脂质组学及其在营养与健康研究中的应用研究进展

陈宇欢,李 静,范亚苇,邓泽元*

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047)

 

要:脂质是生物体重要的大分子物质之一,结构和种类复杂,具有重要的生理功能。脂质代谢的异常可能引发诸如动脉粥样硬化等许多代谢疾病。脂质代谢组学是代谢组学的一个分支,是综合研究脂质代谢的一个重要手段。随着质谱与色谱联用技术的发展,脂质组学也得到快速发展。利用脂质组学研究脂质分子在代谢疾病中的作用受到越来越广泛的关注。本文主要介绍了脂质组学的研究方法,及其在人体脂质代谢疾病中的应用和研究进展。

关键词:脂质组学;研究进展;代谢疾病;营养

 

Lipidomics and Its Application in Nutrition and Health Research

 

CHEN Yu-huan, LI Jing, FAN Ya-wei, DENG Ze-yuan*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

 

Abstract: Lipids, compounds with complex structures and classes, are one important class of biomacromolicules in organisms. Abnormal lipid metabolisms may lead to many metabolic diseases, such as atherosclerosis. Lipidomics, a sub-branch of metabonomics, is an important approach aiming at comprehensive analysis of lipid metabolisms. Recent advancements in mass spectrometry combining with chromatography have led to the rapid development of lipidomics. Investigating the role of lipid molecules in metabolic diseases has attracted increasing attention. In this review, we focus on the analytical approaches in used in lipidomics research, and recent advances in their applications in the field of nutrition and health.

Key words: lipidomics; progress; metabolic disease; nutrition

中图分类号:Q591.5 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)15-0272-05

doi∶10.7506/spkx1002-6630-201415055

细胞和血浆中存在数以千计的脂质类别,这些脂质的结构、种类复杂,具有独特的化学特性,在诸如生物大分子间相互作用、基因转录和翻译调控、细胞信号转导、细胞间交互作用、指示细胞与病原体乃至环境变化等方面起到重要作用,进而影响生命体许多重要疾病,如动脉粥样硬化[1]、冠心病[2]、肥胖病[3]、糖尿病[4]、脑损伤[5]、帕金森病[6]和肝炎[7]等的发生、发展。我们已经了解到脂质与这些疾病关系密切,但对诸如脂质在这些疾病中的作用机理仍所知甚少。因此,人们希望借助脂质组学的方法更多揭示脂质与代谢疾病之间的关系。

脂质组学是代谢组学的一个分支,是研究脂质代谢、细胞信号等问题的一个重要手段。2003年,华盛顿医学部的Han Xianlin等[8]正式提出了脂质代谢组学的概念,即对脂质分子种属以及它们在生物学方面的作用,主要是与蛋白质表达有关的脂质代谢及其功能,包括基因调控等的全面描述[9]。

目前,脂质代谢组学在分析鉴定脂质及其代谢物、研究脂质功能与代谢调控以及绘制脂质代谢途径及网络等三大基础研究方面取得快速进展的同时,脂质代谢组学在脂质代谢疾病的预防、控制及诊断、脂质生物标志物、药物靶点的鉴定以及药物的研发等方面都取得了重要进展[10]。脂质组学的发展丰富了蛋白质组学和基因组学数据库,并且深入了我们对脂质在细胞中作用的认识[4]。

1 研究方法

为了增大研究的覆盖面,脂质组学的分析方法越来越向多元化发展。目前,液相色谱-质谱联用(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)、气相色谱-质谱联用(gas chromatograph mass spectrometer,GC-MS)、
毛细管电泳-质谱联用(capillary electrophoresis mass spectrometer,CE-MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)、薄层色谱(thin layer chromatography,TLC)等分析手段被广泛使用。

串联质谱是识别甘油磷脂的一种基本工具,目前已经在哺乳动物细胞中检测出超过1 000 种的磷脂。这一复杂性就导致不同种类分子同量异位素(isbaric species)之间不能被简单的直接进样质谱法分离开,如正离子模式下无法分离饱和的三十四碳(340)磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)和含一个不饱和键的三十四碳(34∶1)磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS);而当样品中出现同种分子的同量异位素时,情况就更加复杂,如38∶4磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)就能够组成18∶0/20∶4,18∶1/20∶3,16∶0/22∶4等几种脂肪酸组合[11]。

当前最常用的两种甘油磷脂鉴定和定量的方法是“鸟枪法”(shotgun lipidomics)和LC-MS法。二者在分析手段的联用方面是最为有效的两种分析方法。Han Xianlin等[12-16]在电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)技术上做了重要改进,创立了无需预先进行色谱分离的直接进样(direct infusion)质谱技术,即“鸟枪法”。这种方法的主要原理是源内分离(intrasource separation)。先在正离子或负离子模式下对直接进样的细胞提取物进行前体离子扫描(precursor ion scans,PIS)和中性丢失扫描(neutral loss scans,NLS),以确定其主要的脂质片段,再在负离子模式下以PIS分析测定脂肪酸的含量。现在,“鸟枪法”还广泛利用基于微流体的自动纳升电喷雾电离(nanospray)以进行低容量样本的检测。“鸟枪法”避免了液相色谱法中固有的样品残留问题,对识别和定量大约90%的磷脂都有很好的效果,如磷脂酰胆碱类(glycerophosphocholines,GPChos)、磷脂酰乙醇胺类(glycerophosphethanolamines,GPEtns)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)等。然而,这项技术在识别痕量磷脂上效果却不理想,除了那些含量最丰富的种类,“鸟枪法”在实现完全绝对的量化上也存在缺陷。

超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)与ESI联用可解决单纯的质谱分析法存在的同量异位素无法分离和离子抑制(ion suppression)等问题。采用正相液质联用法对磷脂进行最初的种类分离可减轻离子抑制作用,提高电离率和对副成分的敏感度。反相液相色谱与质谱联用适用于个别分子种类的详细分析,对包括多磷酸肌醇(polyphosphoinositides)在内的有限类别的分子具有很高的精度。Lisa等[17]采用了一种新方法,使用离线二维-亲水液相色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)、反相高效液相色谱-电喷雾电离联用(reversed phase high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry,RPHPLC-ESI)和大气压化学电离(atmospheric pressure chemical ionization,APCI)质谱,一次性地分离出了19 种极性各不相同的脂质。

毛细管电泳-质谱联用技术具有很高的分离能力和灵敏度,能较好地应用于包括脂质在内的生物大分子的分离检测。CE的一些常用分离模式包括毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)、胶束电动色谱(micellar electrokinetic chromatography,MEKC)、毛细管电色谱(capillary electro chromatography,CEC)等,都在CE-MS中得到了应用,其中CZE应用最为广泛[18]。Gao Fei等[19]建立起一种非水缓冲液体系的CE-MS技术,以增加磷脂的溶解度。利用优化的有机溶剂,小鼠腹膜提取物中的磷脂得以在16 min内得到分离,该实验进而对分离出PC、乙酰胺磷脂(ethanolamine phospholipids,PE)和PI进行了分析,证明了CE-MS应用于磷脂分析的可行性。

核磁共振能对少量样品进行测定,是一种快速、简单的分析方法。与液质联用不同,核磁共振不需要大量的优化参数,是一个很有效的定量测定手段,但对复杂的混合物通常不能直接定性分析。对碳架结构的信息所知有限而由两种物质得到类似的图谱则是NMR面临的另一个挑战。不过从另一个角度看,通过解析首基的结构,NMR对识别磷脂却十分有利。Estrada等[20]利用NMR和基质辅助激光解吸电离质谱(matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry,MALDI-MS)对成年人晶状体细胞膜中磷脂含量进行重新评估,发现人体晶状体细胞膜中含有相当大量的乙醚基甘油磷脂和其相应的溶血型分子。但总体而言,NMR的敏感度还是不如MS。

脂质组学的研究涵盖范围广泛,目前的分析方法中,任何一种都不能完整地检测出所有的脂质。然而,通过不同分析方法的联用和共用,能较好地克服单一技术的局限性。为了完善脂质组学的研究方法,就要求将传统脂质生物化学、脂质组学轮廓研究和脂质生物信息学结合起来[21]。

2 脂质组学在营养与健康研究中的应用

许多研究证明,脂质代谢紊乱或畸形会导致诸多人类疾病的发生。以肥胖病为例,这种由人体摄食和消耗卡路里不平衡引起的疾病[22]在很多发达国家已经成为普遍问题,而肥胖病人群在心血管疾病和糖尿病上也有相当高的患病风险[23]。脂质代谢所引发的疾病还远不止于此,所以,将特定分子种类脂质代谢的研究应用于营养学也就具有十分重要的意义。

脂质代谢的研究上升到组学水平以前,人们对生物体内脂质分子的种类和结构复杂性并没有充分的认识,这很大程度上影响了人们对脂质代谢反应在机体中的作用及其相关机理的重视,制约了针对脂质的系统分析。随着高通量、高精度脂质组学分析方法的引入,脂质种类、结构、功能及其代谢调控网络等问题得到了深入的研究,从而更好地揭示了脂质与生命体营养与健康之间的关系。

脂质组学在营养与健康中的研究主要集中于脂质对消化系统功能、神经系统功能和心血管疾病等的影响,以及脂质组学在生物标志中的应用。

2.1 脂质组学在消化吸收及其系统功能研究中的应用

许多消化系统疾病的的发生发展与脂代谢紊乱密不可分。在诸多消化器官中,肝脏受脂代谢紊乱的影响首当其冲。肝脏是脂肪代谢的主要器官,脂肪在肝脏内过量堆积可引发肝硬化等恶性疾病,反过来说,肝脏细胞的病变也将引起脂质代谢困难,由此可见脂代谢与机体健康间相互关联密切。通过脂质组学研究发现:人体摄入食物中脂肪的种类和数量将在肝脏中得到反映,肝脏中脂质结构改变对健康的影响更为重要。

Lamaziere等[24]以鱼油饲喂小鼠30 d之后,对其肝脏吸收二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)及二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)的差异进行了脂质组学评估。结果显示,小鼠大脑中EPA含量上升不明显,而肝脏中EPA的含量上升显著,含DHA的卵磷脂所占比例也显著提高。伴随着鱼油的补充,小鼠肝脏内单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFAs)总量显著降低,而总的ω-3多不饱和脂肪酸含量上升;饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸总量则无明显变化。结果表明,鱼油的长期供应改变了小鼠肝脏脂肪酸结构,但并没有过多改变肝脏的脂质总量。不仅如此,实验数据还证实了消费充足ω-3脂肪酸对机体健康的作用,帮助我们对临床上ω-3供给减少肝脂肪、预知非酒精性脂肪肝(non alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的机制有了更深的了解。

脂代谢异常而引发的消化系统病变并不局限于肝脏。越来越多的研究表明,诸如胆结石、胆管胆固醇沉积症、急性胰腺炎等消化系统疾病的重要诱因就是血脂水平异
常[25-26];许多消化系统恶性肿瘤血清胆固醇水平呈负相
关[27]。综合分析这些研究不难得出结论,对脂质代谢的深入探究能帮助我们更好地诊断和治疗相关消化系统疾病。

Sewell等[28]通过质谱分析法和稳定同位素标记法分析巨噬细胞鞘脂类和磷脂类成分,来研究脂质构成对克罗恩病(一种难以根治的恶性消化系统疾病)的影响。发现脂质构成的异常可能导致囊泡运输混乱,肠渗透性增加,巨噬细胞(macrophage)分泌促炎性细胞因子
(pro-inflammatory cytokines),从而引发克罗恩病。克罗恩病病人的巨噬细胞与健康人的相比,卵磷脂构成发生明显改变,新生成的磷脂酰肌醇16∶0/18∶1的比例减少;与健康细胞相比,克罗恩病病人细胞的鞘脂类、磷脂类和胆固醇酯类物质的构成遭到破坏,这或许有助于了解克罗恩病的病因。

2.2 脂质组学在神经系统功能研究中的应用

脂质在神经系统中履行了多重专一性功能。在大脑中,电子脉冲的传导、突触功能和复信号通路都依靠这些脂质、蛋白质和脂蛋白的交互作用。脂质组学的发展让我们对脂质在神经系统功能中所扮演的角色有了前所未有的了解。依靠“鸟枪法”、串联质谱法,加上对于磷脂种类的新发现,我们在脂质对大脑功能的影响上有了新的认识[29]。Guan Ziqiang[30]采用液质联用技术,对小鼠脑组织进行脂质组学的分析,发现了两种新的脂质:N-酰基磷脂酰丝氨酸(N-acyl phosphatidylserine,N-acyl-PS)
和dolichoic acid(DolCA)。

神经系统细胞、器官的功能很大程度上影响了人类的记忆力和情绪稳定,而脂质代谢水平也很大程度上制约了神经系统的功能。目前已经有许多研究将重点放在以脂质组学的方法探究脂质与神经系统功能的关系。

神经系统中膜内含磷物质和鞘脂类物质含量的变化对细胞内和细胞间信息传导有至关重要的影响。Demirkan等[31]对一个荷兰家族742 名成员进行调查,采用电喷雾电离-质谱联用(ESI-MS/MS)测量了148 种不同的血浆内含磷脂物质和鞘脂类物质(sphingomyelins,SM),并以医院焦虑及抑郁评分(the hospital anxiety and depression scals,HADS-A和HADS-D)和流行病学研究中心抑郁量表(centre for epidemiological studies depression scale,CES-D)对其进行抑郁、焦虑症状的评估。结果表明,血浆中磷脂酰胆碱PC O 36∶4及鞘磷脂SM 23∶1含量都与抑郁、焦虑成逆相关。PC O 36∶4是一种乙醚基磷脂酰胆碱,这类PC在血浆中成分较少,但在大脑中所占比例很高。笔者认为,在血浆中观察到的这些脂质变化,很可能是大脑中过于活跃的乙醚基脂类裂解的反映,这很有可能与抑郁症发病机理的通路有关。这一报道也为抑郁、焦虑症的研究提供了线索。

细胞膜多不饱和脂肪酸水平随年龄增大而趋衰减,这有可能导致认知功能的损害和记忆衰退。Little等[32]以脂质组学的方法分析DHA供应对年轻小鼠和老年小鼠大脑皮层中脂质种类和磷脂分子的变化的影响。该研究采用高扫描场核磁共振氢谱(H-NMR)和ESI-MS/MS
法对脂质提取物进行检测。H-NMR结果显示,随着年龄增长,小鼠大脑皮层中DHA含量、不饱和指数和总二酰基甘油磷脂含量均有下降,同时,鞘磷脂、鞘脂类和胆固醇含量有所提升。年轻组DHA处理在各项指标上都未有数据上的显著效果,而老年组的DHA处理则帮助不饱和指数上升到了与年轻组相当的水平。详细的磷脂轮廓分析显示,老龄化减少了多不饱和脂肪酸种类(如PE 18∶0/22∶6,PS 18∶1/22∶0,PI 18∶1/22∶6)的分布,增加了单不饱和脂肪酸种类(如PS 18∶1/22∶0,
PC 16∶0/16∶1,SM 18∶1/24∶1)的分布,而DHA处理提高了新的PS和PI的合成率,二者对于细胞膜的流动性和突触传导有重要作用,而这也许就是DHA能够增强认知能力和记忆力的原因。

2.3 脂质组学在心血管疾病研究中的应用

脂质组学的兴起和发展也为从整体水平上研究心血管疾病的病理过程提供了新的途径。脂质代谢的紊乱积累到一定程度可导致机体的病理变化,影响血液循环系统正常生理活动。如动脉粥样硬化的直观表现就是脂质呈现黄色粥样积聚在动脉内膜上,使血管管壁变硬失去弹性,通量缩小。脂质组学在心血管疾病研究中的应用主要表现为对其的早期诊断、预防治疗及病理生理学的研究等方面[33]。

Graessler等[34]采用top-down“鸟枪法”,对19 个男性高血压病人与50 个正常男性的血浆样本中的10 种主要的脂类中的95 种脂质分子进行分析。结果显示,高血压病人血浆中乙醚基脂类,特别是含20∶4和22∶5的磷脂酰胆碱醚脂和磷脂酰乙醇胺醚脂含量显著降低,游离胆固醇的含量也有减少。

Stegemann等[35]调查了有症状和无症状患者颈动脉内膜样本的不同,以健康人体样本作为对照,采用质谱法分析样本的脂质总类。实验结果发现,相对于血浆样本而言,动脉粥样硬化斑块的胆固醇酯较高,特别是含长链脂肪酸的多元不饱和胆固醇酯。脂肪种类轮廓的变化,很有可能反映了炎症介质底物可利用性的变化,而这种变化就是动脉粥样硬化病程的基础。从更具实际意义的角度来看,对动脉粥样硬化斑块的脂质种类轮廓进行系统的分析,有助于这一疾病的诊断和治疗。

利用脂质组学方法监控食物对人体心血管疾病的影响也为心血管疾病的早期预防提供了可靠依据。Lankinen等[36]以低脂鱼和高脂鱼进行了8 个星期的干预实验,利用脂质组学的方法研究其改变血清中脂组学轮廓对于心血管疾病发病的影响。包括神经酰胺、溶血卵磷脂、甘油二酯在内的具有多样生物活性的脂质在多脂鱼组中显著减少。这个现象可能说明多脂鱼对动脉粥样硬化、胰岛素抵抗等疾病的发展有一定保护作用。

2.4 脂质组学在生物标记中的应用

由于脂质具有一系列的生理功能,它们也被寄希望于能反映生命体疾病中的代谢状态。结合特定的生物样本,如细胞、动物模型以及病人的体液、组织等监测脂质代谢物,将有助于发现代谢疾病的脂质生物标记物[37]。应用脂质组学能够帮助我们确定导致机体代谢紊乱,或在生命体病态下呈现表达异常的脂生物标记物,从而分析并找到可能的发病机理,预防并提前判断疾病的发生。

Llorente等[38]对PC-3前列腺癌细胞释放的外来体(exsome)进行了分子脂质组学的研究。这项研究对大约280 种脂质分子进行了定量测定,提供了迄今为止针对于细胞和外来体最广泛的脂质研究。研究发现,外来体相对于母体细胞,其脂质含量有了明显的提高,特别是鞘糖脂、长链鞘磷脂、胆固醇、磷脂酰丝氨酸PS18∶0/18∶1含量显著提高,外来体每毫克蛋白质所含的脂质总量提高了8.4 倍,脂质分子的数目大约是蛋白质分子的65 倍。对外来体脂质构成的研究,证明它们的膜结构是高度有序的,加之其中的高鞘糖脂含量,很有可能就是外来体在胞外环境维持稳定的原因,而这也是它们在细胞间进行讯息传递的基础。实验具体数据为外来体形成、释放和功能机制的研究提供了依据,外来体中几种含量明显提高的脂质也具有作为PC-3前列腺癌,甚至其他癌症生物标记物的潜质。

Boccio等[39]运用脂质组学方法描述了血浆脂质在多发性硬化中的作用。多发性硬化是一种神经变性的自身免疫脱髓鞘病,自身免疫应答在脑炎中的介质通常是蛋白质,而近来的研究表明脂质也可能是其介质。Baccio采用了液相色谱-质谱联用法,对10 种代谢物进行检测,发现多发性硬化病人溶血性甘油磷酸胆碱(lyso-glycerophosphatidylcholine,lysoPC)占甘油磷酸胆碱(glycerophophatidylcholine,GPC)的比例显著降低,这一发现暗示,血浆中磷脂代谢的变化可能可以作为多发性硬化的生物标记物。

对脂生物标记物的研究是一种深入了解发病机制的有效手段,这将很有可能最终成为开发诊断治疗方法的有力依据。而脂质组学提供的高通量、高精度,快速的系统研究对发现和识别脂标记物有着很大的帮助。

3 结 语

脂质组学作为一门近年来发展迅猛的新兴学科,在细胞生物学、疾病诊断、疾病生物标志物及医药研发等方面已取得了很大的进展。然而相比蛋白质组学、基因组学而言,人们对脂质组学的认识还不够深入,脂质组学相应的数据库也较为缺乏,而脂质种类的复杂也限制了脂质组学在实践中的应用。将脂质组学技术应用于营养学的研究更是处于起步阶段,有许多问题有待解决。近年来,以脂质组学与糖代谢、毒物代谢组学[40],乃至基因组学、蛋白质组学进行组合,为与脂质相关疾病的预警、诊断和治疗提供了新的方法,蕴藏着很大的发展潜力。这些问题,都有待今后的研究深入下去。我们也期待进一步的研究能够深入揭示特异性的脂质如何参与生命过程及其在复杂的细胞间的交互作用。

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收稿日期:2013-06-22

基金项目:国家自然科学基金地区科学基金项目(31060214);江西省自然科学基金项目(2009GZY0148)

作者简介:陈宇欢(1993—),女,硕士研究生,研究方向为营养与食品功能成分。E-mail:lockon2283@126.com

*通信作者:邓泽元(1963—),男,教授,博士,研究方向为食品营养和功能食品。E-mail:dengzy@ncu.edu.cn