鸭心苹果酸脱氢酶功能基团的研究

孙 芳，王红扬，王 洁，李 星，唐云明*

（西南大学生命科学学院，重庆市甘薯工程研究中心，三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715）

摘 要：分别用对氯汞苯甲酸、苯甲基 磺酰氟、N-溴代琥珀酰亚胺、琥珀酸酐、乙酰丙酮、溴代乙酸、N-乙酰咪唑、二巯基苏糖醇、氯胺-T等化学修饰剂对鸭心苹果酸脱氢酶进行修饰。结果表明：半胱氨酸巯基、色氨酸侧链吲哚基和丝氨酸羟基是鸭心细胞质苹果酸脱氢酶和线粒体苹果酸脱氢酶发挥活性的必需基团；而甲硫氨酸的硫醚基、组氨酸的咪唑基、精氨酸胍基、二硫键、酪氨酸的酚羟基、赖氨酸的ε-氨基与鸭心苹果酸脱氢酶活性不直接相关，不是酶活性中心的必需基团。

关键词：鸭心；苹果酸脱氢酶；功能基团；化学修饰

Functional Groups of Malate Dehydrogenase from Duck Heart

SUN Fang, WANG Hong-yang, WANG Jie, LI Xing, TANG Yun-ming*

(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweetpotato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract: The chemical modification of malate dehydrogenase (MDH) with p-chloromercuribenzoate, phenylmethyl sulfonyl fluoride, N-bromosuccinimide, succinic anhydride, acetylacetone, bromoacetic acid, N-acetylimidazole, dithiothreitol and chloramine-T showed that the cysteine sulfydryl, tryptophan side chain indole and serine hydroxyl groups involved in the composition of the enzyme active center could be considered as the essential functional groups of c-MDH and m-MDH from duck heart. However, the thioether group of methionine, the imidazole group of histidine, the guanidine group of arginine, disulfide bond, the phenol hydroxyl group of tyrosine and the epsilon-amino group of lysine were not directly related to the activity of the two MDH enzymes from duck heart, suggesting that they are not essential for the enzyme active center.

Key words: duck heart; malate dehydrogenase (MDH); functional groups; chemical modification

中图分类号：Q814.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）15-0212-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415043

苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase，MDH，EC 1.1.1.37）是生物体进行糖代谢的关键酶之一，主要催化草酰乙酸和苹果酸之间的可逆转化，因组织差异、辅助因子、生理功能等的不同而具有多种同工酶形式[1-2]。目前，MDH广泛应用于医学诊断、生物制药、农业生产、食品及发酵工业等领域[3]，已对多种来源的MDH进行了研究[4]，如牛心[5]、玉米[6]、葡萄[7]等，但未见鸭心MDH的详细研究报道。

鸭心MDH属于萘乙酰胺-依赖型MDH，在鸭心内以两种同工酶的形式存在，即细胞质苹果酸脱氢酶（c-MDH）和线粒体苹果酸脱氢酶（m-MDH），由于带电氨基酸残基数量的不同，导致两者等电点不同，便于分离和研究。鸭心MDH在鸭的生长代谢中占有重要作用，是三羧酸循环及细胞质代谢的重要酶类。酶的侧链基团可构成酶蛋白的各种次级键，在维持酶的空间结构与酶活性中占有重要地位。当采用化学方法修饰这些侧链基团时，会破坏酶的次级键，从而引起酶蛋白结构和功能发生改变。因此，通过测定修饰后的酶活性是否发生变化，就可判断该侧链基团是否是酶发挥活性的必需基团[8-9]。

由于家禽体内的MDH从未得到研究，本实验选取鸭心MDH为研究对象，以分离纯化得到的鸭心c-MDH和m-MDH为实验材料，通过化学修饰法对其功能基团进行研究，旨在确定两同工酶发挥活性的必需基团，为深入研究家禽类动物体MDH的结构及功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采用本实验室分离纯化得到的电泳纯鸭心c-MDH和m-MDH纯品为实验材料[10]。

对氯汞苯甲酸（p-chloromercuribenzoate，PCMB） 美国Sigma公司；苯甲基 磺酰氟（phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF） 美国Merck公司；N-溴代琥珀酰亚胺（N-bromosuccinimide，NBS）、琥珀酸酐（succinic anhydride，SUAN）、乙酰丙酮（acetylacetone，AA）、溴代乙酸（bromoacetic acid，BrAc）、N-乙酰咪唑（N-acetylimidazole，NAI）、二巯基苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、氯胺-T（chloramine-t）以及其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

分别将化学修饰剂PCMB、氯胺-T、BrAc、AA、DTT、NAI、SUAN用100 mmol/L pH 7.5的PBS缓冲液稀释成0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol/L一系列浓度梯度；将NBS用100 mmol/L pH 7.5的PBS缓冲液稀释成0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L一系列浓度梯度；将PMSF用100 mmol/L pH 7.5的PBS缓冲液稀释成0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mmol/L一系列浓度梯度后，分别加入鸭心c-MDH和m-MDH，在25 ℃条件下作用30 min后，测定与化学修饰剂作用后的酶活力。

酶活力测定具体方法是：MDH在催化草酰乙酸转化为苹果酸的同时，将NADH氧化为NAD，使得NADH在340 nm波长处吸光度不断降低，连续测定酶反应过程中340 nm波长处吸光度的变化即可测出酶活。酶活力单位定义：25 ℃时，1 min氧化1 μmol的NADH所需的酶量为1个酶活力单位[10]。同时以不加修饰剂，而加入等量100 mmol/L pH 7.5的PBS缓冲液的酶液所测得的酶活力为100%，计算各种修饰条件下的相对酶活力，分析不同浓度的修饰剂对两种同工酶活性的影响，以研究两种同工酶的功能基团。

2 结果与分析

2.1 PCMB对半胱氨酸巯基的化学修饰

图 1 PCMB对鸭心苹果酸脱氢酶活性的影响

Fig.1 Effect of PCMB on the activity of MDH from duck heart

在酸性条件下，对PCMB能专一作用于半胱氨酸残基中巯基侧链基团，因此成为蛋白质分子中巯基的常用修饰剂[11]。PCMB对鸭心c-MDH和m-MDH的酶活力有很强的抑制作用（图1），当PCMB浓度小于2.0 mmol/L时，酶活力迅速下降，当PCMB浓度达到2.0 mmol/L时，酶活力就几乎降为零。说明半胱氨酸中的巯基是两种同工酶发挥酶活力的必需基团。

2.2 NBS对色氨酸残基的修饰

在酸性条件下，NBS可以选择性地将色氨酸吲哚基团氧化。随着修饰剂NBS浓度的增大，对鸭心c-MDH和m-MDH抑制作用就增强；当浓度达到5.0 mmol/L时，剩余酶活力还不到30%，并且还有下降的趋势（图2）。因此可以说明NBS对鸭心MDH具有较强的抑制作用，色氨酸残基能够影响两种同工酶的活性，是两者发挥活性的必需基团。

图 2 NBS对鸭心苹果酸脱氢酶活性的影响

Fig.2 Effect of NBS on the activity of MDH from duck heart

2.3 PMSF对丝氨酸残基的化学修饰

在偏碱性条件下，PMSF可特异性的修饰蛋白质分子中的丝氨酸羟基[12]。本实验将鸭心c-MDH和m-MDH与不同浓度的化学修饰剂PMSF作用，结果如图3所示。随着PMSF浓度的增大，鸭心MDH的活性逐渐受到抑制，说明PMSF对酶的活性有影响，丝氨酸残基是鸭心MDH发挥活性的必需基团。

图 3 PMSF对鸭心苹果酸脱氢酶活性的影响

Fig.3 Effect of PMSF on the activity of MDH from duck heart

2.4 氯胺-T对甲硫氨酸残基的化学修饰

氯胺-T能在碱性条件下特异性地修饰甲硫氨酸的硫醚基[13]。在碱性条件下，用不同浓度的氯胺-T修饰鸭心c-MDH和m-MDH，结果如图4所示。在一定浓度下，氯胺-T对鸭心苹果酸脱氢酶的酶活性几乎没有影响，当氯胺-T的浓度达到4.0 mmol/L时，酶活力还高达90%以上，说明甲硫氨酸的硫醚基不是鸭心MDH发挥活性的必需基团，没有参与两种同工酶活性中心的构成。

图 4 氯胺-T对鸭心苹果酸脱氢酶活性的影响

Fig.4 Effect of chloramine-T on the activity of MDH from duck heart

2.5 BrAc对组氨酸残基的化学修饰

BrAc在偏酸性条件下可以专一地与蛋白质分子中的组氨酸咪唑基发生反应，生成羧甲基衍生物[14]。将鸭心c-MDH和m-MDH与不同浓度的修饰剂BrAc作用后，测定酶活力，结果如图5所示。随着修饰剂浓度的增大酶活力变化微小，说明组氨酸的咪唑基不是鸭心苹果酸脱氢酶发挥酶活性的必需基团，组氨酸的咪唑基修饰后对鸭心MDH的活性影响不大。

图 5 BrAc对鸭心苹果酸脱氢酶活性的影响

Fig.5 Effect of BrAc on the activity of MDH from duck heart

2.6 AA对精氨酸胍基的化学修饰

在偏碱性条件下，AA能够专一性地修饰精氨酸残基中的胍基，改变侧链基团的结构，进而影响蛋白质分子的性质[15]。将鸭心c-MDH和m-MDH与不同浓度的AA作用，结果如图6所示。随着修饰剂AA浓度的增加，酶活力变化很平缓。说明AA对鸭心MDH的酶活力基本没有影响，精氨酸残基不是酶发挥活性的必需基团。

图 6 AA对鸭心苹果酸脱氢酶活性的影响

Fig.6 Effect of AA on the activity of MDH from duck heart

2.7 DTT对二硫键的化学修饰

DTT是一种巯基化合物，通过还原作用，它能特异性地作用于蛋白质分子中的二硫键，并将其打开，生成半胱氨酸及相应的二硫化合物[16]。本实验用不同浓度的DTT对鸭心c-MDH和m-MDH进行化学修饰，结果如图7所示。随着修饰剂DTT浓度的增大，鸭心苹果酸脱氢酶的酶活力变化不大，当DTT浓度为4.0 mmol/L时，仍保留高达85%以上的酶活力，说明二硫键不是酶发挥活性作用必需的功能基团。

图 7 DTT对鸭心苹果酸脱氢酶活性的影响

Fig.7 Effect of DTT on the activity of MDH from duck heart

2.8 NAI对酪氨酸酚羟基的化学修饰

NAI在一定的条件下可以修饰酪氨酸酚羟基[17]，结果如图8所示。随着修饰剂NAI浓度的增大，鸭心c-MDH和m-MDH的酶活力有下降的趋势，但变化不大，在NAI的浓度为4.0 mmol/L时，酶的活性仍保留80%以上，说明酪氨酸的酚羟基不是鸭心MDH发挥酶活力的必需基团。

图 8 NAI对鸭心苹果酸脱氢酶活性的影响

Fig.8 Effect of NAI on the activity of MDH from duck heart

2.9 SUAN对赖氨酸残基的化学修饰

图 9 SUAN对鸭心苹果酸脱氢酶活性的影响

Fig.9 Effect of SUAN on the activity of MDH from duck heart

SUAN是常用的氨基修饰剂，能够修饰赖氨酸残基上的ε-氨基，与其共价结合或发生脱氨基作用，从而将氨基屏蔽起来[18]。用不同浓度的SUAN对鸭心c-MDH和m-MDH进行化学修饰，结果如图9所示。随着SUAN浓度的增加，酶活力变化不明显，说明赖氨酸残基不是酶发挥活性的必需基团。

3 讨 论

酶活力的展现需要有完整的酶分子构象，酶活力的丧失往往先于其整体构象的改变。探讨酶活性中心的功能基团，对研究酶的结构、功能及酶的催化机理与固定化等具有重要的意义[19]。

酶的侧链基团是指组成酶蛋白氨基酸残基上的各个功能基团，主要含有巯基、胍基、氨基、羧基、咪唑基、硫醚基、吲哚基、酚羟基、二硫键等。酶的化学修饰法是研究酶的活性中心功能基团、改进酶的理化性质、提高酶催化性能的重要途径。因此，可以采用化学修饰法来改变酶分子的侧链基团，利用各种化学修饰剂对酶的特定氨基酸残基进行修饰，进而影响酶的空间结构与活性中心，以便于研究酶活性中心功能基团的性质。如果酶的某一基团被修饰后，活力变化明显，就说明该基团位于酶的活性中心，是酶活性中心的必需基团。反之，如果酶的活性没有发生明显的变化，就表明该基团与酶的活性中心不直接相关，不是酶活性中心的必需基团[20]。

本实验中选用PMSF、PCMB、NAI、SUAN、DTT、BrAc、BD、NBS等化学修饰剂对鸭心苹果酸脱氢酶两同工酶的氨基酸残基进行选择性修饰，修饰过程中，让修饰剂与酶分子充分作用，结果表明：有的化学修饰剂能强烈地抑制酶的活性，有的修饰剂却对酶活力没有明显影响。这些修饰剂大体上对两同工酶的作用相同，说明c-MDH和m-MDH在酶的结合位点上虽然存在着一定的差别，但是它们的活性位点却高度保守，在活性中心功能基团上具有相似性，并且具有通用的催化机制。

根据化学修饰结果可以判定：半胱氨酸巯基、色氨酸侧链吲哚基、丝氨酸羟基是鸭心c-MDH和m-MDH发挥活性的必需基团，参与了酶活性中心的构成；而甲硫氨酸的硫醚基、组氨酸的咪唑基、精氨酸胍基、二硫键、酪氨酸的酚羟基、赖氨酸的ε-氨基与鸭心c-MDH和m-MDH发挥活性不直接相关，不是酶活性中心的必需基团。本结果为鸭心苹果酸脱氢酶两同工酶空间结构及固定化的研究提供参考。

近年来，研究蛋白质结构和功能的关系多采用蛋白质工程替换氨基酸的方法，在应用定位突变替换氨基酸之前，通过化学修饰法确定必需氨基酸残基的数目和性质具有很大的必要性[21]，因此，研究酶蛋白功能基团具有重要意义。

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