腰果蛋白的提取工艺条件优化

钟俊桢,顿儒艳,黄宗兰,刘 伟,刘成梅*

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047)

 

摘 要:以腰果为原料,分析腰果仁的主要成分,比较研究不同提取方法对蛋白质提取率的影响;以料液比、提取液pH值、提取温度、提取时间为单因素,运用单因素和正交试验设计,优化腰果蛋白提取的最佳工艺条件。结果表明:腰果仁中粗脂肪含量最高,达44.13%,其他组分含量为:碳水化合物22.91%、蛋白质19.41%、水分3.07%、灰分2.45%;研究发现碱提法提取效果最佳,并确定其最佳工艺条件为料液比140(g/mL)、提取液pH 9、提取温度35 ℃、提取时间1.5 h,此条件下获得的腰果蛋白提取率可达79.0%,腰果蛋白质的纯度为86.62%。腰果蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明:腰果蛋白主要含有22、26.2 kD的亚基,其次是14.1、16 kD,少量亚基为67.5、88 kD。

关键词:腰果;蛋白质;营养成分;提取优化;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶

 

Optimizing the Extraction of Protein from Cashew Nuts

 

ZHONG Jun-zhen, DUN Ru-yan, HUANG Zong-lan, LIU Wei, LIU Cheng-mei*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

 

Abstract: In the present study, cashew nuts were analyzed for main chemical components. A comparative investigation of different extraction methods for protein extraction from cashew nuts was made. The extraction process was optimized with regard to solid-to-liquid (S/L) ratio, solvent pH, extraction temperature and time by single-factor and orthogonal array designs. The results showed that crude fat was the most abundant component in cashew nuts with a level of 44.13%, which also contained 22.91% carbonhydrates, 19.41% protein, 3.07% water and 2.45%. The best extraction efficiency was achieved using alkali extraction and the best experimental conditions were found to be extraction at 35 ℃ for 1.5 h using an extraction solvent at pH 9 with an S/L ratio of 1:40 (g/mL). Under the optimized conditions, the yield of protein was 79.0% with a purity of 86.62%. SDS-PAGE analysis showed that the major subunits of cashew nuts protein had a molecular mass of 22 and 26.2 kD, respectively, and 14.1- and 16-kD subunits and a small amount of 67.5- and 88-kD subunits were also observed.

Key words: cashew nuts; protein; nutritional components; optimized extraction; sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

中图分类号:TS255.6 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)16-0018-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201416004

腰果属多年生热带常绿乔木果树,生于热带亚热带,是世界四大著名坚果之一,具有非常高的营养药用和保健价值[1]。腰果果仁营养丰富,多用于制腰果巧克力、点心和油炸盐渍食品。腰果仁油为上等食用油,副产品有果壳液、果梨等[2]。腰果的果仁约含40%~57%的油和21%蛋白质,蛋白质含量是一般谷类作物的2 倍之多,氨基酸的种类与谷物中氨基酸的种类互补,是一种具有高营养价值的食物[3]。有研究[4]显示浓缩腰果蛋白可作为营养添加剂添加入食品中,增强食物的营养,还可以作为功能性食品,改善人体由于缺少蛋白质而引起的一些疾病等。现代医学研究表明,腰果具有许多重要的医药保健作用,例如抗癌、抗菌等作用。目前,主要研究是关于腰果油和腰果酚的报道[5-8],对于腰果果仁中蛋白质的利用和开发还少有研究。Prabha等[9]通过腰果球蛋白粕喂养大鼠,对其监测腰果球蛋白饮食对脂质代谢的影响。Ogunwolu等[10]报道了腰果中浓缩蛋白和分离蛋白的功能性质。Bora等[11]比较研究天然腰果蛋白和变性蛋白功能性质的区别。Yuliana等[12]研究pH值和NaCl对腰果壳分离蛋白功能性质的影响。尽管有一些腰果蛋白功能性质的研究报道,但关于提取优化的工艺研究甚少。腰果蛋白的提取工艺的优化为食品加工产业化提供理论指导,为稀有资源的开发与利用提供理论依据,也丰富了食品行业、医药业保健药品的开发利用等。

本实验主要以腰果为原料,分析其主要成分,对腰果蛋白质的提取方法及工艺条件进行研究,以期得到最佳提取工艺,并运用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)法对提取的腰果蛋白进行分析,为腰果蛋白加工利用等研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腰果购于南昌洪城大市场,于0~4 ℃贮藏。

SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂 美国Sigma公司;所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HR83型快速卤素水分测定仪 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Sx-4-10型马弗炉 湖北英山国营试验设备厂;FreeZone12plus真空冷冻干燥机 美国
Labconco公司;KV-9820自动凯氏定氮仪 美国Microfluidics公司;UV-1600PC紫外分光光度计 上海天美科学仪器有限公司;LXJ-IIBB高速离心机 上海安亭科学仪器厂;HH-4数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制度有限公司;041BR86999电泳仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 原料营养成分的测定

水分含量测定:采用常压干燥法,GB/T 5009.3—2010《食品中水分的测定》;碳水化合物含量测定:采用GB/T 5009.7—2003《食品中还原糖的测定》的方法;粗脂肪含量测定:采用索氏提取法,GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的测定》;蛋白质含量测定:采用凯氏定氮法,GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》;灰分含量测定:采用灼烧法,GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的测定》。

1.3.2 蛋白质含量的测定

蛋白质含量测定:采用考马斯亮蓝Bradford法[13],以牛血清蛋白为标准蛋白,考马斯亮蓝G-250染色,得标准曲线方程为:Y=0.004 6X-0.012 5,R2=0.996 4。按下式计算腰果蛋白提取率。

752536.jpg 

1.3.3 原料处理及蛋白提取

1.3.3.1 原料预处理

实验前选取颗粒饱满、无病虫害、质地均匀的腰果,取一定量的腰果在粉粹机中进行粉碎,放在干燥器中备用,用石油醚脱脂[14],得到腰果粉。

1.3.3.2 腰果蛋白提取方法选择

1)Tris-HCl法[15]:取脱脂后的样品1 g,向其中加入50 mL 0.2 mol/L pH 8的Tris-HCl缓冲液,搅拌溶解,并在45 ℃条件下浸提6 h,于4 000 r/min离心15 min,取上清液测定蛋白质含量。

2)盐溶法:取脱脂后的样品1 g,向其中加入50 mL 0.14 mol/L的NaCl溶液,搅拌溶解,并在45 ℃条件下浸提6 h,于4 000 r/min转速下离心15 min,取上清液测定蛋白质含量。

3)碱溶酸沉法[16]:取脱脂后的样品1 g,向其中加入50 mL的蒸馏水,用0.01 mol/L的NaOH溶液调pH值至10,搅拌溶解,并在45 ℃条件下浸提6 h,于4 000 r/min离心15 min,取上清液测定蛋白质含量。

1.3.4 蛋白质提取工艺的确定

1.3.4.1 单因素试验设计

采用碱提法,在其他条件一定时,料液比采用110、120、130、140、150、160(g/mL)6 个水平,0.01 mol/L的NaOH溶液调节提取液pH值7、8、9、10、11、12共6 个水平,提取温度采用25、30、35、40、45、50 ℃ 6 个水平,提取时间采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h共5 个水平分别进行单因素试验。

1.3.4.2 正交试验设计

根据单因素试验结果,选择料液比、提取液pH值、提取温度、提取时间进行四因素三水平L9(43)正交试验,试验设计见表1。

表 1 正交试验因素与水平

Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

水平

因素

料液比(g/mL)

pH

提取温度/℃

提取时间/h

1

130

7

30

1.0

2

140

8

35

1.5

3

150

9

40

2.0

 

 

1.3.5 SDS-PAGE凝胶电泳[17]

将提取的腰果蛋白配制成1 mg/mL溶液,与样品缓冲液(pH 6.8、0.5 mol/L Tris-HCl 2.0 mL,10 g/100 mL SDS 4.0 mL,甘油2.0 mL,β-巯基乙醇1.0 mL,0.1 g/mL溴酚兰0.5 mL,超纯水0.5 mL)按11的体积比例混合,各8 µL。100 ℃煮沸5 min,离心,上样8 µL,分离胶质量浓度12 mg/100 mL,浓缩胶质量浓度5 mg/100 mL。开始电流8 mA,进入分离胶后16 mA,电泳时间3.5~4 h。至溴酚蓝前沿到达分离胶底部时停止电泳,拨胶,考马斯亮蓝R-250染色液染色1.5~2 h,脱色,至凝胶背景为无色时为止,拍照,分析蛋白质迁移率。

2 结果与分析

2.1 腰果原料基本成分分析

从表2可以看出,腰果仁中含量最高的是粗脂肪,含量44.13%,其次依次为碳水化合物22.91%,蛋白质19.41%,与文献[3]中报道腰果仁中约含40%~57%的油和21%左右的蛋白质基本一致,蛋白质含量可能由于产地和品种的不同存在一定差异。

表 2 腰果原料基本成分分析

Table 2 Proximate composition of cashew nuts

成分

粗脂肪

蛋白质

碳水化合物

水分

灰分

含量/%

44.13

19.41

22.91

3.07

2.45

 

 

2.2 提取方法的选择

752555.jpg 

图 1 不同提取方法对腰果蛋白提取率的影响

Fig.1 Effect of extraction solvents on protein extraction from cashew nuts

选用不同方法提取腰果蛋白,由图1可以得出,相比于盐溶法和Tris-HCl法,采用碱溶法显著提高蛋白质提取率,达到40.09%(P<0.05),盐溶法最低20.15%,相比较而言,提取率相差多达约20%。所以本实验采用碱提法。研究显示碱可以使腰果的结构变疏松,打破蛋白质分子间的部分氢键[18],增加了蛋白的溶解度,使得提取率增加。

2.3 单因素试验

2.3.1 料液比对腰果蛋白质提取率的影响

752572.jpg 

图 2 料液比对腰果蛋白质提取率的影响

Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on protein extraction from cashew nuts

选取温度45 ℃、时间1 h、pH 9时,以料液比为变量进行3 次平行试验,由图2可知,料液比从
110~140(g/mL)时,蛋白质提取率呈上升趋势。当料液比为140(g/mL)时,提取率显著增高,达到最大为56.32%(P<0.05)。随着提取液用量的持续增大,提取率逐渐降低至33.05%。可能的原因是随着溶液体积的增大,溶剂增加,原料内外蛋白质浓度差加大,蛋白质越容易渗透到提取液中,提取率相应增大[19]。当提取液用量继续增加时,蛋白质溶解达到饱和,加水量过多,酸沉时上清液中残留的的清蛋白量增加,蛋白的损失量也就增高[20],提取率反而下降,此外,食品工业生产过程中,提取液用量过大会影响浓缩干燥的加大,增加了产品成本,故选取料液比为140(g/mL)进行提取分析。

2.3.2 pH值对腰果蛋白质提取率的影响

752588.jpg 

图 3 pH值对腰果蛋白质提取率的影响

Fig.3 Effect of pH on protein extraction from cashew nuts

选取料液比为140(mg/mL)、温度45 ℃、时间1 h,以pH值为变量进行3 次平行试验,由图3可知,提取液pH值由7升到10时,腰果蛋白质的提取率随着pH值的增高而增大,最高达到53.25%(P<0.10),但当pH值继续增大时,提取率有下降的的趋势。这是由于碱可以使腰果的结构变疏松,还会打破蛋白质分子间的部分氢键[18]
从而促使淀粉和蛋白质分离,增加了蛋白提取率,而当pH值继续增大时,在强碱环境下蛋白质容易变性和水解,同时使蛋白产品的颜色变深,蛋白质长时间受强碱作用会引起“胱赖”反应,还会生成有毒化合物[21],因此试验的最适提取pH值在9~10之间。

2.3.3 提取温度对腰果蛋白质提取率的影响

752608.jpg 

图 4 提取温度对腰果蛋白质提取率的影响

Fig.4 Effect of temperature on protein extraction from cashew nuts

选取料液比为140(mg/mL)、pH 9、时间1 h,以温度为变量进行3 次平行试验,由图4可知,不同提取温度对蛋白质的提取率具有显著影响(P<0.05)。当提取温度为25~35 ℃,提取率逐渐上升,由56.00%上升到61.07%,随着温度的持续升高,提取率降低至54.73%。原因可能是35 ℃前,随着温度的升高,亲水基团慢慢展开,巯基含量增加,蛋白质的溶解度升高;随着温度的持续升高,疏水基团被暴露和展开,使得蛋白质分子聚集,溶解度下降[22],导致提取率下降。当温度升高至一定程度时,蛋白质可能发生变性,所以试验提取温度选在35 ℃左右。

2.3.4 提取时间对腰果蛋白质提取率的影响

752626.jpg 

图 5 提取时间对腰果蛋白质提取率的影响

Fig.5 Effect of extraction time on protein extraction from cashew nuts

选取料液比为140(mg/mL)、温度45 ℃、pH 9,以浸提时间为变量进行3 次平行试验,由图5可知,在1.5 h之前,腰果蛋白的提取率随着时间的延长而显著提高,由48.27%上升到63.93%(P<0.05),1.5 h之后,提取率出现下降趋势,下降至55.47%。这是由于去脂腰果粉本身需要一定的溶胀时间,充足的溶胀时间利于蛋白质的分离溶解[23],若提取时间过长,浸提液中已溶蛋白质达到饱和[24],并且随着疏水基团的暴露,有部分蛋白质出现凝聚沉淀,导致提取率的降低。

2.4 腰果蛋白质提取条件优化

在单因素试验基础上做正交试验,优化提取工艺。正交试验结果见表3。

表 3 腰果蛋白提取条件优化的正交试验结果

Table 3 Orthogonal array design with experimental results

试验号

A

B

C

D

蛋白质提取率/%

1

1

1

1

1

58.50

2

1

2

2

2

70.77

3

1

3

3

3

73.27

4

2

1

2

3

69.74

5

2

2

3

1

71.75

6

2

3

1

2

78.51

7

3

1

3

2

59.36

8

3

2

1

3

65.48

9

3

3

2

1

70.63

k1

67.51

62.53

67.50

66.76

 

k2

73.13

69.13

70.38

69.55

 

k3

65.16

74.14

67.93

69.50

 

R

7.98

11.60

2.88

2.79

 

 

表 4 正交试验结果方差分析表

Table 4 Analysis of variance for protein yield with various extraction conditions

因素

偏差平方和

自由度

F

F0.05

F0.01

显著性

A

100.77

2

10.23

19.00

99.00

 

B

203.23

2

20.61

19.00

99.00

*

C

14.52

2

1.47

19.00

99.00

 

D

15.26

2

1.55

19.00

99.00

 

误差

9.85

2

 

 

 

 

 

注:*.差异显著(P<0.05)。

 

选取料液比(A)、提取液pH值(B)、提取温度(C)、提取时间(D)4 个因素,以腰果蛋白的提取率为指标,得出优化条件。从表3极差R值可以得出,对腰果蛋白提取率影响因素由大到小依次是BACD,即pH值对腰果蛋白的提取率影响最大。可以得出,最佳工艺条件为A2B3C2D2,即料液比140(g/mL)、提取液pH 9、提取温度35 ℃、提取时间1.5 h。由表4方差分析结果表明:pH值为影响腰果蛋白质提取过程的显著因素,料液比、提取时间、提取温度为不显著因素。根据最佳工艺条件对腰果蛋白进行提取,测得腰果蛋白的提取率可达79.0%,纯度为86.62%。

2.5 腰果蛋白的亚基分布和分子质量

752647.jpg 

M. Marker;1、2、3、5. 腰果蛋白;4.腰果原料。

图 6 腰果蛋白质电泳图

Fig.6 SDS-PAGE of protein from cashew nuts

采用SDS-PAGE凝胶电泳对提取的腰果蛋白进行分析,其亚基分布见图6。染色后提取的腰果蛋白质条带相比于原料清晰可见,染色程度越深,说明含量越高,纯度越高,反之越低[25]。由图6可知,提取得到的腰果蛋白相比于腰果原料清晰可见,可以得出提取出的腰果蛋白纯度相对较高。从第5列分析,根据迁移率的不同,计算出腰果蛋白中主要含有22、26.2 kD,其次是14.1、16 kD,少量亚基为67.5、88 kD。SDS-PAGE凝胶电泳实验说明了腰果蛋白的多样性,验证了提取的腰果蛋白的纯度较高。

3 结 论

3.1 根据国标法测定了腰果的主要成分如下:粗脂肪含量最高,达44.13%,其他组分含量为:碳水化合物22.91%,蛋白质19.41%,水分3.07%,灰分2.45%。

3.2 选择最优提取方法碱提法,并通过单因素、正交试验得出腰果蛋白提取的最佳工艺条件是:料液比
140(g/mL)、提取液pH 9、提取温度35 ℃、提取时间1.5 h,所得腰果蛋白的提取率可达79.0%,纯度达86.62%。

3.3 SDS-PAGE凝胶电泳得出腰果蛋白中主要含有22、26.2 kD,其次是14.1、16 kD,少量亚基为67.5、88 kD,表现了腰果蛋白的多样性和提取后的纯度较高。

参考文献:

[1] 赵丽, 黄海杰. 我国腰果研究概况[J]. 中国南方果树, 2012, 41(2): 41-46; 77.

[2] 黄敏, 操庆国. 腰果产业具有良好的发展前景[J]. 食品工程, 2009(1): 27-29.

[3] SOARES D J, MENEZED D V, PEDRO H, et al. Prevalent fatty acids in cashew nuts obtained from conventional and organic cultivation in different stages of processing[J]. Food Science and Technology, 2013, 33(2): 265-270.

[4] RIBEIRO V G P, BARRETO A C H, DENARDIN J C, et al. Magnetic nanoparticles coated with anacardic acid derived from cashew nut shell liquid[J]. Journal of Materials Science, 2013, 48(22): 7875-7882.

[5] SOARES D J, MEBEZED D V, PEDRO H, et al. Prevalent fatty acids in cashew nuts obtained from conventional and organic cultivation in different stages of processing[J]. Food Science and Technology, 2013, 33(2): 265-270.

[6] AREMU M O, OGUNLADE I, OLONISAKIN A. Fatty acid and amino acid composition of protein concentrate from cashew nut (Anarcadiu occidentale) grown in Nasarawa State, Nigeria[J]. Pakistan Journal of Nutrition, 2007, 6(5): 419-423.

[7] 孙延芳, 杨开宝, 刘莹, 等. 腰果种仁脂肪酸GC-MS分析[J]. 黑龙江农业科学, 2012(1): 92-93.

[8] GOMEZ-CARAVACA A M, VERARDO V, CABONI M F. Chromatographic techniques for the determination of alkyl-phenols, tocopherols and other minor polar compounds in raw and roasted cold pressed cashew nut oils[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(47): 7411-7417.

[9] PRABHA S P S, RAJAMOHAN T. Effect of inclusion of cashew globulin (Anacardium occidentale) to a casein diet on lipid parameters in rats[J]. Plant Foods for Human Nutrition, 1998, 53(1): 83-92.

[10] OGUNWOLU S O, HENSHAW F O, MOCK H P, et al. Functional properties of protein concentrates and isolates produced from cashew (Anacardium occidentale L.) nut[J]. Food Chemistry, 2009, 115(3): 852-858.

[11] BORA P S, NETO V Q. Functionality of native and denatured cashew nut kernel protein isolates at isoelectric pH as a function of salt concentration[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2004, 84(15): 2022-2027.

[12] YULIANA M, TRUONG C T, HUYNH L H, et al. Isolation and characterization of protein isolated from defatted cashew nut shell: influence of pH and NaCl on solubility and functional properties[J]. LWT-Food Science and Technology, 2014, 55(2): 621-626.

[13] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1): 248-254.

[14] 于阳阳. 东北核桃楸种仁蛋白提取及降血压肽制备的研究[D]. 哈尔滨: 东北林业大学, 2012

[15] 李莹莹, 吴彩娥, 杨剑婷, 等. 白果蛋白质提取及SDS-PAGE分析[J]. 食品科学, 2010, 31(22): 36-40.

[16] 王姝, 王昌涛, 于国萍. 羽扇豆蛋白的提取及性质研究[J]. 食品科技, 2012, 37(5): 230-235.

[17] 郭尧君. 蛋白质电泳实验技术[M]. 北京: 中国科学出版社, 1992: 123-156.

[18] 张相年, 赵树进, 李超. 蛋白分离技术的应用和进展[J]. 中国药业, 2006, 15(2): 72-73.

[19] 蔡金星, 刘秀凤, 常学东, 等. 蚕豆蛋白质提取分离及其物化性质研究[J]. 食品工业科技, 2007, 28(10): 142-144.

[20] 邵佩兰, 徐明. 提取大豆分离蛋白的工艺研究[J]. 粮油加工与食品机械, 2005(9): 47-48; 51.

[21] 王宪泽. 生物化学实验技术原理和方法[M]. 北京: 中国农业出版社, 2002.

[22] 李新华, 闫荣. 辽西大扁杏杏仁蛋白的组成及碱法提取工艺的研究[J]. 食品科技, 2009, 34(5): 132-135.

[23] 李顺灵, 严有兵, 李向珍. 食用菜籽蛋白的提取分离及其应用研究[J]. 食品工业科技, 2007, 28(3): 12-14.

[24] 郭兴峰, 陈计峦, 林燕, 等. 热榨和冷榨核桃饼粕中蛋白质提取及其性质研究[J]. 农业工程学报, 2012, 28(18): 287-292.

[25] 王廷华, 邹晓莉. 蛋白质理论与技术[M]. 北京: 北京科学技术出版社, 2007.

 

收稿日期:2013-10-24

基金项目:公益性行业(农业)科研专项(201303077)

作者简介:钟俊桢(1984—),女,助理研究员,博士,研究方向为食品科学与工程。E-mail:zhongjunzhen@163.com

*通信作者:刘成梅(1963—),男,教授,博士,研究方向为食物资源利用与开发。E-mail:chengmeiliu@yahoo.com.cn