阿魏侧耳胞外多糖对荷瘤小鼠免疫能力的影响

王 晶,闫训友*,王万雷,朱垣缘,常世民

(廊坊师范学院生命科学学院,河北 廊坊 065000)

 

摘 要:通过皮下注射小鼠腹水瘤细胞构建荷瘤小鼠模型,灌胃法给药,采用血液分析仪、细胞培养、酶联免疫吸附等设备和方法测定血液中白细胞和淋巴细胞数量、腹腔巨噬细胞吞噬能力、脾淋巴细胞增殖能力、免疫器官指数、血浆中肿瘤坏死因子-α含量等来研究阿魏侧耳胞外多糖对荷瘤小鼠免疫功能的调节作用。结果显示:与荷瘤对照组相比,灌胃100、200 mg/kg的阿魏侧耳胞外多糖可显著降低荷瘤小鼠瘤体质量(P<0.05)、提高血液中白细胞和淋巴细胞数量(P<0.05)、促进脾淋巴细胞的增殖(P<0.05),增加免疫器官指数(P<0.05)和血浆中肿瘤坏死因子-α的含量(P<0.05);灌胃200 mg/kg的阿魏侧耳胞外多糖可以显著增强荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力(P<0.05)。因此,一定浓度的阿魏侧耳胞外多糖可提高荷瘤小鼠的免疫能力。

关键词:阿魏侧耳;胞外多糖;免疫器官指数;肿瘤坏死因子;脾淋巴细胞

 

Effect of Extracellular Polysaccharides Produced by Pleurotus ferulae Lanzi on Immune Function of Tumor-Bearing Mice

 

WANG Jing, YAN Xun-you*, WANG Wan-lei, ZHU Yuan-yuan, CHANG Shi-min

(College of Life Sciences, Langfang Normal University, Langfang 065000, China)

 

Abstract: To investigate the immunoregulatory effect of extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi immune in tumor-bearing mice, tumor-bearing mice were developed by subcutaneous injection of murine sarcoma S180 and intragastric administration. The numbers of leukocytes and lymphocytes in blood, peritoneal macrophage phagocytic activities, splenic lymphocyte proliferation, immune organ weight indexes and tumor necrosis factor-α (TNF-α) level in blood plasma were examined with an automatic blood analyzer, cell culture in vitro and enzyme-linked immunosorbent assay, respectively. The results showed that extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi at the concentrations of 100 and 200 mg/kg caused a significant reduction in the weight of tumor (P < 0.05) and a significant increase in the numbers of leukocytes and lymphocytes in blood (P < 0.05), the weight indexes of spleen and thymus gland (P < 0.05) and the concentration of TNF-α in blood plasma (P < 0.05), and also significantly enhanced the proliferation capacity of splenic lymphocytes (P < 0.05); while phagocytic activities of murine peritoneal macrophages were significantly enhanced by the extracellular polysaccharides at the concentration of 200 mg/kg (P < 0.05). Thus, the immune function of tumor-bearing mice could be improved by extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi at a certain concentration.

Key words: Pleurotus ferulae Lanzi; extracellular polysaccharides; immune organ indexes; tumor necrosis factor-α; splenic lymphocytes

中图分类号:Q946.3;Q952.6 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)15-0268-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201415054

作为自然界中含量最丰富的大分子聚合物之一,多糖广泛分布于动植物、真菌和细菌中[1],可通过其特异性识别受体[1-2]发挥免疫调节、抗肿瘤等多种功效[3-6]。近年来对于食药用真菌多糖的分离纯化及生物学功能的研究较多,但未见阿魏侧耳胞外多糖的免疫调节作用的相关报道。本实验自制阿魏侧耳胞外多糖,采用皮下注射肿瘤细胞法建立荷瘤小鼠模型,通过测定模型鼠的多项免疫功能指标,探究阿魏侧耳胞外多糖对荷瘤小鼠免疫功能的影响作用。

1 材料与方法

1.1 材料、实验动物与试剂

阿魏侧耳(Pleurotus ferulae Lanzi)胞外多糖(粗多糖,多糖含量约13.45%),参照闫训友等[7]方法从阿魏侧耳液体发酵培养基中制得;鸡血红细胞悬液,参照杨汉民[8]的方法并改进:鸡翅下静脉抽血,适量Alsevers溶液抗凝,离心,弃上清液和中层淡黄色细胞层(白细胞和血小板),0.85 g/100 mL氯化钠溶液调节细胞密度至1×107 个/mL,冰箱冷藏备用。

BALB/c小鼠6~8 周龄,雄性,体质量18~22 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

S180小鼠腹水瘤细胞购自中国科学院细胞库;四季青胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司;RPMI-1640培养基 美国Gibco公司;肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor-α,TNF-α)ELISA检测试剂盒 上海研谨生物科技有限公司;植物凝集素(phytohaemagg lutinin,PHA) 美国Sigma公司;四甲基偶氮唑蓝(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT) 美国Amresco公司;二甲基亚砜 索莱宝公司;环磷酰胺 江苏恒瑞医药股份有限公司;红细胞裂解液 上海碧云天生物技术有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MCO-20AIC二氧化碳培养箱、MLS-3750高压蒸汽灭菌锅 日本SANYO公司;BC-3000Plus全自动血液分析仪 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;
FD-1D-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;ZHJH-C超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司;BX50系统显微镜、CKX41SF倒置显微镜 日本
Olympus公司;SunriseTM光吸收酶标仪 瑞士Tecan公司;Milli-Q超纯水机 美国Millipore公司;BS-2F振荡培养箱 常州国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖溶液的配制

阿魏侧耳胞外多糖分别用0.9 g/100 mL氯化钠溶液和RPMI-1640培养基溶解,0.22 μm针头滤器过滤除菌,冰箱中冷藏备用。

1.3.2 小鼠腹水瘤细胞S180的培养与传代

取对数生长期的S180细胞悬液,离心,吸弃上清液,含体积分数10%胎牛血清RPMI-1640重悬,以1/2的细胞密度接种至新培养瓶中,置37 ℃,5% CO2恒温培养箱中培养,2~3 d传代1 次,收集对数生长期的细胞进行皮下接种,构建荷瘤小鼠模型。

1.3.3 构建荷瘤小鼠模型及给药

BALB/c小鼠50 只,适应性饲养3 d后,于右腋皮下接种密度为1×107 个/mL的S180小鼠腹水瘤细胞悬液0.1 mL并随机分为5 组:荷瘤对照组、环磷酰胺组、高剂量多糖组、中剂量多糖组、低剂量多糖组。各组小鼠均自由摄食饮水,荷瘤对照组每天灌胃0.9 g/100 mL氯化钠溶液,环磷酰胺组隔天腹腔注射25 mg/kg体质量的环磷酰胺(0.9 g/100 mL氯化钠溶液配制);高、中、低剂量阿魏多糖胞外多糖组每天分别灌胃200、100、50 mg/kg
体质量的无菌多糖溶液(0.9 g/100 mL氯化钠溶液配制),连续15 d。灌胃第15天,准确称量动物体质量后,腹腔注射鸡血红细胞悬液1 mL,轻揉小鼠腹部,30 min后采血,测定血液中白细胞数量、淋巴细胞数量、血浆中TNF-α含量,采血后处死小鼠,剥离肿瘤并称质量,无菌条件下收集腹腔液、脾脏、胸腺进行腹腔巨噬细胞吞噬功能、免疫器官指数、脾淋巴细胞增殖能力测定。

1.3.4 白细胞和淋巴细胞数量测定

眼底取血,肝素钠抗凝血,全自动血液分析仪测定各实验组小鼠血液中白细胞和淋巴细胞数量[9-10]。

1.3.5 血浆TNF-α含量测定

取部分血液,3 000 r/min离心20 min,取上清液,按照试剂盒说明,采用双抗体夹心法测定血浆中TNF-α含量,即酶标板分设为标准孔、空白孔和待测样品孔,标准孔依次加质量浓度分别为480、320、160、80、40 ng/L
的标准品溶液50 μL,空白孔加标准品稀释液50 μL,样品孔加样品稀释液40 μL和各待测样品10 μL,37 ℃ 温育30 min,弃液体,甩干,洗涤液洗板,重复5 次,拍干。除空白孔外每孔加酶标试剂50 μL,37 ℃ 温育30 min,同样操作洗板5 次后拍干,添加显色剂A 、B 各50 μL,轻震混匀,37 ℃避光显色15 min,再加50 μL终止液终止反应。以空白孔调零,酶标仪检测450 nm波长处吸光度A450nm,根据浓度标准曲线计算血浆中TNF-α含量。

1.3.6 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定——鸡血红细胞吞噬法[8,11]

颈椎脱臼法处死小鼠,75%乙醇浸泡处理2 次,超净工作台中无菌收集腹腔液,滴于洁净的载玻片上,37 ℃湿盒中孵育30 min,漂洗去未贴附的细胞,甲醇固定10 min,吉姆萨(Giemsa)染液染色10 min,流水冲洗,甘油封片,镜检并统计细胞数量,以吞噬鸡血红细胞的腹腔巨噬细胞数量和腹腔巨噬细胞总数的比值表示小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率(%)。

1.3.7 免疫器官指数测定[12]

超净工作台中无菌取胸腺和脾脏,去除脂肪和结缔组织,无菌称湿质量,以胸腺或脾脏质量(g)和动物体质量(g)的比值表示小鼠的胸腺指数和脾脏指数。

1.3.8 脾淋巴细胞增殖能力测定[13]

取上述无菌称质量后的脾脏,经75%乙醇处理,无菌磷酸缓冲溶液漂洗后,机械法分散[14],200目铜网过滤制备脾细胞悬液,红细胞裂解液常规方法裂解红细胞,1 000 r/min离心10 min,RPMI-l640完全培养基(含10%体积分数胎牛血清)洗涤,离心,RPMI-1640完全培养基重悬,台盼蓝染色,细胞计数,调整细胞密度为1×106 个/mL,接种至96 孔培养板中,每孔180 μL,静置0.5 h,每孔吸弃5 μL培养上清,同时添加5 μL终质量浓度为100 μg/mL的PHA,37 ℃、5% CO2培养箱中培养20 h后,每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL,37 ℃、5% CO2 培养箱中反应4 h,离心,弃上清液,每孔加入二甲基亚砜150 μL,振荡混匀,酶标仪检测570 nm波长处吸光度A570 nm,作为脾淋巴细胞增殖的指标。

1.4 数据统计

数据以

674935.jpg
674936.jpg

±s表示,用软件SPSS 20.0进行t检验。
P<0.05,表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 阿魏侧耳胞外多糖对荷瘤小鼠血液中白细胞和淋巴数量影响

血液中白细胞和淋巴细胞的数量在一定程度上反映机体的免疫能力[15-16]。如表1所示,中剂量多糖组和高剂量多糖组小鼠血液中白细胞数量和淋巴细胞数量均明显增加(P<0.05)。而环磷酰胺处理则显著降低了小鼠血液中白细胞数量和淋巴细胞数量(P<0.05)。

表 1 阿魏侧耳胞外多糖对荷瘤小鼠腹腔白细胞和淋巴细胞数量的影响(

x

674962.jpg

±sn =10)

Table 1 Modulation of extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi on the numbers of leukocytes and lymphocytes in the blood of tumor-bearing mice (

x

674991.jpg

± s, n = 10)

组别

给药剂量/(mg/kg)

白细胞数量/(109 个/mL)

淋巴细胞数量/(109 个/mL)

荷瘤对照组

0

3.43±0.06

1.20±0.16

环磷酰胺组

25

2.33±0.06*

0.51±0.21*

低剂量多糖组

50

3.80±0.36

1.23±0.15

中剂量多糖组

100

5.40±0.17*

1.94±0.19*

高剂量多糖组

200

4.87±0.23*

1.76±0.22*

 

注:*.与荷瘤对照组相比,差异显著(P<0.05)。下同。

 

2.2 阿魏侧耳胞外多糖对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力影响

表 2 阿魏侧耳胞外多糖对荷瘤小鼠部分免疫功能指标的影响

x

676151.jpg

±sn=10)

Table 2 Modulation of extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi on indices of immune function of tumor-bearing mice (

x

676125.jpg

± s, n = 10)

组别

给药剂量/

(mg/kg)

腹腔巨噬细胞

吞噬百分率/%

胸腺指数

(×10-3)

脾脏指数

(×10-3)

脾淋巴细胞数

A570nm)

血浆中TNF-α

含量/(μg/L)

荷瘤对照组

0

35.07±1.69

1.48±0.44

8.20±0.86

0.245±0.016

1.59±0.02

环磷酰胺组

25

28.60±2.16 *

0.25±0.07*

5.76±0.90*

0.197±0.017*

1.36±0.06*

低剂量多糖组

50

35.68±1.16

1.84±0.59

8.72±0.71

0.275±0.021

1.61±0.11

中剂量多糖组

100

37.83±3.06

2.31±0.36*

11.67±1.92*

0.307±0.012*

1.73±0.08*

高剂量多糖组

200

40.40±2.53*

2.85±0.70*

9.85±0.72*

0.295±0.011*

1.81±0.13*

 

 

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞,通过吞噬作用发挥细胞免疫防御功能,活化后的巨噬细胞吞噬功能显著增强[17]。本实验发现,高剂量多糖可明显增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力(P<0.05)(表2),环磷酰胺则显著降低了小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力(P<0.05),中剂量和低剂量多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力无明显影响。表明高剂量的阿魏侧耳胞外多糖可活化巨噬细胞,增强其吞噬外源细胞或异物的能力,提高小鼠的细胞免疫功能。

2.3 阿魏侧耳胞外多糖对荷瘤小鼠免疫器官指数和脾淋巴细胞增殖能力影响

脾脏和胸腺是机体重要的免疫器官,在获得性免疫应答中发挥重要作用。由表2可知,与荷瘤对照组相比,中剂量多糖和高剂量多糖均可不同程度地促进小鼠胸腺和脾脏两种免疫器官质量的增加,提高小鼠的胸腺指数
P<0.05)和脾脏指数(P<0.05),低剂量多糖对小鼠的免疫器官指数无显著影响(P>0.05);环磷酰胺则明显降低小鼠胸腺指数和脾脏指数(P<0.05),其中对胸腺的影响更为显著。

无菌分离的脾淋巴细胞体外培养的实验表明,低剂量多糖和高剂量多糖均可显著增强小鼠脾淋巴细胞的增殖能力(P<0.05)(表2);低剂量多糖对小鼠脾淋巴细胞的增殖无明显影响(P>0.05);而环磷酰胺则削弱了小鼠脾淋巴细胞的增殖能力(P<0.05)(表2)。表明一定剂量的阿魏侧耳胞外多糖可能通过增强淋巴细胞的增殖能力和巨噬细胞的吞噬能力,提高血液中白细胞和淋巴细胞数量,增加胸腺和脾脏的质量,进而增强机体免疫能力;而环磷酰胺则可能通过诱导模型鼠体内淋巴细胞凋亡,降低血液中白细胞和淋巴细胞数量,引起胸腺和脾脏的退化,在一定程度上抑制了机体免疫能力[18]。

2.4 阿魏侧耳胞外多糖对小鼠血浆中TNF-α含量影响

TNF-α是由单核细胞、巨噬细胞或淋巴细胞分泌产生的一种多效细胞因子,在炎症反应、免疫调节、抗肿瘤等方面起重要作用[19]。由表2得知,中剂量多糖和高剂量多糖可显著增加小鼠血浆中TNF-α含量(P<0.05),表明灌胃一定剂量的阿魏侧耳胞外多糖可提高小鼠免疫能力。环磷酰胺则明显降低小鼠血浆中TNF-α含量
P<0.05),从而降低了机体免疫能力[18]。

2.5 阿魏侧耳胞外多糖对小鼠S180实体瘤生长的影响

表 3 阿魏侧耳胞外多糖对小鼠S180实体瘤生长的影响(

x

676226.jpg

±sn=10)

Table 3 Modulation of extracellular polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi on the growth of implanted S180 tumor in mice
(

x

676200.jpg

± s, n = 10)

组别

给药剂量/(mg/kg体质量)

瘤体质量/g

荷瘤对照组

0

1.43±0.33

环磷酰胺组

25

0.33±0.09*

低剂量多糖组

50

1.27±0.20

中剂量多糖组

100

0.93±0.30*

高剂量多糖组

200

0.88±0.27*

 

 

由表3可知,与荷瘤对照组相比,中剂量多糖组、高剂量多糖组和环磷酰胺组小鼠S180实体瘤的质量均明显降低,表明中剂量和高剂量阿魏侧耳多糖对小鼠S180实体瘤的生长具有一定的抑制作用,结合前述实验结果,推测中剂量和高剂量阿魏侧耳胞外多糖通过提高机体巨噬细胞吞噬能力和血液中的TNF-α含量等多种免疫能力,进而增强机体的抗肿瘤能力,抑制模型鼠S180实体瘤的生长,降低S180实体瘤的质量。

3 结 论

作为“食用菌皇后”,阿魏侧耳具有不可忽视的药用价值[20],但目前对于阿魏侧耳胞外多糖的研究多集中于多糖的制备及理化性质方面[7,21],关于生物学活性的研究较少。本实验利用从阿魏侧耳液体发酵培养基中制备的胞外粗多糖,采用皮下注射小鼠腹水瘤细胞法建立荷瘤小鼠模型,以抗肿瘤药物环磷酰胺作为免疫抑制物参照,研究阿魏侧耳胞外粗多糖对荷瘤小鼠免疫功能的影响。实验结果表明,一定灌胃剂量(100、
200 mg/kg)的阿魏侧耳胞外粗多糖可通过增加小鼠血液中白细胞、淋巴细胞数量和TNF-α含量、增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力(200 mg/kg),提高脾淋巴细胞的增殖能力从而增加小鼠胸腺指数和脾脏指数,增强荷瘤小鼠的免疫能力,降低模型鼠S180实体瘤的质量,而低剂量(50 mg/kg)胞外多糖对实验测定的各种免疫功能指标无明显影响作用,这与邓春生等[22]的研究结论相似,因此,从阿魏侧耳液体发酵培养基中获得的胞外多糖在一定的灌胃剂量下具有增强荷瘤小鼠免疫能力的功效。

参考文献:

[1] 戴慧, 高晓明. 多糖特异性免疫识别的分子机制及其免疫生物学意义[J]. 中国免疫学杂, 2009, 25(1): 35-39.

[2] ESTEBAN A, POPP M W, VYAS V K, et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2011, 108(34): 14270-14275.

[3] DABA A S, EZERONYE O U. Anti-cancer effect of polysaccharides isolated from higher basidiomycetes mushrooms[J]. African Journal of Biotechnology, 2003, 2(12): 672-678.

[4] PINTO M R, BARRETO-BERGTER E, TABORDA C P. Glycoconjugates and polysaccharides of fungal cell wall and activation of immune system[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2008, 39(2): 195-208.

[5] CHAN G C, CHAN W K, SZE D M. The effects of β-glucan on human immune and cancer cells[J]. Journal of Hematology and Oncology, 2009, 2(25): 25-36.

[6] 谢燕霞, 安利国, 杨桂文. 植物多糖对巨噬细胞的免疫调节作用[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2008, 24(4): 307-314.

[7] 闫训友, 闫春江, 史振霞, 等. 乙醇提取阿魏侧耳发酵液多糖的优化设计[J]. 食品工业科技, 2008, 29(1): 197-199.

[8] 杨汉民. 细胞生物学实验[M]. 3版. 北京: 高等教育出版社, 2010: 166-168.

[9] 孙元琳, 顾小红, 李德远, 等. 当归多糖对亚急性辐射损伤小鼠的防护作用研究[J]. 食品科学, 2007, 28(2): 305-308.

[10] 李建军. 灵芝多糖免疫调节作用与抗肿瘤作用的关系及作用机制的研究[D]. 广州: 第一军医大学, 2007: 20-22.

[11] 高慧灵, 雷林生, 余传林, 等. 木蹄层孔菌多糖对小鼠免疫功能的影响[J]. 南方医科大学学报, 2009, 29(3): 458-461

[12] 苏东晓, 张名位, 廖森泰, 等. 龙眼果肉水溶性提取物对正常小鼠免疫调节作用的影响[J]. 中国农业科学, 2010, 43(9): 1919-1925.

[13] 牟光庆, 李霞, 李瑶喜. 乳酸菌胞外多糖增强小鼠免疫功能的研究[J]. 食品科学, 2009, 30(5): 260-262.

[14] 杨铁虹, 贾敏, 梅其炳. 当归多糖对细胞免疫功能的增进作用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21(6): 123-124.

[15] 康洁, 余慧琳. 两种细菌粗多糖对草鱼的免疫调节作用[J]. 中国农学通报, 2009, 25(23): 485-489.

[16] KÖLLNER B, KOTTERBA G. Temperature dependent activation of leucocyte populations of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, after intraperitoneal immunisation with Aeromonas salmonicida[J]. Fish and Shellfish Immunology, 2002, 12(1): 35-48.

[17] 张志敏, 王建华, 赵兴华, 等. 苦马豆素对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响[J]. 中国农业科学, 2008, 41(10): 3422-3428.

[18] 贾林, 陆金健, 周文雅, 等. 桔梗多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫调节[J]. 食品与机械, 2012, 28(3): 112-115.

[19] 徐春晓, 张智清. 肿瘤坏死因子受体生物学功能及其临床应用研究进展[J]. 微生物学免疫学进展, 2003, 31(1): 37-42.

[20] 闫训友, 王玮, 赵英. 阿魏侧耳多糖研究进展[J]. 北方园艺, 2007, 10(12): 243-245.

[21] 张金波. 阿魏侧耳深层发酵条件及其胞外多糖理化性质的研究[D]. 武汉: 华中农业大学, 2005: 26-27

[22] 邓春生, 吕作舟. 阿魏侧耳水溶性多糖免疫活性的研究[J]. 华中农业大学学报, 2002, 21(5): 447-449.

 

收稿日期:2013-12-12

基金项目:廊坊市科学技术研究与发展计划项目(2011012003);廊坊师范学院博士基金项目(LSZB201105)

作者简介:王晶(1983—),女,讲师,博士,研究方向为动物细胞工程和生物活性物质。E-mail:oucflora@163.com

*通信作者:闫训友(1978—),男,副教授,硕士,研究方向为真菌活性物质提取。E-mail:yanxunyou@163. com