苹果皮总黄酮对D-半乳糖致衰老模型小鼠
抗氧化能力的影响

崔 玮，韩 春，赵巧华，叶江江

（河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000）

摘 要：目的：探究苹果皮总黄酮（flavonoids from apple pericarp，FAP）对D-半乳糖致衰小鼠的抗氧化作用。方法：采用皮下注射D-半乳糖制备衰老小鼠模型。筛选50只健康昆明小鼠（雌雄各半）随机分为模型组、正常对照组和低、中、高剂量实验组。于造模第16天后，给低、中、高剂量组小鼠分别灌胃50、100、200 mg/kg FAP，持续45d后，采用Morris水迷宫和小鼠避暗仪测试小鼠学习记忆能力，并采集血液、取脑、肝、心、肾组织，测定各组织丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力。结果：与正常对照组相比，模型组小鼠学习记忆能力减退，除心之外，脑、肝、肾、血液MDA含量显著增加（P＜0.05），SOD活性和GSH-Px活力显著下降（P＜0.05）；与模型组相比，除低、高剂量组的血液SOD活性与GSH-Px活力及低剂量组心脏GSH-Px活力无显著提高（P＞0.05），其他各组织心、脑、肝、肾SOD活性与GSH-Px活力均显著提高（P＜0.05）；但各剂量组与正常对照组相比，中剂量组各指标均无显著差异性（P＞0.05），而低、高剂量组MDA含量显著高于正常对照组（P＜0.05），SOD活性和GSH-Px活力显著低于正常对照组（P＜0.05）。结论：经口给予小鼠一定剂量的FAP有明显的抗氧化的作用，且其有剂量效应。

关键词：苹果皮；总黄酮；抗氧化；小鼠

Effect of Flavonoids from Apple Pericarp on Antioxidant Functions in D-Galactose-Induced Aging Mice

CUI Wei, HAN Chun, ZHAO Qiao-hua, YE Jiang-jiang

(College of Agriculture and Biotechnology, Hexi University, Zhangye 734000, China)

Abstract: Objective: This study aimed to examine the antioxidant effect of total flavonoids from apple pericarp (FAP) in D-galactose-induced aging mice. Methods: The aging model was established by hypodermic injection of D-galactose. Fifty healthy Kunming mice were chosen and randomly divided into five groups (n=10, half male and half female): normal control, model control, low- (50 mg/kg), middle- (100 mg/kg) and high-dose (200 mg/kg) FAP treatment groups. From the sixteenth day after the injection, the mice from the three treatment groups were intragastrically administrated with FAP for 45 successive days. The learning and memory ability of mice were tested using the darkness-avoidance and Morris water maze methods on the forty-sixth day. Then, the mice were killed, and blood, brain, liver, heart and kidney tissues were collected for the measurement of MDA contents, and SOD activities and GSH-Px activities. Results: Compared with the normal control group, the learning and memory ability of the mice in the model control group were decreased; the MDA contents of brain, liver, kidney and blood except for heart tissue were increased significantly (P＜0.05), whereas the activities of SOD and GSH-Px were decreased significantly (P＜0.05). Compared with the model control group, except for the activities of blood SOD and GSH-Px in the mice from the high- and low-dose groups as well as heart GSH-Px activity in the mice from the low-dose group, which were not significantly enhanced (P＞0.05), both enzyme activities revealed a significant increase in all other investigated tissues (P＜0.05). When comparing each dose group with the normal control group, there were no significant differences in the various parameters for the middle-dose group, yet the low- and high-dose groups indicated a significant increase in MDA content and a significant decrease in SOD and GSH-Px activities (P ＜ 0.05). Conclusion: Orally administered FAP improve antioxidant functions in aging mice, showing a dose-effect relationship.

Key words: apple pericarp; total flavonoids; antioxidant; mice

中图分类号：R977 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）15-0258-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415052

研究表明苹果皮不仅含丰富的膳食纤维，能帮助消化，苹果中将近一半的VC也在紧贴果皮的部位[1]。黄酮类成分是苹果皮的最主要成分，研究表明苹果皮中的黄酮类成分主要包括黄烷醇类（60%）、黄酮醇类（18%）、二氢查耳酮类（8%）和花色苷（5%）。其含量远远高于果肉部分，果肉中的含量为15～605.6 mg/kg，果皮中为834.2～2 300.3 mg/kg[2]。有关衰老的自由基学说认为，机体老化是体内细胞不断受活性氧如超氧阴离子自由基（O2—•）、羟自由基（•OH）、脂过氧自由基（ROO•）攻击的过程，诱发机体内不饱和脂肪酶的一系列脂质氧化连锁反应，大量研究表明，自由基产生过多和清除能力下降是引发多种疾病的生化机制。抗氧化活性物质通过清除体内自由基而延缓衰老。许多研究表明，苹果皮中的多酚物质如黄酮具有很好的清除•OH、1,1-二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和O2—•的能力[3-4]，同时还具有很好的抑制油脂氧化的能力[5]。因此，本实验旨在探索苹果皮总黄酮（flavonoids from apple pericarp，FAP）类物质对D-半乳糖诱导的衰老小鼠抗衰老的作用，为苹果加工业中果皮的有效利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

健康昆明种小鼠，8～10 周龄，体质量（20±2）g，由兰州大学医学部试验动物中心提供。动物合格证号为：甘医动字第14-006。

硝酸铝（Al(NO3)3）、亚硝酸钠（NaNO2）、氢氧化钠（NaOH）、2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA)、氯化钠（NaCl）、D-半乳糖（D-galactose，D-gal）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、甲硫氨酸（Met）、偏磷酸（HPO4）、双氧水（H2O2）、乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2）、
核黄素、无水乙醇、石油醚、四乙氧基丙烷、冰乙酸、正丁醇、吡啶、柠檬酸三钠、2-硝基苯甲酸（2-nitro-benzoic acid，DTNB）均为国产分析纯；氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

722型可见光分光光度计 上海光谱仪器有限公司；
SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；
RE-2000A旋蒸器 巩义市京华仪器有限公司；TGL-16M冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；TGL-16G离心机 上海安亭科学仪器厂；DHG-9101.1型电热恒温鼓风干燥箱 扬州市三发电子有限公司；AL204电子
天平 梅特勒-托利多国际股份有限公司；Morris水迷宫测定系统、小鼠避暗仪 成都泰盟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FAP的制备

1.3.1.1 FAP的提取过程

将苹果皮粉末按照料液比为1∶5（m/V）在石油醚里浸泡脱脂，每次2 h，共脱脂3 次[6-7]。称取一定量的脱脂苹果皮粉，料液比为1∶30（m/V），加入70%的酒精、50℃水浴浸提1 h，提取3 次。将浸提液减压浓缩后用AB-8大孔吸附树脂除糖得到粗黄酮。

1.3.1.2 FAP的测定

利用芦丁为标准品制作标准曲线：ρ=0.197 9A＋
0.013 4，R2=0.994 9。式中：ρ为芦丁质量浓度/（mg/mL），
A为吸光度；亚硝酸钠-硝酸铝法测的总黄酮含量为80.69%。

1.3.2 模型的建立

参照文献[8-10]，每只小鼠颈部颈部皮下注射（ih）质量分数为5%的D-gal 0.2 mL建立亚急性衰老模型。

1.3.3 实验动物分组及用药

小鼠经水迷宫训练1 周，选取记忆能力正常的健康小鼠50只，随机分为5组（n=10，雌雄各半），分别是正常组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，除正常组颈部注射生理盐水外，其余各组注射D-gal，连续造模16 d后，正常组（ih）生理盐水＋灌胃（ig）生理盐水，模型组（ih）D-gal＋（ig）生理盐水，低剂量组（ih）D-gal＋（ig）FAP 50 mg/kg，中剂量组（ih）D-gal＋（ig）FAP 100 mg/kg，高剂量组（ih）D-gal＋（ig）FAP
200 mg/kg，持续45 d。处理最后1周对小鼠进行Morris水迷宫训练，实验期间小鼠自由取食和饮水，每日观察记录生长状况。

1.3.4 小鼠记忆能力及各项生理指标的测定

1.3.4.1 学习记忆能力的测定

1）小鼠Morris水迷宫实验

末次处理2 h后，进行Morris水迷宫定位航行实验和Morris水迷宫空间搜索实验。

2）小鼠避暗实验

小鼠水迷宫实验结束后，进行小鼠避暗实验。

1.3.4.2 生化指标的测定

学习记忆能力测定之后，小鼠称质量，摘眼球取血，断颈处死，取心、肝、脑、肾冻存备用。小鼠血样于4 ℃冰箱放置12 h，离心（3 000 r/min，10 min）取血清。称取一定质量的心脏（0.5 g）、肝脏（0.5 g）、肾脏（0.4 g）和脑组织（0.4 g），用pH 7.8的磷酸缓冲液在冰浴上研磨，定容后冷冻离心（5 000 r/min，10 min），取上清液测定小鼠各组织丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）。

MDA含量的测定：采用改良的八木国夫法（TBA法）[11]。SOD活性的测定：采用氯化硝基氮蓝四唑光还原法（NBT法）[12]。GSH-Px活性的测定：采用DTNB显色法。组织中蛋白含量的测定：考马斯亮蓝G250法测定心、脑、肝、肾组织匀浆的蛋白含量。

1.4 数据分析

实验数据通过SPSS 17.0统计分析，采用Duncan新复极差法（SSR）进行多重比较，数据以

±s表示。

2 结果与分析

2.1 小鼠学习记忆能力的测定结果

表 1 小鼠Morris水迷宫定位航行实验结果（

x

±s，n=10）

Table 1 Experimental data for mice in the Morris water maze (

x

± s, n = 10)

注：*.与正常对照组相比，差异显著（P＜0.05）；#.与模型组相比，差异显著（P＜0.05）。下同。

表 2 小鼠Morris水迷宫空间搜索实验结果（

x

±s，n=10）

Table 2 Experimental data of Morris water maze spatial search for mice (

x

± s, n = 10)

由表1可知，与正常对照组相比，小鼠Morris水迷宫定位航行实验的第三象限时间、平台停留时间、潜伏期模型组均有显著性差异（P＜0.05）；由表2可知，与正常对照组相比，小鼠Morris水迷宫空间搜索实验的第三象限时间、平台停留时间和经过有效区次数模型组均有显著性差异（P＜0.05）。以上结果说明模型组的小鼠记忆能力较正常对照组差；与模型组相比较，定位航行实验和空间搜索实验低、中、高剂量组各数据均有显著性差异（P＜0.05），但各剂量组与正常对照组相比，中剂量组各数据均无显著性差异（P＞0.05），而低、高剂量组显著高于正常对照组
（P＜0.05），表明中剂量FAP对小鼠的记忆能力有明显的改善作用，低剂量组和高剂量组次之。

由表3可知，在小鼠避暗实验中，与正常对照组相比，模型组犯潜伏期比较长，犯错误次数比较多。与模型组相比，低、中、高剂量组的潜伏期、犯错误次数均有显著性差异（P＜0.05），而低、中、高剂量组潜伏期显著低于正常对照组（P＜0.05），表明中剂量FAP对小鼠的记忆能力有明显的改善作用，低剂量组和高剂量组稍次之。

表 3 小鼠避暗实验结果（

x

±s，n=10）

Table 3 Experimental data of mice darkness avoidance for mice (

x

± s, n = 10)

2.2 FAP对小鼠脏器中MDA含量的影响

表 4 小鼠血液及各组织MDA相对含量（

x

±s，n=10）

Table 4 Relative content of MDA in blood and other tissues of mice
(

x

± s, n = 10)

nmol/mL

由表4可知，与正常对照组相比，模型组小鼠脑组织MDA的含量有显著性差异（P＜0.05），含量显著升高，除心之外，肝、肾、血MDA含量也有相同的变化趋势。与模型组相比，除低剂量组的肝外，低、中、高剂量组各组织MDA含量均有显著性差异（P＜0.05）。其中，中剂量组脑组织MDA含量下降27.72%，效果最好，低剂量组和高剂量组次之；但各剂量组与正常对照组相比，中剂量组除心之外各指标均无显著性差异（P＞0.05），而低、高剂量组的肝和脑MDA含量都显著高于正常对照组
（P＜0.05），表明中剂量组FAP具有较好的拮抗D-gal所致衰老小鼠肝和脑组织MDA升高的作用。

2.3 FAP对小鼠脏器中SOD、GSH-Px活力的影响

表 5 小鼠血液及各组织SOD相对活力（

x

±s，n=10）

Table 5 Relative activity of SOD in blood and other tissues of mice
(

x

± s, n = 10)

nU/mg

表5、6可知，与正常对照组相比较，模型组各组织的SOD相对活力和GSH-Px活力都有显著性差异
（P＜0.05），SOD相对活力和GSH-Px活力都明显降低，且脑组织SOD活力比正常对照组降低了21.02%、
GSH-Px活力降低了31.17%；与模型组相比较，除低剂量组和高剂量组的血液SOD相对活力与GSH-Px活力及低剂量组小鼠心脏GSH-Px活力没有显著性差异外，低、中、高剂量组其他各组织都有显著性差异（P＜0.05），且中剂量组处理效果最好，小鼠脑组织SOD活力比模型组提高了24.46%，GSH-Px活力提高了43.86%；但各剂量组与正常对照组相比，中剂量组各指标均无显著性差异（P＞0.05），基本达到了正常对照对照组的水平或略高于正常对照对照组，但除低、高剂量血液和高剂量心GSH-Px活力无明显性差异（P＞0.05）外，低、高剂量组其他各组织SOD和GSH-Px活力显著低于正常对照组（P＜0.05）。表明中剂量FAP能显著提高D-gal所致衰老小鼠脑组织的SOD和GSH-Px活力。

表 6 小鼠血液及各组织GSH-Px相对活力（

x

±s，n=10）

Table 6 Relative activity of GSH-Px in blood and other tissues of mice (

x

± s, n = 10)

nU/mg

3 讨 论

采用D-gal诱导的衰老模型是一种常用的实验动物衰老模型，得到了自由基衰老学说的支持和验证[13]。在一定时间内，连续给小鼠注射D-gal，使其细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶的作用下还原成半乳糖醇，后者不能被进一步代谢而堆积在细胞内，影响细胞正常的渗透压，导致细胞代谢紊乱，自由基堆积，不断受活性氧如O2—•、•OH、ROO•的攻击，诱发机体内不饱和脂肪酶的一系列脂质氧化连锁反应，最终致使衰老的发生[14-15]。其中分解产物之一MDA的含量能间接反映机体内自由基的产生情况和机体组织细胞的脂质过氧化程度，作为评价衰老的指标[16]。本实验模型组脑组织MDA含量明显高于正常组，在心、肝、肾组织中也有相同的变化趋势，且在小鼠造模后，逐渐表现为少动，毛色发黄，这些数据和现象表明衰老模型成功。

Carrasco-Pozo等[17]研究发现，苹果多酚可有效抑制由消炎痛（indometacin，INDO）引发的氧化应激反应对Caco-2细胞线粒体造成的功能紊乱，这一结论表明，苹果多酚可缓解INDO对人体的副作用。SOD为重要的抗氧化酶之一，可通过有效地清除自由基反应的启动因子（O2—•）来抑制和阻断自由基反应，降低自由基代谢产物MDA生成。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，SOD和GSH-Px联合作用可有效防止组织细胞过氧化损伤[18]，因此测定SOD和GSH-Px的活力可以作为衡量机体抗氧化系统改变的重要指标。通过灌胃不同剂量FAP后，低、中、高剂量组与模型组相比，均能显著提高脑组织SOD和GSH-Px活力，降低其MDA含量。且在小鼠心、肝、肾组织中也有相同的变化趋势，这表明一定剂量的FAP具有较好地拮抗D-gal衰老的作用，较强的清除自由基的能力。在本实验，中剂量组的抗衰老效果最好，这与范红艳[19]和陈红红[20]等的研究结果不太一致。郑荣梁[21]发现自由基清除剂只有在足够的浓度时，而且只有在自由基产生的位置附近时才能起作用。另外，与自由基发生反应后，清除剂本身变成了自由基，这个新自由基的毒性或活泼性应该小于原来自由基的毒性或活泼性才能起防护作用。这可能就是本实验的高剂量组没有达到较好抗衰老作用的原因，或者是由于FAP粗提物中含有其他物质的原因。

衰老的直观表现就是记忆力下降，通过小鼠Morris水迷宫和避暗实验来反映小鼠的学习记忆能力。Morris水迷宫实验是强迫实验动物（小鼠）游泳，学习寻找隐藏在水中的平台，来反映小鼠的空间记忆能力[22]。定位航行实验中实验动物经过平台所在象限时间越长、实验动物找到平台时间（潜伏期）越短说明小鼠学习记忆能力越好，空间搜索实验中实验动物在平台区停留时间越长、经过平台区次数越多可以进一步说明小鼠学习记忆能力越好。本实验是利用小鼠的趋暗避明性，在暗室有危险后小鼠便产生记忆，比较小鼠犯错误次数和潜伏期来判定学习记忆能力，潜伏期越短、错误次数越少说明学习记忆能力好，结果表明中剂量组比模型组记忆能力好，证实一定剂量的FAP具有较好改善学习记忆能力的作用，这与范红艳等[19]的研究结果也比较一致。同时，本实验证实一定浓度的FAP提取物对小鼠有一定的抗氧化作用。

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