双纤维素酶基因在乳酸杆菌中的融合分泌表达

丁 轲1,2，罗伟光1，丁盼盼1，李 旺1，李元晓1，余祖华2，恒子钤1，贾艳艳2，程相朝2,3,*

（1.河南科技大学宏翔发酵饲料实验室，河南 洛阳 471003；2.河南省动物疫病与公共安全院士工作站，

河南 洛阳 471003；3.河南省高等学校环境与畜产品安全重点学科开放实验室，河南 洛阳 471003）

摘 要：为提高纤维素的降解效率，将两种不同的纤维素酶基因在乳酸杆菌中融合表达，实现双纤维素酶在乳酸杆菌中的高效表达。根据两纤维素酶的基因序列设计两对引物，并在两基因间引入一段连接肽。通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）分别扩增得到两纤维素酶基因CelL15和CelL73，将其融合后连接到乳酸杆菌分泌性表达载体pMJ67中，构建重组表达质粒pMJ-CelL15-CelL73，电转化入乳酸杆菌Lactobacillus casei，利用红霉素MRS平板筛选阳性克隆，通过PCR验证获得了分泌表达双纤维素酶的重组乳酸杆菌。电泳实验结果表明重组乳酸杆菌成功表达了1个约为83 kD的融合蛋白。平板酶活力检测发现重组乳酸杆菌能明显降解底物中的羧甲基纤维素钠，培养液上清中纤维素酶酶活力可达1.25 U/mL。

关键词：纤维素酶；重组乳酸杆菌；融合；分泌

Fusion Design and Secretory Expression in Lactobacillus casei of Two Cellulase Genes

DING Ke1,2, LUO Wei-guang1, DING Pan-pan1, LI Wang1, LI Yuan-xiao1, YU Zu-hua2, HENG Zi-qin1, JIA Yan-yan2, CHENG Xiang-chao2,3,*

(1. Hongxiang Biological Feed Laboratory of Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; 2. Animal Disease and Public Safety Academician Workstation of Henan Province, Luoyang 471003, China; 3. Open Laboratory of Key Discipline for Enviroment and Animal Products Safety of Henan Institute of Higher Learning, Luoyang 471003, China)

Abstract: Cellulase is a key enzyme for cellulose degradation. In order to enhance the efficiency of cellulose degradation, two different cellulase genes were fused and integrated into Lactobacillus genome, and efficiently expressed. Two pairs of primes were designed according to two cellulose genes in GenBank, a peptide containing 10 amid acids was inserted between the two genes. CelL15 and CelL73 were amplified by PCR method, and then fused and cloned into the expression vector pMJ67. The recombinant vector was electrotransferred into Lactobacillus casei. SDS-PAGE analysis showed that the fusion cellulase protein was successfully expressed and secreted into the cell culture supernatant, which was approximately 83 kD. Enzyme activity detection on solid medium indicated that the recombinant Lactobacillus could obviously degrade sodium carboxymethylcellulose in the medium, and the cellulase activity in the supernatant was up to 1.25 U/mL after culture for 36 h.

Key words: cellulase; recombinant Lactobacillus; fusion; secretion

中图分类号：Q939.99 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）15-0127-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415026

纤维素是自然界中分布最广泛的可再生资源，其中各种农作物的秸秆是粮食生产的副产物，每年全世界有约30亿t，我国的秸秆产量约占世界产量的20%[1]。但是由于秸秆纤维素含量太高，且很难利用，仅有10%左右的秸秆用于反刍动物饲料，其他的被直接还田、焚烧或弃置，造成了极大的浪费，而且污染了环境，所以秸秆类纤维素资源的合理开发和应用已成为当前的研究热点[2]。由于秸秆的营养价值极低，采用物理、化学或酶解等处理方法，不仅费用高，而且易产生二次污染，所以模拟自然界利用微生物降解是解决秸秆纤维素降解的最可行的方案[3-5]。因此，获得能够高效降解纤维素的微生物是解决这一问题的关键。利用微生物降解的原理其实还是利用微生物的产纤维素酶的功能，然而自然降解秸秆的微生物往往酶活力较低，而且产酶种类较单一、降解过程较长，不适宜工业化生产。要提高微生物的产酶能力，最好的办法就是利用基因工程技术将目的基因重组入高效表达系统进行表达。前期实验已经克隆了2个芽孢杆菌源的不同的纤维素酶基因，对纤维素均有一定的降解能力[6]。本实验拟将这两个纤维素酶基因融合在一起重组入乳酸杆菌表达质粒pMJ67中，电转化入干酪乳杆菌L.CECT5276中，以期获得共表达双纤维素酶的重组乳酸杆菌，为进一步研究其快速降解秸秆纤维素的机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种与质粒

干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CECT5276、表达质粒pMJ67由荷兰Gasper教授赠送[6]；pGTL15、pGTL73由河南科技大学宏翔发酵饲料实验室构建[6]；DH5α由本实验室保存；pMD18-T载体 日本TaKaRa公司。

1.2 培养基、试剂与仪器

分离培养基：在MRS培养基中加入1%的羧甲基纤维素钠，121高压灭菌20 min，待温度降至60 ℃左右时向其中加入1.5%的过滤除菌的刚果红溶液。

限制性内切酶Pst I、Sma I、Bam HI、Pyrobest DNA Polymerase、DL2000、DL5000、T4 DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒、pMD18-T试剂盒、质粒提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒 日本TaKaRa公司。

凝胶成像系统、电泳仪、电转化仪 美国Bio-Rad公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 德国Biometra公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计

根据质粒pGTL15、pGTL73中纤维素酶基因CelL15和CelL73的序列设计2对引物。

P15F：5’-CGGCTGCAGATGAAACGGTCAATCTCGAT-3’（Pst I）

P15R：5’-CG CGGATCCTCCTCT ATTTGGTTCTGTTCCC-3’（Bam HI）

P73F：5’-TA GGATCCGGTGGCTCTGGAGGATCT A TGCCTTATCTGA-3’（Bam HI）

P73R：5’-GCGCCCGGGTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCA-3’（Sma I）

下划线部分为限制性内切酶，方框中的序列是两基因之间外加的连接肽序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 CelL15和CelL73基因克隆

分别以质粒pGTL15和pGTL73为模板，PCR反应体系为：上游引物1.5 μL（20 pmol/L）、下游引物1.5 μL（20 pmol/L）、10×PCR缓冲液 5 μL、dNTPs 1 μL（10 pmol/L）、Pyrobest DNA 聚合酶0.5 μL
（5 U/μL）、模板DNA 4 μL，加灭菌超纯水至50 μL。反应在Biometra PCR仪上进行：模板DNA 95 ℃预变性10 min；95 ℃ 40 s、58 ℃ 1 min（CelL15）、62 ℃ 1 min（CelL73）、72 ℃ 90 s，进行30 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。然后将两基因按照pMD18-T试剂盒说明书分别克隆入pMD18-T中，并命名为pMD-CelL15和pMD-CelL73，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.3 重组乳酸杆菌的构建

将质粒pMD-CelL15和pMD-CelL73分别用Bam HI/Sma I进行双酶切，试剂盒回收，T4 DNA连接酶连接，得到质粒pMD18-CelL15-CelL73，并将其送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。再将质粒pMD18-CelL15-CelL73和乳酸杆菌表达载体pMJ67分别用Pst I/Sma I双酶切后回收相应片段，用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性重组子后用质粒抽提试剂盒提取重组质粒，采用PCR法和酶切法进行鉴定，将该质粒命名为pMJ-CelL15-CelL73。

将100 μL感受态乳酸杆菌（参照文献[7]制备）与5 μL（300～500 ng）pMJ- CelL15-CelL73在冰浴下混匀，然后加入到冰浴预冷的0.1 cm的电转化杯中，冰上放置10 min，在电压600～1 200 V、电容25 μF、电阻100 Ω条件下进行电击，电击后立即加入0.9 mL预冷的含10%蔗糖的MRS，转入1.5 mL离心管中，37℃孵育2 h后，取200 μL涂于含5 μg/mL的红霉素抗性的MRS平板上，37 ℃厌氧培养40 h。在平板上挑取阳性克隆，采用细菌基因组提取试剂盒提取乳酸杆菌基因组，分别用引物P15F＋P15R、P73F＋P73R和P15F＋P73R，参照1.3.2节进行PCR扩增，并将扩增后的序列进行测序，鉴定正确的即为重组乳酸杆菌。

1.3.4 重组乳酸杆菌的表达

将阳性重组乳酸杆菌接种于MRS液体培养基中，37 ℃厌氧静置培养至OD600 nm＝0.5时加入0.5%的乳糖，诱导培养36 h，将菌液5 000 r/min离心8 min，取上清进行电泳检测。

1.3.5 重组乳酸杆菌培养上清中纤维素酶酶活力的测定

将重组乳酸杆菌和非重组乳酸杆菌同时取2 μL菌液滴种在分离培养基上（其中另加1%的乳糖），37 ℃厌氧36 h，观察菌落周围的酶解圈，并计算酶解圈直径D /cm与菌落直径d/cm比值，初步判定重组乳酸杆菌纤维素酶表达情况。

重组乳酸杆菌培养上清中纤维素酶酶活力测定方法参考国标GB/T 23881—2009《饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法》[8]。取培养36 h的菌液6 000 r/min离心10 min，取上清1 mL，加入1 mL含1% 羧甲基纤维素钠的pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲液混匀，50 ℃恒温水浴30 min，加入2.5 mL DNS试剂，沸水浴5 min，冷却后定容到25 mL，在520 nm波长条件下比色，测出OD520 nm值，查阅标准曲线后，求出溶液中的葡萄糖含量。酶活力单位规定：在pH 5.0、50 ℃条件下，以1 mL纤维素酶液在1 min内水解羧甲基纤维素钠生成1 μmoL葡萄糖的酶量为1个酶活力单位（U）。

2 结果与分析

2.1 CelL15基因和CelL73基因克隆

以质粒pGTL15、pGTL73为模板，利用引物P15F、P15R和P73F、P73R进行PCR扩增，获得两个大小分别约为1 524 bp和764 bp的片段（图1），与预期结果大小相符。

1. DL5000 Marker；2. CelL15基因PCR产物；
3. CelL73基因PCR产物；4. 阴性对照。

图 1 CelL15和CelL73基因PCR扩增图

Fig.1 PCR amplification of CelL15 and CelL73

2.2 重组表达质粒pMJ-CelL15-CelL73的构建

1. DL5000 Marker；2. Pst I/Sma I双酶切产物。

图 2 重组表达质粒pMJ-CelL15-CelL73酶切鉴定

Fig.2 Identification of recombinant expression plasmid pMJ-CelL15-CelL73 by double enzyme digestion

将两PCR产物分别克隆于pMD18-T中，采用酶切连接法将两基因重组到乳酸杆菌表达质粒pMJ67中。如图2所示，经双酶切电泳可见两条大小约分别为4 895 bp和2 256 bp的片段，符合质粒和融合基因的大小，因此获得了阳性克隆质粒pMJ-CelL15-CelL73。将该质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，确定正确的阅读框。

2.3 重组乳酸杆菌的PCR验证

将整合了质粒pMJ-CelL15-CelL73的乳酸杆菌抽提基因组后，分别利用引物P15F＋P15R、P73F＋P73R和P15F＋P73R进行PCR扩增，电泳可见3个片段的大小分别约为1 524、764、2 256 bp，与预期大小相符（图3）。测序结果也证明已经将该融合基因整合到了乳酸杆菌基因组上，且整个基因片段在连接时没有发生核苷酸的突变或缺失，表明成功构建了重组乳酸杆菌。

1. DL2000 Marker；2.非重组乳酸杆菌PCR产物；3. P15F＋P15R PCR产物；4. P73F＋P73R PCR产物；5. P15F＋P73R PCR产物。

图 3 重组乳酸杆菌PCR鉴定图

Fig.3 Identification of recombinant Lactobacillus by PCR method

2.4 重组乳酸杆菌的表达

1.蛋白质Marker；2.重组乳酸杆菌上清；3.非重组乳酸杆菌上清。

图 4 重组乳酸杆菌表达上清SDS-PAGE图

Fig.4 SDS-PAGE of recombinant Lactobacillus expressed protein in supernatant

由图4可知，重组乳酸杆菌培养后的上清液经10倍浓缩后，每孔点样20 μL，电泳条带与非重组乳酸杆菌比较，在约83 kD处有一条非常明显的蛋白条带，且与CelL15和CelL73融合蛋白大小预期一致，而非重组乳酸杆菌无该条带，说明双基因在乳酸杆菌中得到了表达，且能够分泌到培养基上清中。

2.5 重组乳酸杆菌表达液中纤维素酶酶活力

将重组乳酸杆菌和非重组乳酸杆菌在含有羧甲基纤维素钠为底物的培养基上培养后，通过刚果红染色，发现重组乳酸杆菌能明显降解菌落周围的羧甲基纤维素钠（图5），且D/d＝4.42，而非重组乳酸杆菌D/d＝1.12（表1）。

通过国标法测定重组乳酸杆菌培养上清中纤维素酶酶活力为1.25 U/mL，而非重组乳酸杆菌的酶活力仅为0.05 U/mL（表1），进一步验证纤维素酶在重组乳酸杆菌中得到了表达。

图 5 重组乳酸杆菌刚果红平板培养

Fig.5 Observation of recombinant Lactobacillus cultured on Congo red medium

表 1 重组乳酸杆菌培养基和上清中纤维素酶活力测定结果

Table 1 Cellulase activity of recombinant Lactobacillus in solid medium and supernatant

3 讨 论

近年来，秸秆纤维素的降解一直都是研究的热点，但无论是从降解程度，还是降解成本来看，秸秆的降解还是要依靠微生物及其纤维素酶[9-10]。秸秆是一种结构复杂的物质，主要组分包括纤维素、半纤维素和木质素[11]，因此，不是仅仅依靠一种酶就能解决的问题[12]。所谓纤维素酶是能水解纤维素β-1,4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，纤维素的降解是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等协同作用的结果，所以秸秆纤维素降解是一个复杂的生物化学过程[13-14]。前期实验已经分离筛选了多株高产纤维素酶的微生物，如芽孢杆菌、乳酸杆菌、真菌等[15-16]，对秸秆均有不程度的降解作用，但是还很不理想，其原因可能是单一菌种、单一纤维素酶作用效果有限，不能按照自然界多种微生物、多种纤维素酶共同作用的原理降解秸秆。因此本实验选择来源于两种芽孢杆菌的纤维素酶基因Cel15基因和Cel73基因，其中Cel15基因表达后是内切β-1,4-葡聚糖酶，在纤维素和半纤维素生物降解过程中起重要作用的酶；Cel73基因表达后是外切β-葡聚糖酶，能够催化葡聚糖中末端糖苷键的水解。通过基因工程技术将两个基因融合在一起，共同在乳酸杆菌中进行表达，从而实现一种微生物产两种不同纤维素酶的功能，提高了对纤维素的降解能力，结果也验证了这一点。

目前科学家已从40多种细菌和多种真菌中克隆到纤维素酶基因，且分别在大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌和乳酸杆菌等表达系统中进行了表达[17-18]。但就实际应用来说，将纤维素酶在乳酸杆菌中表达具有实际应用价值，因为利用大肠杆菌和芽孢杆菌进行发酵秸秆，气味较臭、口感极差；酵母发酵会产生醇类等物质易于挥发；乳酸杆菌本来就是秸秆青贮最主要的菌种，而利用重组纤维素酶的乳酸杆菌发酵秸秆不仅能有效降解秸秆中的纤维素，而且还可以产生乳酸、乙酸等次级代谢产物，这些代谢产物，不仅具有抗菌作用，而且还可以改变这种低值饲料的风味，有利于增加动物的采食量，提高料肉比。本实验将两个芽孢杆菌源的纤维素酶基因克隆到乳酸杆菌中并实现了表达，目的就是利用乳酸杆菌的益生特性，有利于以后进一步应用到生产中。

本实验所使用的表达载体pMJ67是一种整合型载体，外源基因插入到多克隆位点后，能通过两端的lacG和lacF同源臂整合到乳酸杆菌基因组上，并进行稳定表达。另外，前期研究将短小乳杆菌的S-层蛋白的信号肽插入到了启动子下游，并实现了引导外源蛋白进行分泌表达[19]。本实验将融合的双纤维素酶基因重组到该系统中，结果也表明融合的纤维素蛋白表达后能大量分泌到细胞外，再次验证了该表达系统的构建是成功的，而分泌到胞外的纤维素酶有利于与外界的纤维素直接接触而发生生物化学作用，结果显示培养基上清中的对羧甲基纤维素酶的酶活力可达1.25 U/mL。 LI Wang等[5]将芽孢杆菌源纤维素酶基因重组到原核表达载体pET28a中并在大肠杆菌中表达，诱导后表达量仅为0.52 U/mL。张漫莉等[20]将纤维素酶EGA重组到枯草芽孢杆菌，在培养基上清中酶活力达到1 120 U/L。黄妙容等[21]将福寿螺多功能纤维素酶基因egx在真核细胞PK15中进行表达，对羧甲基纤维素钠的酶活力为0.84 U/mL。结合文献[19]结果，说明该表达系统具备了高效分泌表达外源蛋白的能力。后续实验将进一步克隆其他种类的纤维素酶基因，使之重组到该表达系统中，然后利用表达不同纤维素酶的乳酸杆菌协同发酵秸秆，可能会得到比较理想的效果。

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