃与zmCP1的同源性较高,可达到50%以上。其中,蓖麻半胱氨酸蛋白酶(1S4V)晶体结构已知,因此我们以此为模板进行同源模建和底物分子对接研究,结果见图2。

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A.zmCP1模建结构同1S4V结构对比图;B.W308位点与荧光肽R-AMC结合作用力。

图 2 zmCP1的W308位点与荧光肽R-AMC作用

Fig.2 Interactions of W308 and R-AMC

由图1、2可知,W308位点在该家族中高度保守,并且位于催化三联体N306位点附近,通过底物虚拟对接预测该位点可以与底物形成π-π共轭双键,参与底物接合,因此推测W308位点是zmCP1活性关键残基。因此,本实验结合Rosetta design程序设计构建zmCP1突变体W308C,并对其酶学性质开展研究,为开发更适合工业生产用酶奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌BL21(DE3),重组表达载体pE-zmCP1为本实验室保存。

DNA分子量标准品DL2 000、蛋白质标准品、T4 DNA连接酶、限制性内切酶NdeⅠ、EcoRⅠ 日本TAKARA公司;Phusion超保真DNA聚合酶、重组限制性核酸内切酶Dpn 美国NEB公司;DNA凝胶回收试剂盒、质粒回收试剂盒 美国Axygen公司;卡那霉素 北京鼎国有限公司;胰蛋白胨、NaCl、酵母粉 英国OXOID公司;蛋白表达及纯化相关试剂 上海生工公司;引物、荧光肽R-AMC 上海生工公司;其他常规化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FA1604N分析天平 梅特勒-托利多公司;TL-18M高速冷冻离心机 上海离心机研究所;Mini-Sub水平电泳仪 美国伯乐公司;SH010恒温培养箱 上海实验仪器厂;ULT超低温冰箱 美国Thermo Fisher公司;5332小型PCR仪 德国Eppendorf公司;F-4500荧光分光光度计 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 突变体W308C的构建

在之前研究中通过特异性引物扩增得到了zmCP1的基因,并利用限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ成功构建了原核表达载体pE-zmCP1。本实验在此基础上,以
pE-zmCP1为模板进行全质粒聚合酶链式反应(polymerase
chain reaction,PCR)构建突变体W308C。实验中用到的引物见表1。

表 1 zmCP1及突变体引物序列

Table 1 The primer sequences of zmCP1 and mutant W308C

引物名称 

引物序列

zmCP1-up

5’-GGA ATT CCA TAT GAT GTC CGC GTC ACG GTT CCT-3’

zmCP1-down

5’-GAA TTC CTA GAC GGG GTA AGA CGG CAA C-3’

W308C-up

5’-CTG GCT GAT GAA GAA CTC CTG TGG CGC GTC GTG G-3’

W308C-down

5’-CAC GAC GCG CCA CAG GAG TTC TTC ATC AGC CAG-3’

 

注: .酶切位点和突变位点。

 

突变PCR反应总体系为50 μL,模板1 μL,两条引物各1 μL,脱氧核糖核苷三磷酸混合液1 μL,5×buffer 10 μL,Phusion聚合酶1 μL,重蒸水35 μL。反应条件为:95 ℃预变性1 min、95 ℃变性2 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min/kb共20个循环、72 ℃延伸10 min。反应结束后加入1 μLDpnⅠ在37 ℃金属浴中消化60 min。取5 μL反应液加到100 μL的感受态细胞BL21(DE3)中,利用热激法进行转化,加入800 μL Luria-Bertani(LB)培养基(不含抗生素)培养1h后,涂于LB固体培养基(含卡那霉素,50 μg/mL),37 ℃培养过夜后,进行阳性克隆筛选,将筛选得到的阳性克隆进行菌落PCR和双酶切鉴定。

1.3.2 突变体W308C的表达纯化及酶活力测定

分别挑取pE-zmCP1和突变体W308C的单菌落至2 mL LB培养基(含卡那霉素,50 μg/mL)中,37 ℃培养至菌液OD600nm值约为0.6,添加50 μL 100 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导,37 ℃培养4 h。收集菌体后加入320 μL PBS冲洗后超声破碎,对菌体破碎液进行离心分离(12 000 r/min,5 min),收集上清液,使用镍柱纯化。纯化后的酶液通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)和Western blotting进行鉴定。

参照文献[14-15]方法测定酶活力。200 μL反应体系:5 μL酶液,10 μL R-AMC底物(100 mmol/L,20%二甲基亚砜),185 μL Tris-HCl(pH 6.0,50 mmol/L)。
将反应液置于50 ℃水浴中加热30 min,取出放于冰浴中1 h,利用荧光检测其活力。设定激发波长380 nm,发射波长460 nm,狭缝宽度为5 nm/1.5 nm。酶活力单位为U,1 U为每分钟催化生成1 μmol AMC所需的酶量。

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1.3.3 突变体W308C最适反应温度及最适pH值测定

以R-AMC为底物,在50 mmol pH 6.0的Tris-HCl缓冲液中检测30~90 ℃不同温度下突变体的活力。

以三羟甲基甲胺基丙磺酸、2-(N-吗啉基)乙磺酸、3-(环己胺)-1-丙磺酸和4-羟乙基哌嗪乙磺酸配制成pH值范围3.0~10.0的缓冲液,以R-AMC为底物,将酶置于不同的pH值缓冲液中在55 ℃检测酶活力,以最高酶活力作为100%。

1.3.4 突变体W308C热稳定性测定

在多个离心管中加入相同酶液和缓冲液,分别检测突变体W308C在70、80、90 ℃的金属浴中的热稳定性,每隔20 min取1管进行活力测定,以相对酶活力为纵坐标,时间为横坐标作图,求出酶失活半衰期。0 min的相对酶活力定义为100%。

1.3.5 突变体W308C的酶促反应动力学

以荧光肽R-AMC为底物,Tris-HCl(pH 6.0)为缓冲液,在55 ℃测定不同底物浓度(5~200 μmol/L)时的反应初速度,使用Graphpad Prism 6软件通过Lineweaver-Burk双倒数法对该酶的动力学进行分析。

1.4 数据统计

所有数据均为3次独立实验结果的平均值,以

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±s表示。

2 结果与分析

2.1 zmCP1突变体W308C的构建

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A. 菌落PCR;B. W308C重组质粒的双酶切;M. Marker。

图 3 突变体W308C鉴定

Fig.3 Identification of mutant W308C

利用设计的突变引物进行全质粒PCR,经过DpnⅠ消化后,转化筛选得到的阳性克隆。对阳性克隆进行菌落PCR鉴定。由图3可知,通过引物zmCP1-up和zmCP1-down可以扩增出特异条带,大小在1 000 bp左右,同zmCP1理论大小1 023 bp一致。W308C重组质粒经过EcoRⅠ和NdeⅠ酶切后可获得大小约1 kb的目的基因条带以及载体条带,证明阳性克隆将筛选得到的突变体送至上海生工测序,结果证明在W308位点发生了预期突变,由色氨酸突变成了半胱氨酸。综上所述,突变体W308C构建成功。

2.2 突变体W308C的表达和纯化

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M. Precision Plus蛋白标准;1. 镍柱纯化后的野生型酶液;2. 镍柱纯化后的W308C酶液;3. 野生型粗酶液;4. W308C粗酶液;5. W308C免疫印迹。

图 4 突变体W308C的表达和纯化

Fig.4 Expression and purification of mutant W308C

野生型(WT)和突变体菌株经100 mmol IPTG诱导表达后使用镍柱分离纯化,纯化产物12% SDS-PAGE电泳进行检测,结果如图4所示。经过镍柱纯化后可以获得条带单一的蛋白,分子质量在34 kD左右,与半胱氨酸蛋白酶理论分子质量一致。利用组氨酸抗体和辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠IgG对突变体W308C的表达产物进行Western blotting鉴定,特异性条带位置与SDS-PAGE的结果一致,证明实现了重组酶的特异性表达。分别对上清液和纯化后的酶液进行酶活力测定,上清液的酶比活力为59.6 U/mg,而纯化后酶比活力达到305.2 U/mg,纯化倍数为5.12 倍。

2.3 突变体W308C的最适温度及最适pH值

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图 5 突变体W308C的最适温度

Fig.5 Optimal temperature of W308C

由图5可知,突变体W308C的最适温度为55 ℃,在40~80 ℃温度范围内,保持了50%以上的活性,当温度高达90 ℃时仍有将近20%的活性,同野生型zmCP1一致,这也与C1家族的酶学特性相近,该家族中的菠萝蛋白酶最适温度为65 ℃[4],狗牙花中提取的半胱氨酸蛋白酶(Ervatamin-C)的最适温度为70 ℃[9]。Dutta等[17]在大肠杆菌BL21中异源表达了Ervatamin-C,重组酶和天然酶同样都可以在温度达到70 ℃的时候保持75%以上的活力,这与本实验结果相似。

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图 6 突变体W308C的最适pH值

Fig.6 Optimal pH of W308C

由图6可知,该酶在pH 6左右时活性最高,pH 3~6之间活性持续上升,而在pH 6以后活性迅速下降,到pH 10活性几乎消失,同野生型zmCP1性质接近,同样偏爱中性环境。对该家族的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等研究结果表明[18-20],该酶的最适pH值在5~7之间,大多数都偏爱中性环境,只有少量的酶的最适pH值为酸性。

由上述可知,突变体W308C的最适温度和最适pH值同野生型一致。可能是因为该突变并未影响酶活性中心的结构,从而未影响催化三联体的质子传递以及酶活性中心的微环境,所以其最适温度和最适pH值较野生型没变化。

2.4 突变体W308C的热稳定性

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A.野生型WT;B.突变体W308C。

图 7 不同温度下野生型和突变体W308C的热稳定性

Fig.7 Stability of WT and W308C

以R-AMC为底物,在pH 6.0的条件下,测定了突变体W308C和野生型在70、80、90 ℃下的热稳定性,通过酶活力的半衰期T50作为考量热稳定性的指标。由图7可以看出,时间越长,剩余酶活力越低,突变体W308C的热稳定性要优于野生型。突变体W308C在70、80、90 ℃下的T50分别为75.33、57.24、40.29 min,而野生型的分别为62.04、47.78、39.82 min。由此可见突变体W308C的热稳定性在70、80℃的时候要明显高于野生型,而在90 ℃时则较为接近。在80、90 ℃的条件下放置120 min后活力几乎丧失。在70 ℃条件下,W308C放置120 min时仍能保持15%左右的酶活力,而野生型在10%左右。这可能因为W308C突变酶的结构更加紧凑,因此在高温下能更好的保持结构的稳固,因而具有更好的热稳定性。

2.5 突变体W308C酶动力学研究

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A.野生型WT;B.突变体W308C。

图 8 野生型和突变体W308C的动力学曲线

Fig.8 Kinetic curves of wild type and mutant W308C with R-AMC as substrate

以不同浓度的R-AMC为底物,分别测定了野生型和突变体W308C的酶活初始速度V0,根据结果分别计算1/V和1/[S],并按照Lineweaver-Burk双倒数法作图(图8),得到野生型和突变体W308C的Km和Vmax。由图8可知,野生型和突变体W308C的米氏常数Km分别为43.62 μmol/L
和44.13 μmol/L,并没有显著变化,可见W308C的突变并没有改变该酶的底物亲和力,但是最大反应速率Vmax的变化却很明显,由此计算出Kcat值,野生型和突变体分别为258、486/min,Kcat/Km值分别为5.92、
11.02L/(μmol•min),催化活性较野生型提高了1.86倍。

由动力学参数可以看出,突变体W308C的催化活性高于野生型,但是Km基本无变化。W308位于催化三联体N306的附近,当W308突变为C308,侧链官能团变小,空间位阻减小,有利于底物进入结合口袋,便于酶的亲核进攻,因此酶的活力提高。

3 结 论

本实验将zmCP1突变体W308C在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,通过SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行验证。酶学性质表征结果显示,突变体W308C的最适温度和最适pH值同野生型酶一致,即分别是55 ℃、pH 6.0,热稳定性实验结果表明,突变体W308C在70 ℃和80 ℃下的热稳定性较野生型更稳定,这与之前的研究结果相近,该家族的酶在中性pH值和高温下稳定[4-5,9,14,19]。本实验首次对zmCP1进行定点突变研究,并且筛选得到了突变体W308C,对突变体和野生型酶学性质进行了比较分析,为该酶的工业应用奠定理论基础。

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收稿日期:2014-04-04

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31171760);国家粮食公益性行业科研专项(201313011-3)

作者简介:刘回民(1984—),男,讲师,博士研究生,主要从事食品生物制造与新资源利用研究。E-mail:hymanliu@126.com

*通信作者:刘景圣(1964—),男,教授,博士,主要从事功能性食品研究。E-mail:liujs1007@vip.sina.com