变性梯度凝胶电泳法初步解析茯砖茶渥堆
发酵过程中细菌群落结构

刘石泉1,2，胡治远1，赵运林1,*

（1.湖南城市学院化学与环境工程学院，湖南 益阳 413000；2.湖南农业大学生物科学与技术学院，湖南 长沙 410128）

摘 要：为解析茯砖茶渥堆发酵过程中细菌群落结构和种类，对渥堆过程中不同时间段细菌16S rDNA 的V3可变区进行扩增，对细菌变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）图谱中条带进行克隆、测序和序列比对。结果表明：黑毛茶在渥堆过程中以渥堆24 h为分界点，前后各自细菌群落结构相似，但前后的差异较大；从16S rDNA 的V3可变区比对结果证明黑毛茶渥堆过程中有诺卡氏菌属、新鞘脂菌属、短波单胞菌属、韦龙氏假单胞菌属、突那梭菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属及不可培养的ε-变形菌、腐败螺旋菌属、黏球菌属、根瘤菌属和未知分类地位的不可培养细菌6 种。采用DGGE指纹图谱能更全面、更真实地反映黑毛茶渥堆发酵过程中细菌群落的结构和多样性变化。

关键词：茯砖茶；渥堆发酵；变性梯度凝胶电泳；细菌群落结构

Preliminary Analysis of Bacterial Community Structure during Pile-Fermentation Process of Fuzhuan Brick Tea by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

LIU Shi-quan1,2, HU Zhi-yuan1 ZHAO Yun-lin1,*

(1. College of Chemistry and Environment Engineering, Hunan City University, Yiyang 413000, China;

2. College of Biology and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Abstract: In order to explore the bacterial community structure and species during the pile-fermentation process of Fuzhuan Brick Tea, the V3 variable region of bacterial 16S rDNA was amplified at different fermentation times and analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), and the DGGE bands were cloned, sequenced and aligned. The results showed that 24 hours of pile-fermentation was the critical point. A similar bacterial community structure was observed before and after the point, respectively, while a significant difference existed between the two stages. The sequence alignment of 16S rDNA V3 variable region showed that Millisia brevis, Novosphingobium sp., Brevundimonas aurantiaca, Pseudomonas veronii, Clostridium ultunense, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus plantarum, unculturable strains including Epsilon proteobacterium, Saprospiraceae bacterium, Myxococcales bacterium and Rhizobiales bacterium, and six species of unculturable bacteria with unknown taxonomic status were detected. Therefore, pile fermentation of the black tea involved a large number of bacteria, and the bacterial community during the process was relatively stable. In conclusion, DGGE fingerprint can provide a comprehensive and true reflection of changes in the bacterial community structure and diversity of Fuzhuan brick tea during the fermentation process.

Key words: Fuzhuan brick tea; pile-fermentation; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); bacterial community structure

中图分类号：S571.1，Q939.97 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）15-0172-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415035

茯砖茶是传统黑茶中保健功效最为显著的品种之一，据《明史•茶法》记载，早在明嘉靖三年即公元1524年前，茯砖茶就被规定为运往西北供少数民族所需的官茶。茯砖茶与绿茶、红茶比较，绿茶属非发酵茶，红茶属半发酵茶，而茯砖茶属于后发酵茶，其加工工艺独特，独具菌花香[1]。茯砖茶加工比较特殊，经黑毛茶拼配、筛分、渥堆、汽蒸压制、发花、干燥、成品包装等加工工序，加工成茯砖茶产品。以前主要销往边疆少数民族地区，专供新疆、青海、甘肃、宁夏等边疆少数民族地区人民饮用，鉴于茯砖茶的功效被普遍认可和接受，发展前景广阔，目前正走向内地和国际市场。

茯砖茶加工过程中渥堆处理被认为是形成其独特风味和功效的关键工序，渥堆过程中的微生物作用是在茯砖茶品质形成过程中起着决定性的作用因素之一，虽然不同花色品种所采用的渥堆技术条件不尽相同，但目的都是通过一定程度的发酵，形成叶色黑润、味醇和、香气纯正、汤色黄红明亮的品质特征，实际上就是在微生物及湿热的作用下使以茶多酚为主的化学成分发生一系列的化学变化，研究渥堆过程中微生物种类和结构，对于茯砖茶优异品质的形成和渥堆工序的革新具有重要意义[2-4]。许多学者已经对茯砖茶加工中微生物种类、微生物对茯砖茶品质的影响作了大量研究并取得了重大进展[5-6]，文献检索表明茯砖茶在渥堆过程中微生物研究主要集中在真菌，如曲霉、青霉等，而细菌的研究则主要集中在细菌的计数统计上，曾经有报道在渥堆初期有无芽孢小杆菌、芽孢细菌、金黄色葡萄球菌等，这些渥堆中特有的细菌研究，主要是用传统的微生物培养、分离、鉴定方法研究其菌落组成，对整个发酵流程的不同工艺过程中的优势菌和非优势菌共同组成的渥堆中特有的微生物群落结构的研究是零碎的、不系统的，没有对整个渥堆发酵过程中细菌做动态跟踪研究。

近年，很多研究者将免培养分子生物学技术应用到微生物群落结构的分析中，聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）等基因指纹图谱技术由于快速、直观、准确等优势而被逐渐运用于多种传统发酵食品中[7]。应用PCR-DGGE 技术能检测群落中90%～99%的微生物物种，无论该物种细胞处于哪种生理状态（活细胞、死细胞、不可培养状态的活细胞）[8]。

本实验主要采用PCR-DGGE及克隆技术，对益阳茶厂有限公司茯砖茶生产线上渥堆过程中不同渥堆阶段的黑毛茶样本进行细菌群落结构和种类分析，并对DGGE 图谱进行聚类分析，同时对渥堆过程中细菌DGGE图谱中主要条带进行克隆测序，鉴定其细菌类群，以期能为茯砖茶渥堆微生态研究提供更多信息，以利于更好地研发这一特色产品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

益阳茶厂有限公司茯砖茶生产线，渥堆过程中分别取渥堆0、8、16、24、32、40、48h的茶叶样品，用上、中、下3 层分层独立取样后，经四分法逐步缩分至500 g左右，置于－20 ℃冰箱保存，对应编号为W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7，采样时间为2013年3月28日－30日。

338F（5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）、GC-338F（5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGG CGG GGC GGG GGC GCG GGG GG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）和518R（5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’）引物由北京美亿美生物技术有限公司合成；扩增试剂购自北京美亿美生物技术有限公司；DNA Gel Extraction Kit 美国
Axygen公司；Poly-Gel DNA Extraction Kit 美国Omega公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PTC220型PCR仪、Gel-Doc XR凝胶成像系统 美国
Bio-Rad公司；DGGE-2401变性梯度凝胶电泳仪 美国C.B.S.Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌基因组提取

采用CTAB/SDS方法提取样本细菌基因组DNA[9]，DNA的TE溶液用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品后于－20℃冰箱保存。

1.3.2 细菌16S rDNA片段的PCR扩增与回收

以基因组DNA为模板、采用通用引物GC-338F和518R扩增16S rDNA 的V3高变区序列[10-11]。

PCR扩增体系（50 μL）：10×PCR buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）3.2 μL、rTaq（5 U/μL）0.4 μL、GC-338F（20 mmol/L）1 μL、518R（20 mmol/L）1 μL、模板DNA 100 ng、ddH2O补充至50 μL。

PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、55 ℃复性30 s、72 ℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。

PCR产物采用DNA Gel Extraction Kit纯化回收。

1.3.3 PCR产物的变性梯度凝胶电泳

取10 μL PCR的产物进行DGGE分析。采用变性梯度为35%～55%、8%的聚丙烯酰胺凝胶（化学变性剂为100%尿素7 mol/L和体积分数40%的去离子甲酰胺）在1×TAE缓冲液中150 V、60 ℃电泳4 h，DGGE完毕后采用银染法染色显色。

1.3.4 DGGE凝胶条带回收测序

用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，采用Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的条带。以2 μL回收产物为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系（50 μL）为：10×PCR buffer 5 μL、dNTP
（2.5 mmol/L）3.2 μL、rTaq（5 U/μL）0.4 μL、338F（20 mmol/L）1 μL、518R（20 mmol/L）1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O补充至50 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4 min；94 ℃变性30 s、55℃复性30 s、72 ℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。

将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，连接到pEASY-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，由北京美亿美生物技术有限责任公司对插入的细菌16S rDNA片段进行序列测定。

1.3.5 序列片段分析

将序列提交到GenBank数据库，使用BLAST程序进行同源性比较，获得最相似典型菌株的16S rDNA序列[12]。

1.4 分析方法

利用分析软件Quantity One 4.2.3对DGGE图谱进行聚类和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

多样性指数H在生态学中它被用来描述生态系统中的生物多样性，H＝－∑PilnPi，式中Pi是第i种在总体中的个体比例；均匀性指数E是实际观察的物种多样性指数与理论上最大的物种多样性指数之比，E＝H/Hmax，式中H为实际观察的物种多样性指数，Hmax为最大的物种多样性指数，Hmax＝lnS，丰度指数S表示生态系统中物种的数目，具体计算方法参见文献[13-14]。

利用DNAstar软件包中的SeqMan程序将DNA 序列进行人工校对，并将所有校对后的序列方向统一为正向，通过在NCBI数据库进行BLAST检索，根据比对结果获得序列对应的细菌种属信息。

2 结果与分析

2.1 样本基因组DNA提取

采用CTAB/SDS方法提取样本基因组DNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测（图1），说明成功获得了W1～W7样本基因组DNA。

M. DNA Marker。

图 1 样本中提取的细菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of bacterial genomic DNA extracted from samples

2.2 细菌16S rDNA的PCR扩增

以GC-338F和518R为引物扩增16S rDNA序列、经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，获得约200 bp的预期DNA片段（图2），用于DGGE分析。

图 2 PCR扩增的16S rDNA部分序列琼脂糖凝胶电泳

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products from partial 16S rDNA sequence

2.3 PCR产物的DGGE分析

1～20分别代表2.4节中回收测序的条带。

图 3 不同渥堆发酵阶段细菌16S rDNA-PCR产物DGGE图谱

Fig.3 DGGE map of bacterial 16S rDNA-PCR products from different pile-fermentation stages

表 1 不同渥堆发酵阶段细菌群落特征

Table 1 Bacterial community characteristics of samples in different pile-fermentation stages

样品细菌种群的16S rDNA的PCR产物经DGGE分析结果如图3所示。茯砖茶渥堆过程中，16S rDNA的V3高变区序列类型十分丰富，表1表明多样性指数H在开始渥堆的8 h之内稍有提高，随后下降，渥堆24h后下降到最低2.501，之后开始回升。均匀性指数E指数变化不大，丰度指数S变化趋势跟多样性指数H变化对应，先降后升，在24 h时最低（13）后开始缓缓回升并稳定在16，这可能是由于在茯砖茶渥堆发酵过程中，黑毛茶最先所处的环境是自然状态，渥堆开始后湿热作用促使黑毛茶附生的各种细菌相继开始萌动。多样性指数H在开始渥堆的8 h之内逐渐提高，细菌的活动无疑会改变渥堆环境如湿度、温度、含氧量等，同时细菌间的相互生长影响，如拮抗、促生等关系，多样性指数H稍微有所下降，细菌群落结构的调整逐渐向适应这时渥堆的湿热环境转变，加上其他微生物的代谢影响，使适应渥堆环境的细菌开始重新构建黑毛茶渥堆细菌群落结构。

图 4 不同渥堆发酵阶段PCA分析

Fig.4 PCA analysis of samples in different pile-fermentation stages

由图4可知，W1、W2、W3主要分布在第四象限，而W5、W6、W7主要分布在第二象限，W4则单独列于第一象限，说明在黑毛茶渥堆的0～16 h与32～48 h，渥堆细菌群落结构是不相同的，其转折点是在渥堆24h（W4）的时候。

图 5 不同渥堆发酵阶段进化树

Fig.5 Evolutionary tree for different pile-fermentation stages

由图5可知，W1、W2、W3和W5、W6、W7的相似性较近，而W4则与它们的差异较大，说明了黑毛茶在渥堆过程中，以渥堆24 h为分界点，前后细菌群落结构的变化较大。

2.4 DGGE凝胶条带回收测序及序列分析

PCR产物纯化后连接到pEASY-T载体上，转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆测序。测序结果递交GenBank数据库，并进行序列比对，得到条带所代表的细菌类型。每个回收条带选取3 个克隆，编号band1、band2、band3¼¼band20表示图3中位置1～20条带进行了序列测定，将序列提交到GenBank数据库，使用BLAST程序进行同源性比较，获得最相似典型菌株的16S rDNA序列如表2所示。在比对出的细菌种类中，变形菌门（Proteobacteria）9 株、厚壁菌门（Firmicutes）3 株、放线菌门（Actinobacteria）1 株、拟杆菌门（Bacteriodetes）1 株。

表 2 DGGE凝胶条带回收序列分析结果

Table 2 Sequence analysis of the recovered DGGE gel bands

用软件MEGA5[15]对16S rDNA 的V3高变区序列和GenBank中相关种属代表菌株的16S rDNA序列构建系统进化树，结果如图6所示。

图中数字代表图3中条带编号。

图 6 20个条带建立的进化树

Fig.6 Evolutionary tree for 20 bands

3 讨 论

关于黑茶渥堆发酵中细菌的研究，茯砖茶中只是涉及到了在渥堆中有大量的细菌存在[15]，具体鉴定到种及种的渥堆全过程变化却鲜有研究。但在普洱的渥堆中已有初步研究，如李晨晨等[16]对普洱茶渥堆发酵过程中嗜热细菌的分离和鉴定研究；姚静等[17]对普洱茶渥堆发酵过程中细菌种群的分离与分子鉴定研究；樊竹青等[18]对普洱茶渥堆过程中细菌数量的变化研究等主要是应用平板培养分离进行计数或进行鉴定。本次实验采用PCR-DGGE技术，通过DNA序列比对，监测到了渥堆全程不同时段的细菌群落结构和种类。

茯砖茶与普洱同属于后发酵茶系列，但从用平板培养分离进行鉴定的结果来看，姚静等[16]发现普洱茶渥堆发酵过程中主要存在7 个不同属的细菌，分别是芽孢杆菌、克雷伯氏菌、鞘氨醇杆菌、短杆菌、红球菌、假单胞菌、鲍曼不动杆菌。李晨晨等[15]分离了凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、热嗜淀粉芽孢杆菌、喜热噬油芽孢杆菌、乳酸片球菌，植物乳杆菌等。本次渥堆过程中检测发现了类似的细菌，如假单胞菌、克雷伯氏菌、乳杆菌等，说明这些细菌在黑茶渥堆过程中是较为普遍存在的。通过16S rDNA序列比对也发现了诺卡氏菌、新鞘脂菌、短波单胞菌、突那梭菌、变形菌、腐败螺旋菌、黏球菌、根瘤菌以及未知的不可培养细菌的存在，说明茯砖茶与普洱茶分别属于不同的发酵生态系统。而且由图3可知，条带7、13、17和19为渥堆过程中的优势细菌，将条带的16S rDNA 的V3高变区序列提交到GenBank数据库，在GenBank中使用BLAST程序进行同源性比较，条带7为韦龙氏假单胞菌属（Pseudomonas veronii）、条带17为克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）XC-08、条带13和19为不可培养细菌，更说明我们对黑毛茶渥堆发酵中细菌的作用的了解还只是冰山一角。

本实验分离得到细菌产生的各种活性物都具有较为明显的作用，有些放线菌等能产生大量茶多酚、氨基丁酸等对人体健康有益的物质，如本次检测到的诺卡氏菌[19]实验证明能分泌生物活性物，能显著增强机体免疫功能，具有抗病原微生物感染及明显的抑瘤作用，假单胞菌属[20]、新鞘脂菌[21]属能降解呋喃丹，短波单胞菌能产L-脯氨酸[22]，植物乳杆菌[23]生长温度范围为10～53 ℃，耐酸，最适pH值为5.0，在更低pH值也可以生长，其代谢可产生有机酸，此外还能产生多种酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。细菌对茯砖茶发酵过程中pH值变化及茶叶风味和品质的形成起着重要作用。

本实验也发现了克雷伯氏菌、短波单胞菌、假单胞菌和黏球菌等，姚静等[16]也曾在普洱茶中分离了类似细菌。通常被认为这些细菌是条件致病菌，可感染人和动物使其患病，能在茯砖茶渥堆发酵过程样品中被检出，说明它们在茯砖茶发酵过程中肯定有一定作用，但所起到的具体作用机理、作用大小有待进一步研究。

本实验通过PCR-DGGE技术对黑毛茶渥堆发酵中不同时间段的细菌群落结构进行分析，发现不同渥堆时间段细菌群落结构不相同，尤其以渥堆前半段和后半段细菌群落结构差异相对较大，以渥堆24 h为分界点，前后细菌群落结构的变化较大。通过16S rDNA 的V3高变区序列和GenBank中相关种属代表菌株的16S rDNA序列比对，证明细菌种类比较丰富，共检测到在黑毛茶渥堆过程中存在诺卡氏菌属、新鞘脂菌属、短波单胞菌属、韦龙氏假单胞菌属、突那梭菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属和不可培养的腐败螺旋菌属、黏球菌属、根瘤菌属、ε-变形菌等，同时还发现了6 种不可培养细菌，研究文献发现这些细菌在传统培养方法中都未曾检出，因此采用DGGE指纹图谱更全面、更真实地反映黑毛茶渥堆发酵过程中细菌群落的结构和多样性变化，同时也说明要全面准确地了解黑毛茶渥堆发酵细菌多样性，除了传统分离培养，更需要先进的分子手段，在利用现代分子技术解析黑毛茶渥堆发酵细菌结构的基础上，进一步对细菌区系及其相互协同制约的代谢机制的分析和探讨，以期揭开细菌与茯砖茶风味形成之间的神秘面纱。

由于茯砖茶加工过程中细菌种类组成复杂，有对茯砖茶品质起促进作用的有益菌种，也有影响其品质形成的条件致病菌菌种，但其有益菌种和条件致病菌种也是相对的，茯砖茶加工中条件致病菌细菌会同有益微生物竞争营养物质，影响品质。因此，要制成品质好的茯砖茶，就必须根据细菌种类和作用的程度，以不同条件加以控制，有效抑制条件致病生长，并利用有益菌的生物转化作用改善茯砖茶品质，更好地发挥黑毛茶原料的潜力，提高渥堆效率，充分彰显茯砖茶保健品质特色。

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