响应面法优化郫县豆瓣制曲工艺

孟 甜1,黄韬睿1,李玉锋2

(1.四川旅游学院烹饪系,四川 成都 610100;2.西华大学生物工程学院,四川 成都 610039)

 

摘 要:本实验采用Box-Behnken法分析优化郫县豆瓣制曲工艺。在单因素试验的基础上,选取曲精量、制曲温度、制曲时间为响应因素,以成曲质量指标(蛋白酶活力和α-淀粉酶活力)综合评分为响应值,建立回归模型,并结合实际操作情况,得出郫县豆瓣最佳制曲工艺条件为:曲精量0.28%、制曲温度33.50 ℃、制曲时间32.50 h,此时成曲质量指标综合评分为98.23。

关键词:Box-Behnken法;优化;郫县豆瓣;制曲工艺

 

Optimization of the Preparation of Pixian Bean Sauce Koji by Response Surface Methodology

 

MENG Tian1, HUANG Tao-rui1, LI Yu-feng2

(1. Department of Cuisine, Sichuan Tourism University, Chengdu 610100, China;

2. College of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

 

Abstract: Response surface methodology using Box-Behnken design was employed to optimize the preparation of Pixian bean sauce koji. Based on single-factor experiments, inoculum amount, koji-making temperature and time were chosen as independent variables, and the comprehensive evaluation score of koji quality indicators (protease activity and α-amylase activity) was the response variable. As a result, a mathematical model was established by Box-Behnken design. The optimal preparation conditions for Pixian bean sauce koji under actual operation circumstances were determined as 0.28%,
33.50 ℃ and 32.50 h for inoculum amount, koji-making temperature and time, respectively. The resulting product exhibited a comprehensive quality score of 98.23.

Key words: Box-Behnken design; optimization; Pixian bean sauce; koji preparation

中图分类号:TS264.2 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)15-0193-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415039

郫县豆瓣是最为出名的四川调味品之一,被誉为川菜之魂[1-2],以色泽油润红亮、酱香浓郁、味鲜辣醇和、外观黏稠绒实等特点著称[3-4]。在许多经典川菜如麻婆豆腐、回锅肉等的烹调中都必不可少,而且还是四川火锅底料中的主料,不仅增色提味,还别具风味。

传统郫县豆瓣以豆瓣为原料,霉菌为主要微生物菌种,经自然制曲、天然发酵而成[5]。制曲的目的是通过米曲霉等菌种在原料上生长繁殖,以便于在发酵时利用它们所分泌的多种酶类。这种方法通常需要7~8 d,受到季节限制不能常年生产,且成曲质量也不稳定[6]。而豆瓣质量的好坏关键在于制曲质量,因此在整个生产过程中制曲环节显得尤为重要,是豆瓣生产中最重要的质量控制点[7]。目前对豆瓣发酵工艺研究较多[8-12],而制曲工艺的报道却较少。为了对传统的制曲工艺进行优化,在单因素试验的基础上,通过Box-Behnken法,以成曲中蛋白酶活力和α-淀粉酶活力为指标,对影响成曲质量的主要因素进行研究,并对结果加以验证。

1 材料与方法

1.1 菌种

沪酿3.042号米曲霉 中国科学院成都分院。

1.2 试剂

钼酸钠、钨酸钠、硫酸锂、磷酸、浓盐酸、碳酸钠、三氯乙酸、硼酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、碘液 成都科龙化工试剂厂。

1.3 仪器与设备

UV-2600紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;ISO9001电子天平 北京赛多利斯天平有限公司;HH-S数显恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂;DHP-9082电热恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;HWS-250型恒温恒湿培养箱 上海精宏实验设备有限公司;PHS-25型pH计 上海雷磁仪器厂;TMQ-R-3250自动台式灭菌锅 山东新华医疗器械股份有限公司。

1.4 方法[13]

1.4.1 蛋白酶活力测定

称取充分研细的成曲5 g,加水至100 mL,在40 ℃水浴内间断搅拌1 h,过滤,滤液用pH 7.2磷酸缓冲液稀释至一定倍数;取样品稀释液1 mL,置于40 ℃水浴中预热2 min,再加入同样预热的酪蛋白溶液1 mL,精确保温10 min,时间到后立即再加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL终止反应;继续置于水浴保温20 min,使残余蛋白质沉淀后过滤,取滤液1 mL,再加0.4 mol/L碳酸钠5 mL、已稀释的福林试剂1 mL摇匀,40 ℃保温发色20 min后,680 nm波长处测定吸光度。空白对照在加酪蛋白之前先加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL,使酶失活,再加入酪蛋白[14]。

在40 ℃下,每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位,以U/g干基表示。

1.4.2 α-淀粉酶活力测定

取2%可溶性淀粉20 mL和pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液5 mL于25 mm×200 mm试管中,在60 ℃恒温水浴中预热4~5 min。加入预先稀释的酶液0.5 mL,立即记录时间,充分摇匀,定时用吸管取出反应液0.5 mL,滴于预先充满比色稀碘液(约1.5 mL)的白瓷板空穴内。当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色,与标准终点色相同时,即为反应终点,并记录时间/min。1 mL酶液于60 ℃、pH 6.0条件下,1 h液化1 g可溶性淀粉,即为1个酶活力单位,以U/g干基表示。

1.5 制曲工艺

取蒸熟冷却后的蚕豆和小麦(质量比41)500 g,加入已与面粉拌和后的曲精(曲精、面粉质量比110),充分拌匀,摊平,置于恒温恒湿培养箱中按照试验设计工艺条件进行培养,中间翻曲一次。其中,曲精呈黄绿色、无夹心、无灰黑绒毛及其他异色,孢子数经测定[15]约为17×109 个/g(干基计),细菌数低于104 个/g。

1.6 试验设计

1.6.1 单因素试验

以蛋白酶活力和α-淀粉酶活力为指标,采用单因素试验依次对曲精量、制曲温度、制曲时间进行考察,试验水平分别选取曲精量质量分数0.05%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%;制曲温度25、28、31、34、37、40 ℃;制曲时间12、18、24、30、36、42、48 h。

1.6.2 Box-Behnken试验设计

根据单因素试验结果及Box-Behnken的中心组合设计原理,采用响应面法设计三因素三水平试验方案。响应变量Y为根据蛋白酶活力和α-淀粉酶活力在成曲质量中的重要性求加权和得到的综合评分。自变量A为曲精量、B为制曲温度、C为制曲时间。本试验的设计、模型建立及数据分析,利用Design Expert 8.0.5软件辅助完成。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 曲精量考察

接种曲精量直接影响豆瓣制曲的周期。接种量大可缩短制曲周期,减少杂菌污染机会;但接种量过大,营养物质主要被用于菌体细胞增长,并产生大量代谢废物,导致微生物所处环境恶化,菌体细胞会较早衰老,且有限的营养物质也不足以维持米曲霉的生长所需,会形成大量休眠孢子,降低酶活力;接种量过小,微生物生长繁殖不足,使得营养过剩,造成浪费,增加生产成本[16]。选定制曲时间30 h、制曲温度30 ℃,考察曲精量对成曲质量的影响,结果如图1所示。

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图 1 曲精量对蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影响

Fig.1 Effect of inoculum amount on protease activity and α-amylase activity

由图1可知,蛋白酶活力和α-淀粉酶活力随接种曲精量的增加而增大,达到最大值时的曲精量分别为0.25%、0.35%,相应的酶活力分别为2 135.81、133.45 U/g;随着接种量的持续增加,酶活力呈逐渐减小趋势。因此,控制接种曲精量在0.25%~0.35%。

2.1.2 制曲温度考察

温度是影响微生物生长繁殖的重要因素之一。一般来讲,温度低于25 ℃霉菌发芽缓慢;温度高于38 ℃,也不利于霉菌发芽,反而适合细菌的发育繁殖,易染杂菌,影响制曲[17-18]。在温度控制适当时,米曲霉占绝对优势,可以抑制杂菌生长,空气中的杂菌只能少量繁殖,对成曲的质量影响不大。选定接种曲精量为0.25 %,制曲时间30 h,考察制曲温度对成曲质量的影响,结果如图2所示。蛋白酶活力和α-淀粉酶活力随着制曲温度的升高而增大,达到最大值时的温度分别为34、31 ℃;随着制曲温度的继续升高,酶活力呈逐渐减小趋势。因此,控制制曲温度在31~34 ℃。

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图 2 制曲温度对蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影响

Fig.2 Effect of koji-making temperature on protease activity and α-amylase activity

2.1.3 制曲时间考察

制曲时间对微生物生长繁殖有着重要影响。制曲时间过短,微生物生长没有达到最佳,原料利用率低,酶活力不高;制曲时间过长,酶活力反而逐渐下降,同时由于微生物的生长繁殖,又需要多消耗原料,增加了浪费,而且影响制曲设备的周转、增加通风机电力消耗[19]。因此以酶活力达到最高点为依据制定制曲时间。选定接种曲精量为0.25 %、制曲温度31 ℃,考察制曲时间对成曲质量的影响,结果如图3所示。

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图 3 制曲时间对蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影响

Fig.3 Effect of koji-making time on protease activity and α-amylase activity

由图3可知,随着制曲时间的延长,蛋白酶活力和
α-淀粉酶活力逐渐增大,二者达到峰值的时间分别为30、36 h;继续延长制曲时间,蛋白酶活力和α-淀粉酶活力逐渐减小。因此选择制曲时间在30~36 h之间。

2.2 Box-Behnken试验设计结果

Box-Behnken试验设计与结果见表1。对表1试验数据进行二次多项回归拟合,获得成曲质量指标(蛋白酶活力和α-淀粉酶活力)的综合评分Y对自变量曲精量(A)、制曲温度(B)、制曲时间(C)的多元回归方程:

Y=97.77-4.80A-2.22B-1.29C-8.65A2-13.55B2-12.18C2+2.40AB+2.58AC+0.89BC (1)

该模型方差分析结果见表2。对成曲质量综合评分所建立的回归模型极显著(P<0.000 1),且各因子系数均有意义,试验的3 个因素对蛋白酶活力的曲面效应皆显著,对综合评分的交互影响中,AB、AC交互作用显著。此外,回归模型的诊断分析表明,相关系数R2=0.994 2,R2 Adj=0.983 6。模型的信噪比为25.293,一般认为模型的可接受信噪比大于4,说明模型的拟合度和可信度非常高;变异系数越小说明试验可靠性越高,本试验的变异系数为1.73,说明试验可靠性良好。

表 1 Box-Behnken设计矩阵响应数据结果

Table 1 Box-Behnken design matrix with experimental results and response values

组别

A曲精量/%

B制曲

温度/℃

C制曲

时间/h

Y1蛋白酶

活力/(U/g)

Y2 α-淀粉酶

活力/(U/g)

Y综合

得分

1

-1(0.25)

-1(31)

0(33)

1 876.25

82.32

84.62

2

1(0.35)

-1

0

1 500.64

100.54

71.18

3

-1

1(37)

0

1 671.32

71.06

75.15

4

1

1

0

1 508.34

98.75

71.31

5

-1

0(34)

-1(30)

1 962.97

65.03

86.40

6

1

0

-1

1 518.35

88.52

70.69

7

-1

0

1(36)

1 721.65

79.21

78.02

8

1

0

1

1 512.05

110.26

72.63

9

0(0.30)

-1

-1

1 669.42

80.15

75.99

10

0

1

-1

1 542.18

72.16

70.00

11

0

-1

1

1 535.35

97.46

72.28

12

0

1

1

1 505.16

85.74

69.87

13

0

0

0

2 090.12

136.46

98.78

14

0

0

0

2 062.35

148.52

98.87

15

0

0

0

1 991.68

145.31

95.67

 

注:Y=(Y1/Y1max)×85+(Y2/Y2max)×15。

表 2 回归模型方差分析

Table 2 Analysis of variance for the regression model

变异源

平方和

自由度

均方

F值

P>F

显著性

模型

1 602.38

9

178.04

94.51

<0.000 1

**

A

184.13

1

184.13

97.74

0.000 2

**

B

39.34

1

39.34

20.88

0.006 0

**

C

15.21

1

15.21

7.01

0.045 5

*

AB

23.04

1

23.04

12.23

0.017 3

*

AC

26.63

1

26.63

14.13

0.013 2

*

BC

3.20

1

3.20

1.70

0.249 0

 

A2

276.53

1

276.53

146.79

<0.000 1

**

B2

678.33

1

678.33

360.07

<0.000 1

**

C2

548.14

1

548.14

290.96

<0.000 1

**

残差误差

9.42

5

1.88

 

 

 

失拟项

2.78

3

0.93

0.28

0.839 7

 

纯误差

6.64

2

3.32

 

 

 

所有项

1 611.80

14

 

 

 

 

响应均值=79.43 R2=0.994 2 信噪比=25.293 均方根=1.37 R2 vAdj =0.983 6

响应值=59.41 变异系数=1.73 标准差=0.963 1

 

注:**.差异极显著(P<0.01);*.差异显著(0.01<P<0.05)。

 

为更直观地反映响应因素对响应值的影响,对获得的回归模型进行响应面图及等高线图分析,结果如图4所示。可以看出,3 个响应因素在选定的范围内都存在响应极值,ABAC交互作用显著,BC交互作用不显著,结果与方差分析的结果一致。由等高线和响应面图分析,结合回归模型可以预测出当曲精量(A)为0.28%、制曲温度(B)33.67 ℃、制曲时间(C)32.73 h时,成曲质量指标综合评分为98.69。

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图 4 各因素及其相互作用影响综合评分的响应面及等高线

Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of independent variables on comprehensive quality score

2.3 回归模型的实验验证

为验证预测值与真实值之间的拟合程度及方程的合适性、有效性,采用综合评分最大响应值对应的响应因素值进行实验验证,考虑到实际操作的方便及工艺的实际情况,对响应因素值进行修正,曲精量(A)为0.28 %、制曲温度(B)33.50 ℃、制曲时间(C)32.50 h,经过3 组平行实验,综合评分平均值为98.23,预测结果(98.69)与实验值相对偏差仅为0.47%,此时蛋白酶活力和α-淀粉酶活力平均值分别为2 071.06 U/g、138.72 U/g。证明模型是合适有效的,具有一定的实践指导意义。在后期发酵实验中[20],测得豆瓣的氨基酸态氮含量为1.95 g/100 g,全氮利用率可达90%以上,与制曲工艺优化前相比提高了10%左右。

3 结 论

在本实验范围内,曲精量、制曲温度、制曲时间对郫县豆瓣制曲过程中米曲霉产蛋白酶活力、α-淀粉酶活力均有显著影响,显著顺序为曲精量>制曲时间>制曲温度,而且各因素存在一定的交互作用。

通过单因素试验和Box-Behnken试验得出郫县豆瓣最优的制曲工艺条件为:接种曲精量0.28%、制曲温度33.50 ℃、制曲时间32.50 h,在此条件下成曲质量指标综合评分可达98以上。同时,在本试验范围内建立的回归模型可靠有效,可用来预测设定条件范围内郫县豆瓣制曲工艺参数的响应值,且拟合度较好,在此条件下,豆瓣的氨基酸态氮含量为1.95 g/100 g豆瓣,全氮利用率达90%以上,与制曲工艺优化前相比提高了10%左右。研究结果可为郫县豆瓣传统制曲工艺的改进提供参数借鉴。

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收稿日期:2013-09-05

基金项目:四川省教育厅科研基金项目(10ZC063)

作者简介:孟甜(1985—),女,讲师,硕士,研究方向为食品科学。E-mail:mengtian85@sohu.com