大孔树脂分离纯化南极磷虾壳中的虾青素

姜启兴1,宋素梅1,夏文水1,刘富俊2,许艳顺1,刘冬梅2,王海鸥1,*

(1.江南大学食品学院,江苏 无锡 214122;2.辽宁省大连海洋渔业集团公司,辽宁 大连 116113)

 

摘 要:研究AB-8大孔吸附树脂对虾青素的静态、动态吸附效果。结果表明,AB-8树脂对虾青素的最大吸附量为476.2 μg/g干树脂,乙酸乙酯对虾青素的解吸率为98.7%;动态吸附条件为虾青素上样质量浓度2 μg/mL、上样流速4BV/h。此条件下,皂化液中虾青素的回收率为78.9%,纯度为92.4%。

关键词:南极磷虾壳;大孔吸附树脂;分离纯化;虾青素

 

Separation and Purification of Astaxanth from Antarctic Krill Shells by Macroporous Resin

 

JIANG Qi-xing1, SONG Su-mei1, XIA Wen-shui1, LIU Fu-jun2, XU Yan-shun1, LIU Dong-mei2, WANG Hai-ou1,*

(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;

2. Liaoning Province Dalian Ocean Fishery Group, Dalian 116113, China)

 

Abstract: In the present study, the static and dynamic adsorption capacities of AB-8 macroporous resins for astaxanthin from Antarctic krill shells were evaluated. The results showed that the maximum quantity of astaxanthin adsorbed was 476.2 μg per gram of dry AB-8. Ethyl acetate was selected as the elution solvent with a desorption rate of 98.7%. The dynamic adsorption conditions were optimized as 2 μg/mL and 4 BV/h for astaxanthin concentration and flow rate, respectively. Under the optimal condition, the astaxanthin in saponification solution was purified with recovery rate of 78.9% and purity of 92.4%.

Key words: Antarctic krill shells; macroporous resin; separation and purification; astaxanthin

中图分类号:TS254.9 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)16-0001-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201416001

近年来,随着资源问题的日益严峻,远洋资源的开发利用成为各国争相研究的课题。据估计,南极磷虾的生物量为6.5~10.0亿 t,几乎遍布整个南极海域,资源极其丰富[1-4]。而虾青素是南极磷虾壳中含量比较丰富的活性成分,具有超强的抗氧化活性以及显著的着色能力,在食品、医药、化妆品和饲料等行业具有重要作用[5-12]。目前,国内研究更多关注南极磷虾肉中蛋白、脂溶性成分等的分离和应用[13],国外则侧重于对酶、脂肪酸等的分离纯化及其性质分析[14-16],对南极磷虾壳资源的研究较少。而虾壳大多作为废弃物丢弃,亟需有效的开发利用。

目前,大孔吸附树脂不仅广泛应用于水溶性总类胡萝卜素的吸附和分离,如芦丁、绿原酸、牛蒡以及苷类物质[17-19],还越来越多地应用于非水体系总类胡萝卜素的吸附和分离,如葛根素、芹黄素和香豆素等[20-22]。然而,有关大孔吸附树脂分离纯化虾青素的研究较少。本实验在探索大孔树脂对虾青素吸附条件的基础上,进一步分析了大孔树脂分离纯化皂化液中游离虾青素的效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾由辽宁省大连海洋渔业集团公司提供,虾壳经有机溶剂提取、脱溶得色素油,经NaOH皂化后得皂化液;虾青素标准样品(纯度≥97.1%) 德国
Dr.Ehrenstorferg公司;皂化液(游离虾青素含量为55.75 μg/mL 实验室现配;丙酮、乙醇、正己烷、乙酸乙酯(均为分析纯),二氯甲烷、甲醇、乙腈(均为色谱纯) 国药集团化学试剂有限公司;AB-8、S-8、D3520树脂 南开合成公司;LX-16、LX-10G、LX-17树脂 西安蓝晓科技有限公司。

1.2 仪器与设备

1525高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、色谱柱Spherisorb® Silica(4.6 mm×250 mm,5 μm 美国Waters公司;AB104-N电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大孔吸附树脂的预处理

取树脂,用无水乙醇浸泡24 h,醇洗至流出液与水1∶5(v/v)不混浊,再用去离子水冲洗至无醇味;然后用5% HCl溶液浸泡2~4 h,用去离子水冲洗至中性;最后用2% NaOH溶液浸泡2~4 h,用去离子水冲洗至中性。

1.3.2 大孔树脂对虾青素的吸附和解吸效果

称取预处理后的树脂AB-8、S-8、D3520、LX-17、LX-10G、LX-16各5.0 g(干质量1.0 g左右,下同)于具塞锥形瓶中,分别加入4 μg/mL的虾青素乙醇溶液(虾青素标样溶于乙醇,下同)50 mL,摇床振荡4 h(30 ℃、70 r/min),用绢布过滤,滤液于472 nm(光谱扫描所得最大吸收波长)处测定吸光度,向树脂中加入50 mL丙酮,恒温水浴振荡4 h(30 ℃、70 r/min),于472 nm波长处测定解吸液的吸光度。计算树脂对虾青素的吸附率、解吸率和吸附量。

1.3.3 树脂静态吸附动力学曲线

取AB-8、LX-10G和LX-16树脂各5.0 g于具塞锥形瓶中,加入4 μg/mL的虾青素乙醇溶液50 mL,恒温水浴振荡(30 ℃、70 r/min),每20 min于472 nm波长处测定总类胡萝卜素液的吸光度,计算树脂对虾青素的吸附量,直至吸附平衡。

1.3.4 树脂静态吸附等温线

称取AB-8树脂 5.0 g于具塞锥形瓶中,分别加入2、4、6、8、10 μg/mL的虾青素乙醇溶液10 mL,于25 ℃恒温水浴振荡5 h,吸附平衡后于472 nm波长处测定吸光度。

1.3.5 不同溶剂对虾青素的解吸效果

称取AB-8树脂5.0 g于具塞三角瓶中,加入4 μg/mL的虾青素乙醇溶液10 mL,于25 ℃恒温水浴振荡3 h,达到吸附平衡。然后分别用10 mL乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯进行解吸,用氮气吹干溶剂,乙醇复溶,于472 nm波长处测定吸光度,计算虾青素的解吸率。

1.3.6 虾青素上样质量浓度对AB-8动态吸附的影响

称取AB-8树脂 5.0 g,湿法装柱(D10 mm×
200 mm),树脂高度13 cm,柱床体积10 mL(1 BV),用恒流泵以2 BV/h的流速分别将1、2、4 μg/mL的虾青素乙醇溶液泵入玻璃柱内,每10 mL即1 BV收集1管,于472 nm波长处测定吸光度,计算流出液质量浓度。以流出液体积为横坐标,流出液中虾青素质量浓度为纵坐标,绘制动态吸附曲线。

1.3.7 上样流速对AB-8树脂动态吸附的影响

称取AB-8树脂5.0 g于具塞三角瓶中,加入4 μg/mL的虾青素乙醇溶液10 mL,于25 ℃恒温水浴振荡3 h,达到吸附平衡。然后分别用10 mL乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯进行解吸,用氮气吹干溶剂,乙醇复溶,于472 nm波长处测定吸光度,计算虾青素的解吸率。

1.3.8 AB-8树脂再生对虾青素吸附率的影响

称取5.0 g经过预处理的AB-8树脂于具塞三角瓶中,加入4 μg/mL的虾青素乙醇溶液50 mL,按照吸附-解吸-再生的顺序重复操作,测定虾青素溶液吸附前后的吸光度,分析吸附率的变化。其中,吸附条件:恒温水浴振荡(30 ℃、70 r/min),4 h;解吸条件:恒温水浴振荡(30 ℃、70 r/min),10 mL乙酸乙酯解吸2 h;再生方法同1.3.1节方法。

1.3.9 AB-8树脂分离纯化皂化液中的虾青素

称取AB-8树脂 5.0g,湿法装柱(D10 mm×
200 mm),树脂高度13 cm,柱床体积10 mL(1 BV)。制备皂化液 7.5 mL,皂化12 h时,用无水乙醇稀释皂化液中的虾青素至2 μg/mL。用恒流泵以4 BV/h的流速将稀释后的皂化液泵入AB-8层析柱内,每10 mL收集1管至吸附平衡。接着用H2O冲洗柱子至流出液的pH值为中性,然后无水乙醇冲洗除去H2O,最后用乙酸乙酯解吸。记录吸附平衡时皂化液的体积、虾青素吸附量以及解吸液中虾青素的含量。浓缩除去乙酸乙酯,用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)测定游离虾青素的含量,根据虾青素标准曲线进行计算,即S=123.15C-91.77,R2=0.996 4,式中:S为峰面积/(mAU•s);C为虾青素质量浓度/(μg/mL)。

1.3.10 HPLC的色谱条件

色谱柱:Ecosil反相C18柱(4.6 mm×250 mm);流动相:包括A和B,其中A为二氯甲烷-甲醇-乙腈-水(5.085.05.54.5,V/V),B为二氯甲烷-甲醇-乙腈-水(22.028.045.54.5,V/V);梯度洗脱:0%的B洗脱8 min,0%~100%的B洗脱24 min;流速0.8 mL/min;柱温30 ℃;检测器:二极管阵列检测器(diode array detector,DAD);进样量5 μL;检测波长476 nm(DAD扫描结果)。

1.4 数据处理

数据分析采用SPSS 18软件;数据绘图采用Origin 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 不同大孔树脂对虾青素的分离效果

2.1.1 树脂的基本指标及吸附解吸效果

根据虾青素分子中含有共轭双键和苯环的结构特点,选择常用的S-8、AB-8、D3520,以及LX系列树脂,测定各树脂的基本参数及吸附、解吸性能,结果见表1。

表 1 树脂的性质及吸附解吸效果

Table 1 Physical properties and absorption capacities of
macroporous resins

树脂

种类

极性

粒径/mm

比表面积/

(m2/g)

孔径/nm

含水量/%

吸附率/%

解吸率/%

吸附量/

μg/g

S-8

0.3~1.25

320~420

28~30

76.3±1.3d

57.8±1.7b

96.4±1.2b

106.6±7.5c

AB-8

0.3~1.25

480~520

13~14

69.3±1.7b

85.6±2.5d

93.4±2.0b

120.9±9.4c

D3520

0.3~1.25

350~450

8.5~9.0

72.8±1.5c

73.8±2.5c

95.7±1.5b

117.1±8.6c

LX-17

0.3~1.25

≥460

30

63.5±1.5a

25.8±1.0a

96.1±1.1b

27.9±2.8a

LX-10G

0.3~1.0

≥860

18

68.4±1.2b

88.1±3.2d

92.1±1.4b

109.9±5.6c

LX-16

1.0

≥800

16

64.7±1.8a

92.9±3.4e

84.3±2.6a

92.1±3.5b

 

 

注:同列肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

 

从表1可以看出,AB-8、LX-10G和LX-16等弱极性或非极性树脂的吸附率均大于85%,而强极性树脂S-8、LX-17的吸附率分别为57.8%和25.8%。这主要由于虾青素是弱极性分子,更容易与极性相似的树脂大分子形成π-π共轭,成为树脂吸附虾青素的主要作用力。AB-8、LX-10G和LX-16的解吸率分别为93.4%、92.1%和84.3%,无明显差异;吸附量分别为120.9、109.9 μg/g和92.1 μg/g干树脂。因此,选择AB-8、LX-10G和LX-16进一步分析。

2.1.2 树脂静态吸附动力学曲线

736781.jpg 

图 1 AB-8、LX-10G和LX-16树脂吸附虾青素的动力学曲线

Fig.1 Adsorption kinetics of astaxanthin on AB-8, LX-10G and LX-16

由图1可见,在起始的60 min内,3 种树脂对虾青素的吸附量快速增大,而后增速减缓,可能由于虾青素向树脂微孔中扩散时存在传质阻力。3种树脂都在约180 min时达到吸附平衡。吸附时间相同时,AB-8树脂的吸附量总是高于LX-10G和LX-16。因此选择AB-8树脂为后序实验的吸附树脂。

2.2 AB-8树脂对虾青素的静态吸附和解吸效果

2.2.1 等温吸附曲线

实验表明,AB-8树脂对虾青素的吸附量随虾青素质量浓度的增加而增加,线性关系明显。因此,考虑用Langmuir方程来表示吸附过程:

736764.jpg 

式中:Qe为平衡吸附量/(μg/g干树脂);Qm为最大吸附量/(μg/g干树脂);Ce为吸附平衡时虾青素溶液质量浓度/(μg/mL);K为经验常数。

736805.jpg 

图 2 AB-8树脂的等温吸附线

Fig.2 Adsorption isotherm of AB-8 resin

如图2所示,AB-8树脂Langmuir模型的相关系数高达0.9973,说明吸附过程属于单分子层吸附。经计算,最大吸附量为476.2 μg/g干树脂。

2.2.2 不同溶剂对虾青素的解吸效果

表 2 不同溶剂对虾青素的解吸率

Table 2 Desorption rates of astaxantinon with different solvents

溶剂

乙醇

正己烷

丙酮

乙酸乙酯

解吸率/%

10.3±1.8a

96.5±1.0c

93.4±1.6b

98.7±1.4c

 

注:同行肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

 

由表2可以看出,乙醇对虾青素的解吸率最低,仅为10.3%,而丙酮、正己烷、乙酸乙酯的解吸率都在90%以上,且乙酸乙酯的解吸率最高,为98.7%。这可能由于乙醇为强极性有机溶剂,而虾青素为弱极性化合物,根据相似相溶的原理,当虾青素吸附于树脂上时,乙醇对其解吸能力低于中等极性或非极性溶剂。

2.3 AB-8树脂对虾青素的动态吸附效果

2.3.1 虾青素上样质量浓度对动态吸附的影响

736823.jpg 

图 3 虾青素上样质量浓度对AB-8树脂动态吸附曲线的影响

Fig.3 Effect of astaxanthin concentration on dynamic adsorption
curve of AB-8 resin

由图3可知,随着上样量的增加,流出液中虾青素的含量逐渐增加。虾青素质量浓度越大,初始阶段的吸附速率越大,泄漏点也逐渐提前,如1、2、4 μg/mL的泄漏点分别为10、8、6 BV。质量浓度低,耗时较长,质量浓度过高会增大传质阻力,能耗较大。因此,结合经济效益,选择虾青素质量浓度为2 μg/mL。虾青素质量浓度2 μg/mL,流出液体积24 BV时,流出液中虾青素的质量浓度与初始质量浓度几乎相等,即达到吸附平衡。

2.3.2 上样流速对动态吸附的影响

表 3 上样流速对吸附效果的影响

Table 3 Effect of flow rate on adsorption efficiency

流速/(BV/h)

1

2

4

6

泄漏体积/BV

11.0

8.5

6.5

4.0

 

 

由表3可知,随着流速的增大,虾青素的泄漏体积逐渐提前。当流速达到6 BV/h时,虾青素收集量仅为4.0 BV时即发生泄漏;而流速为1.0 BV/h时,收集11 BV的虾青素时才发生泄漏。这可能由于流速过大时,溶质分子尚未被树脂吸附就提前发生泄漏,样品流失较多;然而流速过小,吸附时间延长使得样液中虾青素过长时间的与树脂结合,可能导致虾青素的降解,回收率下降,而且长时间的吸附使得树脂再生困难。因此选择上样流速为4 BV/h。

2.3.3 AB-8树脂再生对虾青素吸附率的影响

736840.jpg 

图 4 AB-8树脂再生对虾青素吸附率的影响

Fig.4 Effect of AB-8 resin regeneration on adsorption rate of astaxanthin

由图4可知,AB-8树脂经过15 次吸附-解吸-再生的重复操作之后,对虾青素的吸附能力略有降低,仅下降了3.28%,因此,AB-8树脂用于非水介质中虾青素的分离纯化将十分经济有效,可应用于虾青素的规模化生产。

2.4 AB-8树脂分离纯化皂化液中的虾青素

表 4 AB-8树脂对皂化液中虾青素的吸附和解吸

Table 4 Adsorption and desorption of astaxanthin in saponification solution on AB-8 resin

指标

吸附

H2O冲洗

乙醇冲洗

乙酸乙酯解吸

回收率/%

质量浓度/(μg/mL

2

 

2

 

78.9

流速/(BV/h)

4

4

2

10

体积/BV

21

3

1

2

虾青素含量/μg

345.8

 

15

330.0

 

注:回收率/%=解吸液中虾青素含量×100/虾青素上样总量=330.0× 100/418.0。

 

按表4的流程,用AB-8吸附皂化液中的虾青素;通过H2O冲洗除去皂化反应生成的盐类物质;接着用乙醇冲洗除去H2O(由表2可知,乙醇解吸率低,为除去H2O,同时减少虾青素的损失,选择乙醇除杂溶剂),最后用乙酸乙酯解吸,测定吸附和解吸过程的中各项指标。

如表4所示,将稀释至2 μg/mL的皂化液以4 BV/h的流速泵入柱内,21 BV即210 mL时吸附游离虾青素的总量为345.8 μg。首先用H2O以4 BV/h的流速洗脱,用精密pH试纸检测洗脱液的pH值,约3 BV即可使pH值由9.0降至7.0,接着用约1 BV的无水乙醇冲洗柱内的H2O,最后用乙酸乙酯洗脱,约2 BV,得到虾青素溶液。通过浓缩除去乙酸乙酯,用HPLC测得虾青素330.0 μg,即一次吸附的回收率为78.9%。通过HPLC检测可知,纯度为92.4%。H2O冲洗和乙醇冲洗过程中,将树脂表面吸附的部分虾青素冲洗下来,造成了回收率的下降。

3 结 论

在比较S-8、AB-8、D3520、LX-17、LX-10G和LX-16树脂对虾青素标准溶液的吸附和解吸效果的基础上,选择AB-8为吸附树脂。AB-8对虾青素的最大吸附量为476.2 μg/g干树脂,选择乙酸乙酯作为解吸溶剂;动态吸附条件为虾青素质量浓度2 μg/mL、上样流速4 BV/h。此条件下,皂化液中的虾青素回收率为78.9%,纯度为92.4%。

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收稿日期:2013-08-05

基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA090801)

作者简介:姜启兴(1977—),男,副教授,博士,研究方向为食品加工与保藏。E-mail:qixingj@163.com

*通信作者:王海鸥(1956—),女,副教授,硕士,研究方向为食品加工与保藏。E-mail:howang@126.com