海藻酸钠和乳清蛋白作为益生菌包埋壁材的比较

邹 强1，梁华忠2，龚春雪1，唐仁勇1,*

（1.成都大学生物产业学院，四川 成都 610106；2.四川高福记生物科技有限公司，四川 成都 600732）

摘 要：利用海藻酸钠和乳清蛋白分别制备包埋有两歧双歧杆菌的微胶囊，测定了不同微胶囊的粒径、包埋效率、缓冲能力和外观形态，同时还考察了不同微胶囊对两歧双歧杆菌保护效果的影响。结果表明：乳清蛋白微胶囊的粒径和包埋效率均要高于海藻酸钠微胶囊，分别为202.5 µm，87.8%和118.3 µm，48.1%；虽然在高胆盐环境中两种微胶囊对两歧双歧杆菌的保护效果没有显著差别，但在低酸环境、模拟胃液和常温贮藏期中，相比于海藻酸钠微胶囊，乳清蛋白微胶囊将两歧双歧杆菌的存活量分别提高了大约5、2、0.5（lg（CFU/mL））。乳清蛋白微胶囊在pH值偏中性的环境中具有较高的缓冲能力；在外观形态上，由高浓度乳清蛋白溶液制备而来的微胶囊具有较好的呈球性和致密度，这些可能是乳清蛋白微胶囊具有较高保护效果的原因。

关键词：海藻酸钠；乳清蛋白；微胶囊；益生菌

Comparison of Alginate and Whey Protein as Two Different Coating Materials Used for Probiotic Microencapsulation

ZOU Qiang1, LIANG Hua-zhong2, GONG Chun-xue1, TANG Ren-yong1,*

(1. Faculty of Biotechnology Industry, Chengdu University, Chengdu 610106, China;

2. Si Chuan Gao Fu Ji Biotechnology Co. Ltd., Chengdu 600732, China)

Abstract: Two different microcapsules containing Bifidobacterium bifidum were individually prepared using alginate and whey protein. Their characteristics, including particle size, microencapsulation yield, micrographs, buffering capacity and protective effect on microencapsulated cells, were studied. The results showed that the particle size and microencapsulation yield of whey protein microcapsules (202.5 µm, 87.8%) were both higher than those of alginate microcapsules (118.3 µm,
48.1%). At high concentration of bile salt solution, there was no significant difference in protective effect on microencapsulated Bifidobacterium bifidum between these two microcapsules. However, the whey protein microcapsules provided a better protection for microencapsulated Bifidobacterium bifidum than alginate microcapsules did when treated with acid condition, simulated gastric juice and ambient storage condition, and the survival count of microencapsulated Bifidobacterium bifidum in whey protein microcapsules was 5, 2, and 0.5 (lg (CFU/mL)) higher than that in alginate microcapsules, respectively. There may be two reasons for this better protection: first, whey protein has higher buffering capacity at nearly neutral pH; and second, whey protein microcapsules have better micrographs in terms of sphericity and density.

Key words: whey protein; alginate; microcapsules; probiotics

中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）15-0207-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415042

包埋技术作为一种最为有效的保护策略已被广泛用来提高益生菌在不利环境中的存活率[1-3]。毫无疑问，包埋壁材的选择对于益生菌的保护效果具有重要的作用。用于益生菌包埋最常采用的壁材是海藻酸钠，但是，近几年越来越多的研究发现：由于海藻酸钠胶体的多孔特性使得它不能完全有效地限制胃液的渗透作用[4-5]，因此，海藻酸钠对于益生菌在胃液中的保护作用非常有限。蛋白质所形成的凝胶具有良好的pH值敏感性、可控的通透性和较高的凝胶强度，所以蛋白质被广泛用作各种生物活性成分的包埋壁材[6-7]。除此之外，通过酶、酸以及钙离子的交联作用，蛋白质能够在室温下形成结构致密的凝胶，并且该反应条件温和，这将有利于对热易失活的生物活性成分进行包埋，也是由于蛋白质这些优良的特性，使得蛋白质成为了极具前景的益生菌包埋壁材，尤其是在人体消化道中对益生菌保护作用已被许多研究证实[8-9]。但蛋白质是否能够取代海藻酸钠作为益生菌主要的包埋壁材至今还存有疑问。

用于益生菌包埋的方法主要有挤压和乳化，相对于挤压方法，由乳化方法制备得到的益生菌微胶囊具有粒径小，表面致密，且易于工业化大规模生产的优点[10-12]。因此本实验首先以海藻酸钠和乳清蛋白为壁材通过乳化方法制备两种不同壁材的微胶囊，考察了不同微胶囊对益生菌包埋效果的影响，并探讨了包埋壁材对益生菌保护作用的机制，为益生菌包埋壁材的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）F-35 本实
验室保藏；分离乳清蛋白（纯度94.0%） 北京
银河经贸有限公司。

海藻酸钠 美国Sigma公司；转谷氨酰胺酶（酶活力1 000 U/g） 江苏一鸣生物科技有限公司；胃蛋白酶（10 000 NFU/mg）、胰蛋白酶（来自于猪胰腺） 美国BBI公司；其他试剂均为分析纯。

ULTRA-TURRAX T8均质机 德国IKA公司；BT-9300H激光粒度分析仪 辽宁百特仪器有限公司；FreeZone®6L冷冻干燥机 美国Labconco公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种培养及样品准备

将冷冻保藏的B. bifidum F-35在MRSC（过滤灭菌的半胱氨酸加入到灭菌后的MRS液体培养基中，半胱氨酸质量浓度为0.1 g/100 mL）琼脂培养基上画线培养，经过48 h厌氧培养后，挑单菌落于20 mL MRSC液体培养基中，并在37 ℃条件下厌氧培养24 h，然后按1.0%的接种量转接到30 mL的MRSC液体培养基中在厌氧条件下进行增殖培养，12 h后，将处于对数期末期的菌悬液在4 ℃、8 000r/min的条件下离心10 min，去上清，菌泥用无菌的NaCl溶液（8.5 g/L）洗涤两次后，重悬于2 mL的无菌水中得到浓缩菌液，此时浓缩菌液的菌密度大概在
109 CFU/mL。最后利用平板计数法对该浓缩菌液进行精确计数。

1.2.2 微胶囊的制备

海藻酸钠微胶囊（alginate microcapsules，AM）的制备参照Catarina等[13]的方法：首先将2 mL浓缩菌液与20 mL 2.0 g/100 mL的海藻酸钠溶液混合，之后将CaCO3微晶均匀地分散到该混合溶液中，其中CaCO3的加入量是海藻酸钠质量的7.3%，然后再将此混合液乳化到100 mL含有体积分数1.0% Span80大豆油中
（300 r/min），15 min后，加入20 mL含有冰醋酸的大豆油，冰醋酸和CaCO3的物质的量比值为3.5，持续搅拌，以促进CaCO3微晶和冰醋酸的接触反应，30 min后，向该体系加入120 mL的醋酸盐溶液（pH 5.5）并缓慢搅拌，待凝胶成型的微胶囊都沉降到醋酸盐溶液底部后，吸去油相，过滤收集AM，洗涤2 次以去除剩余油相。最后让过滤收集得到的微胶囊在4 ℃条件下存放于0.2 g/100 mL NaCl溶液中。

乳清蛋白微胶囊（whey protein microcapsules，WPM）的制备参照Heidebach等[14]的方法：将2 mL浓缩菌液与20 mL热变性（80 ℃、0.5 h）的10 g/100 mL乳清蛋白溶液混合后，快速加入TGase（10 U/g）并漩涡振荡使其分散均匀，将此混合液加入到250 mL锥形瓶中，该锥形瓶中盛有150 g预热的（40℃）大豆油，然后使该体系在磁力搅拌器的作用下（900 r/min，40 ℃）反应180 min，待液滴在酶的作用下转化为凝胶颗粒后离心（500 r/min，1 min），收集微胶囊颗粒并用林格氏试剂清洗2 次，在700 r/min条件下离心5 min，重新收集胶体颗粒，贮存于4 ℃备用。

1.2.3 包埋B. bifidum F-35的计数

包埋B. bifidum F-35的计数方法主要参照Annan等[15]的方法：将0.5 g过滤得到的微胶囊加入到4.5 mL预热的磷酸盐缓冲液中（37 ℃，0.1 mol/L NaH2PO4，pH 8.0），通过高速均质机来破碎微胶囊（10 000 r/min，45 s），缓慢摇晃此破碎液30 min，使海藻酸钠胶体完全液化并释放包埋的两歧双歧杆菌F-35，取一定量的液体，经稀释后，涂布于MRSC琼脂培养基上，然后让平板在37 ℃、厌氧条件下培养48 h后计数。包埋效率用式（1）计算。

（1）

式中：N为包埋于微胶囊中的活细胞总数/CFU；N0为浓缩菌液中的总菌数/CFU。

1.2.4 微胶囊的形态观察及其粒径分析

取一小滴微胶囊分散液置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察其形态。将冷冻干燥后的微胶囊置于玻璃皿内，用1.0%的四氧化锇气体固定，用双面胶将其黏在样品台上，离子溅射后用扫描电镜观察微胶囊表面结构。微胶囊的粒径分布是通过激光粒度分析仪来测定，平均粒径表示为体积平均粒径D（4，3），表示的是微胶囊粒径对体积的加权平均值。

1.2.5 B.bifidum F-35在模拟胃液和高胆盐溶液中的存活实验

模拟胃液的配制：用浓盐酸溶液将0.2 g/100 mL NaCl溶液的pH值调节至2.0，然后加入一定量的胃蛋白酶并使其终质量浓度为0.3 g/L，最后用0.22 μm的膜进行过滤灭菌；高胆盐溶液的配制：将胆盐均匀地分散于磷酸盐缓冲液中，它的终质量浓度为4.5 g/L，然后用0.1 mol/L NaOH溶液将此混合液的pH值调至7.4并灭菌。

将0.5 mL浓缩菌液或者0.5 g微胶囊加入到4.5 mL在37 ℃条件下预热的模拟胃液或高胆盐溶液中，用漩涡振荡器充分振荡10 s，然后在37 ℃、100 r/min条件下温育2 h。在5、30、60、120 min时，用高速均质器对样品溶液进行破碎，并按照上述方法进行计数。

1.2.6 缓冲能力的测定

海藻酸钠溶液和蛋白质溶液在不同pH值条件下缓冲能力的测定主要参照Salaun等[16]的方法：首先配制30 mL 2.0 g/100 mL的海藻酸钠溶液和乳清蛋白溶液（质量浓度2.0 g/100 mL和4.0 g/100 mL），然后用浓度为0.5 mol/L的盐酸溶液按照0.33 mL/min的速度将上述溶液的pH值从初始值滴定至2.5左右，每滴定一定量的盐酸溶液后，就记录当时样品溶液的pH值。在一定pH值下，下降单位pH值所需要的盐酸量即为该pH值条件下样品溶液的缓冲能力，其计算见式（2）。

（2）

1.2.7 B.bifidum F-35在常温条件下的贮藏稳定性实验

将冷冻干燥后的微胶囊放置于无菌的西林瓶中，然后在抽真空的情况下进行热封口，把封口好的西林瓶放置于常温条件下贮藏1 个月，每隔15 d从西林瓶中取样并按对B.bifidum F-35进行计数。

1.3 数据统计分析

采用Origin7.5作图，采用One-way ANOVA法统计分析其显著性。

2 结果与分析

2.1 不同包埋壁材对微胶囊粒径和包埋效率的影响

表 1 两种微胶囊的粒径和包埋效率

Table 1 Particle sizes and microencapsulation yields of two different microcapsules

注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。

粒径和包埋效率是评价微胶囊的重要指标，不同壁材对微胶囊的粒径和包埋效率均有显著的影响。由表1可知，海藻酸钠制备得到的微胶囊粒径为118.3 μm，且该微胶囊对B. bifidum F-35的包埋效率为48.1%，而通过蛋白质制备得到的微胶囊粒径则在此基础上增加了84.2 μm，并且对B. bifidum F-35的包埋效率高达87.8%。

2.2 不同包埋壁材对B. bifidum F-35保护效果的影响

2.2.1 不同微胶囊在模拟胃液中对B.bifidum F-35保护效果的影响

相比于未经包埋的B. bifidum F-35，包埋后的B.bifidum F-35在模拟胃液中的存活率都有不同程度的增加，尤其是在不加胃蛋白的低酸环境中，WPM将B.bifidum F-35的存活量提高了大约7（lg（CFU/mL））。通过D值（在一定的处理条件下，杀灭90%细菌所需要的时间）发现：在低酸环境中，WPM（D值=124.3 min）对B.bifidum F-35的保护作用要好于AM（D值=20.4 min），但是胃蛋白酶的加入明显减弱了WPM对B.bifidum F-35的保护效果，其D值只是略高于包埋于AM中细胞的D值（24.6 min）。

表 2 B. bifidum F-35在模拟胃液（pH 2.0，37 ℃，2 h）中的存活情况

Table 2 Survival rate of B. bifidum F-35 after incubation in simulated gastric juice (pH 2.0, 37 ℃, 2 h)

注：ND表示未检测到存活的B. bifidum F-35。

2.2.2 不同微胶囊在高胆盐环境中对B.bifidum F-35保护效果的影响

表 3 B.bifidum F-35在高胆盐溶液（2.0%, 37 ℃，2 h）中的存活情况

Table 3 Survival rate of B. bifidum F-35 after incubation at high concentration of bile salt solution (2.0%, 37 ℃, 2 h)

由表3可知，用高胆盐环境（2.0 g/100 mL）处理2 h后，未经包埋处理的B. bifidum F-35死亡了大约
3（lg（CFU/mL）），而经过包埋处理的B. bifidum F-35却只死亡了大约1（lg（CFU/mL））。AM和WPM的在这高胆盐环境中对B. bifidum F-35的保护效果上并没有显著差异，两者的D值处于同一显著水平上。

2.3 乳清蛋白和海藻酸钠在缓冲能力上的差异

邹强等[17]考察了微胶囊不同特性（缓冲能力、凝胶强度、乳化能力、渗透性）对益生菌在低酸环境中保护作用的影响，结果发现壁材的缓冲能力对保护效果影响最大。因此，本实验测定了海藻酸钠和乳清蛋白在不同pH值范围内的缓冲能力，结果如图1所示。在pH＞4.5时，海藻酸钠溶液的缓冲能力要低于相同质量浓度下乳清蛋白溶液的缓冲能力，尤其是在接近中性的pH值环境中，这种差距更为明显，说明了在此pH值范围内，乳清蛋白具有较高的缓冲能力，并且这种缓冲能力随着乳清蛋白浓度的增加而提高。当pH＜4.5时，海藻酸钠缓冲能力急增，并且超过了乳清蛋白溶液的缓冲能力。有研究表明，牛乳中的蛋白质具有一定的pH值缓冲能力，将牛乳加入到模拟胃液中能够提高环境的pH值从而增加益生菌在胃酸中的存活率[18-19]。

图 1 包埋壁材在不同pH值条件下的缓冲能力

Fig.1 Buffering capacities of the suspensions of different coating materials under different pH conditions

2.4 不同包埋壁材对微胶囊外观形态的影响

a

b

a.海藻酸钠微胶囊；b.乳清蛋白微胶囊。

图 2 冷冻干燥后微胶囊的扫描电镜观察结果

Fig.2 Scanning electron micrographs of freeze-dried microcapsules

由图2可知，虽然AM表面的光滑程度要优于WPM，但AM中生成了许多破碎的微粒和形态不规则的聚集体，这说明了WPM在呈球性和完整性上均要好于AM。

2.5 不同微胶囊对B.bifidum F-35贮藏稳定性的影响

图 3 两种微胶囊对B. bifidum F-35贮藏稳定性的影响

Fig.3 Stability of microencapsulated B.bifidum F-35 in two kinds of microcapsules during one month of storage at ambient temperature

由图3可知，在常温条件下贮藏30 d后发现，两种微胶囊中B. bifidum F-35的存活量都有不同程度的下降，WPM从7.79（lg（CFU/g））下降到6.21（lg（CFU/g）），
AM下降的趋势更为明显，在1 个月的贮藏期里，B.bifidum F-35的致死量接近2（lg（CFU/g））。总的来说，包埋于WPM中的B.bifidum F-35的贮藏稳定性要好于包埋于AM中的B.bifidum F-35。

3 讨 论

转谷氨酰胺酶催化乳清蛋白交联的反应条件比较温和，而且在WPM的制备过程中，不涉及到对益生菌细胞有毒害作用的CaCl2溶液，所以WPM的包埋效率要高于AM。冻干后，AM的呈球性和完整性上均要比WPM差，这是由于海藻酸钠分子本身的柔软性和易脆性所致[20]。

在模拟胃液中和贮藏期中，WPM对B.bifidum F-35具有较好保护效果的原因主要有两点：1）乳清蛋白分子具有许多碱性的氨基酸残基，所以在偏中性的环境中，乳清蛋白具有较高的缓冲能力，在WPM内部，这些氨基酸残基能够中和渗透进来的H+，从而维持一个pH值偏中性的内部环境；2）由高质量浓度（10 g/100 mL）的乳清蛋白溶液制备得到的微胶囊具有较高的物质密度，所以WPM在呈球性和致密程度上均要优于AM，这有助于延缓有害物质渗透到微胶囊的内部。相反，AM则很难由高质量浓度的海藻酸钠溶液制备得到，因为海藻酸钠溶液的质量浓度一旦超过2 g/100 mL，黏度就会急剧增加，从而影响微胶囊的制备。在高胆盐环境中，WPM和AM保护效果相差不大的原因可能是：弱极性的胆盐分子足够大，以至于两种微胶囊所形成的凝胶结构均能有效延缓胆盐的渗透。

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