氮离子注入蛹虫草选育高效富硒菌株的研究

王 陶，李 文，陈宏伟，李同祥*，赵天兰

（徐州工程学院 江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221008）

摘 要：为了更好地开发蛹虫草资源，对蛹虫草菌株富集微量元素硒的培养条件进行了优化，选择最佳参数的低能离子束注入蛹虫草，通过石墨炉原子吸收光谱法检测注入前后菌丝体中硒元素的含量。结果表明：蛹虫草发酵富硒的最优培养条件为蛋白胨质量浓度3 g/100 mL、葡萄糖质量浓度3 g/100 mL、亚硒酸钠质量浓度为8 µg/mL、
pH值为7，此时，富硒率为21.58%。离子束最佳注入参数为：注入离子为N+，注入能量10 keV，注入剂量
1.82×1015 ions/cm2，选育出富集微量元素硒较高的10 株菌株，最高富硒率为30.97%，比出发菌株提高了近42%。

关键词：蛹虫草；硒；低能离子束；富集；注入

Breeding of Cordyceps militaris Strain with High Selenium Enrichment by Low-Energy Ion Beam Implantation

WANG Tao, LI Wen, CHEN Hong-wei, LI Tong-xiang*, ZHAO Tian-lan

(Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe, Xuzhou Institute of Technology,

Xuzhou 221008, China)

Abstract: In the present study, investigations were carried out to optimize the medium components for enhanced enrichment of the dietary microelement selenium (Se) in Cordyceps militaris mycelia. The Cordyceps militaris strain No.13 preserved in our laboratory was improved by low-energy nitrogen ion beam implantation under optimal operating conditions to increase Se enrichment in the mycelia. The Se contents in the original and mutant strains were determined by graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS). Results showed that the optimal medium components for Se enrichment in Cordyceps militaris mycelia were determined as follows: peptone 3 g/100 mL, glucose 3 g/100 mL and Na2SeO3 8 µg/mL at pH 7.0, resulting in a selenium enrichment rate of 21.58%. The optimal parameters for low-energy nitrogen ion beam implantation were achieved at an energy of 10 keV and a dose of 1.82×1015 ions/cm2. Ten mutant strains showing higher Se-enriching capacity were obtained. The highest Se enrichment rate of 30.97% was observed, nearly 42% higher than that of the original strain.

Key words: Cordyceps militaris; selenium; low-energy ion beam; enrichment; implantation

中图分类号：Q939.96 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）15-0136-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415028

硒是人体必需的微量元素，它通过谷胱甘肽过氧化物酶、辅酶Q与VE维持自由基的正常代谢来维持人体正常生理机能[1-3]，具有增强免疫能力，防止糖尿病，防止克山病、大骨节病、关节炎，防治肝病、保护肝脏，解毒排毒等功能[4-5]。中国营养学会制定硒的日供应量1 岁以内为15 µg，1～3 岁为20 µg，4～6 岁为40 µg，5 岁至成年人为50 µg。然而我国成人硒的摄入量仅为26.6 µg，属于低硒水平[6]。有机硒的补剂由于在毒理安全性、生理活性及吸收率的优越性，已经成为广泛关注的热点[7-10]。开发生物源有机硒食品或食品添加剂是给机体提供硒源的有效途径。

蛹虫草（Cordyceps militaris）又名北虫草、蛹草、北冬虫夏草，属子囊菌亚门、核菌纲、球壳菌目、麦角菌科、虫草属，含有虫草多糖、虫草素等核苷类化合物、多种氨基酸、糖醇和甾醇、多种维生素等，其药理作用与冬虫夏草相似，能显著地提高机体的免疫力，有抗肿瘤、镇静、抗放疗，以及延缓衰老的功效[11-14]。蛹虫草对微量元素具有明显的富集作用，并能够将无机态转化为有机态，使其吸收利用率大大提高，并能降低其毒性。

低能离子束生物学效应自1995年由余增亮研究员发现以来[15]，已广泛运用于多种农作物、工业微生物的诱变育种中[16]。在VC、L-乳酸、柠檬酸生产菌等方面也有重要的研究结果[17-19]。但未见利用低能离子束作用蛹虫草菌株进行微量元素硒富集的报道，因此本实验拟通过低能离子注入修饰蛹虫草菌株，优化最佳注入参数，并在微量元素硒最佳发酵培养工艺条件下，大量筛选突变体菌株，以期找到微量元素硒富集率高的菌株，从而提高蛹虫草的综合利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草（Cordyceps militaris）13号菌株：徐州工程学院食品工程学院实验室保存，通过反复优化培养，其生物量是实验室现有菌株中最多的。

亚硒酸钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

离子注入机 中国科学院合肥物质科学研究院；TSA-990原子吸收仪、TU-1810紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；HYG摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司。

1.3 培养基

固体培养基：SDAY培养基（葡萄糖4 g/100 mL、蛋白胨1 g/100 mL、酵母浸膏1 g/100 mL、琼脂2 g/100 mL）；种子培养基：SDY培养基（去掉琼脂的SDAY培养基）；发酵培养基：蛋白胨3 g/100 mL、酵母浸膏3 g/100 mL、蔗糖3 g/100 mL、KH2PO4 0.1 g/100 mL、无水氯化钙0.01 g/100 mL、MgSO4•7H2O 0.05 g/100 mL、Na2SeO3 10 µg/mL；筛选培养基：去皮马铃薯 150 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、硫酸锌1 g、琼脂30 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁1 g、蒸馏水1 000 mL。

1.4 培养方法

1.4.1 斜面培养

将接种后的斜面于22 ℃培养7 d。

1.4.2 种子培养

于22 ℃、122 r/min，培养3 d。装液量：250 mL三角瓶装入50 mL液体培养基。

1.4.3 发酵培养

于接种量5%、22 ℃、122 r/min振荡培养5～7 d。

1.5 微量元素硒富集方法

在前期单因素试验的基础上，通过L9（34）正交试验考察碳源质量浓度、氮源质量浓度、pH值和亚硒酸钠质量浓度对蛹虫草微量元素硒富集的相互影响，并确定蛹虫草菌丝体富集微量元素硒的最佳工艺参数。

1.6 诱变方法

1.6.1 样品的前期准备

在含玻璃珠的三角瓶内放置50mL生理盐水，再装入由培养7 d的斜面上刮取的孢子块，摇匀、打散，后经双层灭菌纱布过滤3 次，再在振荡器上振荡混匀，即成单孢悬液。

把孢子悬液，按照10-1稀释后取0.1 mL孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上，于超净工作台风干后进行离子注入。

1.6.2 离子注入条件

注入靶室的真空度为10-3 Pa，束流量为1 mA。注入能量：5、10、15、20、25、30 keV，注入剂量：（10、30、50、70、90、110、130、160、190）×2.6×1013 ions/cm2。注入离子种类：N+。

1.6.3 突变菌株的筛选

经离子注入处理后的样品用1 mL磷酸缓冲液洗脱下来，10 倍稀释法稀释后涂布于筛选培养基上分离，于恒温培养箱22 ℃培养7 d。挑取长势较好的单菌落中心附近直径0.5 cm同等大小菌丝体接种于斜面培养基上培养7 d，种子液中培养5 d，再接种于正交优化后的最佳硒富集发酵培养基中培养7 d。测定微量元素硒的含量，筛选富硒蛹虫草菌株。

1.7 分析检测方法

1.7.1 生物量的测定

通过低温离心分离收集菌体，将菌体冷冻干燥至恒质量，称量得生物量。

1.7.2 无机硒的去除

通过低温离心分离收集菌体，将菌体冷冻干燥至恒质量，称量得生物量。称取1 g样品，放在煮开的透析袋中，进行流水透析，时间为36 h，去除菌丝体表面的无机硒（无机硒通过流水透析已去除，以下用石墨炉原子吸收光谱法检测到的都是有机硒）。

1.7.3 微波消解

将透析好的样品于消解罐中，移取7 mL浓硝酸滴入其中溶解，放入微波消解仪中消解。消解完后用超纯水将所得的消解液定容至50 mL。

1.7.4 石墨炉原子吸收法测定硒含量

将定容好的样品吸取10 µL加入石墨炉中，利用石墨炉原子吸收法进行硒含量的测定。设定的工作参数为：波长213.9 nm，灰化温度500 ℃，原子化温度1 900 ℃，消化温度2 000 ℃。

1.7.5 硒标准曲线的制作

用移液管分别移取0.1 mg/mL硒标准液进行稀释，配制硒质量浓度分别为50、100、200、400、
600 ng/mL。以硒标准溶液的质量浓度（x，ng/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标（y），绘制标准曲线，得y=0.000 9x＋0.004 4（R2=0.999 2）。

1.7.6 富集率的计算

2 结果与分析

2.1 培养条件对蛹虫草富集硒元素能力的影响

2.1.1 碳源对硒富集的影响

表 1 碳源种类对菌丝体生物量和富硒率的影响

Table 1 Effects of different carbon sources on biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia

碳源分别为3g/100mL的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉对蛹虫草生物量和硒富集率的影响见表1。葡萄糖为碳源时，生物量最高为2.178 g/100mL，可能由于葡萄糖是单糖，蛹虫草对单糖提供的碳源更易吸收，而蔗糖，乳糖和麦芽糖是二糖，糊精和淀粉是多糖，在发酵培养基中加入二糖或多糖时影响菌体的生长，生物量不高。当葡萄糖作为碳源时，蛹虫草菌丝体富硒率最高为19.60%。由此说明碳源种类为葡萄糖时，蛹虫草生长较好，同时富硒能力强，因此，葡萄糖为最适碳源。

2.1.2 氮源对硒富集的影响

表 2 氮源种类对蛹虫草生物量和硒富集率的影响

Table 2 Effect of different nitrogen sources on biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia

氮源分别为3 g/100 mL的尿素、蛋白胨、大豆粉、玉米粉、硝酸钾、硫酸铵对蛹虫草生物量和硒富集率的影响见表2。尿素、蛋白胨、大豆粉、玉米粉是有机氮源，硝酸钾和硫酸铵属于无机氮源。由表可知，培养基有机氮源的比无机氮源的生物量高很多，其中蛋白胨的生物量为最大，为3.134 g/100 mL。加入氮源为蛋白胨时，蛹虫草菌丝体富硒率最大为16.85%。由此说明氮源种类为蛋白胨时，蛹虫草富硒能力强，则蛋白胨为最优氮源种类。

2.1.3 pH值对硒富集的影响

将发酵培养基的pH值分别调为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，不同pH值对蛹虫草菌丝体的生物量和富硒率的影响可见表3。随着pH值的增长，生物量先增加后降低，在pH6.5时，生物量达到最大，虫草菌丝体的富硒能力最大，其富硒率为18.64%。这样的pH值使蛹虫草更易生长，使蛹虫草的富集能力增强。过酸过碱的环境都抑制蛹虫草的生长。

表 3 不同pH值对菌丝体生物量和富硒率的影响

Table 3 Effect of different medium pH values on biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia

2.1.4 亚硒酸钠质量浓度对硒富集的影响

表 4 亚硒酸钠质量浓度对菌丝体生物量和富硒量的影响

Table 4 Effect of different Na2SeO3 concentrations on biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia

在基本培养基中加入不同质量浓度的亚硒酸钠，对蛹虫草的生物量和富硒率的影响见表4。亚硒酸钠质量浓度为10 µg/mL时，生物量达到最大为3.106 g/100mL。加入的亚硒酸钠质量浓度为10 µg/mL时，虫草菌丝体的富硒能力最大，达到19.87%。在基本培养基中加入的亚硒酸钠质量浓度过低，蛹虫草富硒未达到饱和，而加入的亚硒酸钠的质量浓度过高，抑制了蛹虫草的生长，富集能力也有所降低。

2.1.5 正交试验优化结果

结合前面的单因素试验，选择碳源质量浓度、氮源质量浓度、pH值以及亚硒酸钠的加入量为影响因素，选用L9（34）正交表进行试验，因素水平表及正交试验结果如表5所示。各因素对微量元素硒富集的影响次序为B＞A＞D＞C，即蛋白胨添加量＞葡萄糖添加量＞亚硒酸钠添加量＞pH值，其最优方案为B2A2D1C3。最佳富集硒元素的培养条件为蛋白胨添加量3 g/100 mL、葡萄糖添加量3 g/100 mL、亚硒酸钠添加量为8 µg/mL、pH值为7。最优条件下，硒的富集率达21.58%。最优方案为B2A2D1C3在试验组合中，不需做验证实验。

表 5 正交试验结果与分析

Table 5 Results and analysis of orthogonal array design

2.2 低能离子注入最佳参数的确定

2.2.1 离子种类的选择

离子的种类很多，不同离子注入对菌种的损伤效应也各不相同，表现出来的敏感程度也不同。但就H+、N+和Ar+这3 种常用的注入离子来说，N+的诱变率最高[20]，因为N+是组成DNA碱基的重要元素之一，N+注入不仅可以直接引起DNA碱基分子结构的变化，还可以参与细胞的重组和修复，产生较多突变，所以通常用于微生物和植物的诱变育种。因此，本实验选择N+作为注入离子。

2.2.2 注入能量的选择

选择注入剂量为1.3×1015 ions/cm2，剂量率为2.6×1013 ions/cm2，研究不同能量N+与菌株存活率之间的关系，其结果如图1所示。

图 1 不同能量N+对菌株存活率的影响

Fig.1 Effect of N+ energy on survival rate

由图1可知，注入离子能量较低情况下，菌株的存活率呈缓慢下降的趋势，当注入能量增加到5 keV以上后其存活率急剧下降，当注入能量继续增加到10 keV以上时，其存活率下降速度又明显减缓。为了确保在诱变选育时既有一定的存活率又有较多的正突变，本实验选择10 keV能量对蛹虫草菌种进行离子注入处理。

2.2.3 注入剂量的确定

在10 keV能量下，不同N+注入剂量对蛹虫草菌种的存活率的影响见图2，其存活曲线呈现先下降后上升再下降的趋势，属于“马鞍型”变化。这种特有的“马鞍型”曲线被认为是能量、动量作用下的损伤效应和质量、电荷作用下的保护和综合刺激作用的结果[21]。当注入剂量在0～2.6×1014 ions/cm2时，存活率急剧下降，随着剂量的增加，存活率又缓慢上升，当剂量增加到70×2.6×1013 ions/cm2时，存活率又开始缓慢下降。

因此，本实验选择离子最佳注入参数为：N+，能量10 keV，剂量70×2.6×1013 ions/cm2峰值间的剂量，即60×2.6×1013～80×2.6×1013 ions/cm2，这样既保证一定的存活率，又有一定的正突变率。

图 2 N+注入菌株的存活率曲线

Fig.2 Survival curve of the original strain after N+ beam implantation

2.3 低能离子注入后筛选得到部分突变子照片

在最佳注入参数下，进行了大批量的N+注入实验，在PDA筛选培养基上得到了大量的单菌落，见图3，并对长势较好、菌落大的单菌落进行纯培养，进而在前面优化的蛹虫草富硒发酵培养基上发酵培养。

图 3 离子束注入后得到的单菌落

Fig.3 Colonies after N+ beam implantation

2.4 富硒蛹虫草菌种的筛选

按照优化后的富硒蛹虫草发酵培养工艺条件，对近160 个低能离子束修饰后的单菌落进行微量元素硒的富集培养，利用石墨碳原子吸收法测定菌丝体中硒的含量。富硒率较高的10 株菌株见表6。离子注入前后蛹虫草菌株的生物量有了比较大的变化，注入后生物量比对照提高最多达50%。可见低能离子束的诱变效应首先体现在对菌体生长上。通过最佳注入参数的低能N+修饰蛹虫草菌株后，在最佳富集培养条件下，筛选得到了菌丝体中硒含量较高的菌株，最高达（309.684±0.010）µg/g干质量，同时富集率达30.97%，比对照高了近42%。这可能是由于低能N+的质量沉积、能量交换和电荷转移三因子效应的综合作用的结果[21]，使得蛹虫草中菌丝体细胞的通透性增加，从而有利于微量元素的富集。对高效富硒的菌株在斜面培养基上进行了6 次传代培养，每次检测得到的硒含量均在300.000 µg/g干质量左右，富硒率在30%与对照相比，增幅均在40%左右（表7），这些菌株的遗传稳定性较好，可以进行下一步的研究。

表 6 离子束注入前后菌丝体生物量及富硒率

Table 6 Biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia before and after ion beam implantation

表 7 突变菌株的遗传稳定性

Table 7 Genetic stability of the mutant strain No. 3

3 结 论

采用能量为10 keV，不同剂量的N+注入蛹虫草菌株的存活率呈比较典型的马鞍型曲线，最佳注入剂量为1.82×1015 ions/cm2，这样既保证一定的存活率，又有一定正突变率。优化蛹虫草菌株富集微量元素硒的发酵条件：蛋白胨质量浓度3 g/100 mL、葡萄糖质量浓度3 g/100 mL、亚硒酸钠质量浓度为8 µg/mL、pH值为7。在最佳注入参数下，经过大量的N+注入发现：低能离子束对生物体的诱变效应首先表现在对菌体生长上，生物量比对照提高。筛选得到了菌丝体中硒含量较高的菌株，最高达（309.684 ± 0.010）µg/g干质量，同时富硒率达30.97%，比对照高了近42%。这些菌株生长性能较好，具有较好的遗传稳定性，为综合开发利用蛹虫草资源奠定了一定的基础。当然，低能离子注入微生物体内作用机理十分复杂，是质量沉积、电荷转移和能量交换三因子于一体的综合过程。虫草具有多种生物学功能，富硒能增强其功效，对于低能离子注入得到高效富硒蛹虫草菌株仅仅做了初步的探索，关于低能离子束注入蛹虫草菌株后的诱变效应机理、富硒蛹虫草中硒的存在形式以及虫草素、虫草多糖等生物活性成分还有待于进一步的研究。

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