超声波辅助提取高粱全粉色素工艺及其
体外抗氧化性分析

吕曼曼，刘 航，苗修港，许芳溢，李五霞，王 敏*

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

摘 要：目的：确定高粱全粉中色素超声辅助提取最佳工艺条件，并对其抗氧化活性进行评价。方法：在单因素试验基础上，以色素提取率为响应值，应用响应面Box-Behnken试验设计对色素提取工艺条件进行优化；同时探究高粱色素的体外抗氧化能力。结果：超声波辅助提取高粱全粉色素的最佳条件为：乙醇体积分数50.76%、超声功率500.64 W、料液比1∶16.72（g/mL），此条件下色素提取率理论值为54.26%，在提取条件为乙醇体积分数51%、超声功率为504 W、料液比为1∶17（g/mL）时，色素提取率为（53.99±0.26）%；高粱色素对1,1-二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）自由基和羟自由基（•OH）清除作用明显，且具有较好的还原能力。结论：利用响应面Box-Behnken试验分析结果可靠，得到了高粱全粉色素超声波辅助提取的最佳工艺条件，实验结果表明高粱色素具有较强的抗氧化活性。

关键词：高粱色素；超声提取；响应面；抗氧化

Ultrasonic-Assisted Extraction and in vitro Antioxidant Activity of Pigment from Sorghum Flour

LÜ Man-man, LIU Hang, MIAO Xiu-gang, XU Fang-yi, LI Wu-xia, WANG Min*

(College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Abstract: Objective: To explore the optimal ultrasonic-assisted extraction conditions of pigment from sorghum flour and evaluate the antioxidant activity of the extracted pigment. Methods: Based on the single-factor designs, the ultrasonic-assisted extraction conditions of pigment from sorghum flour were optimized by response surface methodology with Box-Behnken design in order to increase the extraction yield of pigment. Meanwhile, the in vitro antioxidant activity of pigment from sorghum flour was also studied. Results: The optimal extraction conditions were 50.76%, 500.64 W and 1:16.72 (g/mL) for ethanol concentration, ultrasonic power and material/liquid ratio, respectively. Under these conditions, the maximum predicted extraction yield of pigment was 54.26%. When the ethanol concentration, ultrasonic power and material/liquid ratio were 51%, 504 W and 1:17 (g/mL), respectively, the experimentally observed extraction yield of pigment was
(53.99 ± 0.26)%. Sorghum pigment showed significant scavenging effects on 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazy (DPPH•) and hydroxyl free radicals (•OH) and excellent reducing power. Conclusion: Response surface methodology with Box-Behnken design is applicable for the optimization of the ultrasonic-assisted extraction of pigment from sorghum flour. The pigment from sorghum flour has strong antioxidant capacity.

Key words: sorghum pigment; ultrasonic-assisted extraction; response surface methodology; antioxidant activity

中图分类号：TS239 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）16-0039-07

doi:10.7506/spkx1002-6630-201416008

高粱（Sorghum vulgare）为一种禾木科高粱属的植物，不仅产量高，而且具有独特的耐旱、耐涝、耐盐碱等抗逆性[1]。近年来以高粱作为传统食品的亚洲和非洲许多国家的高粱食用量逐渐在降低，加之高粱籽粒的开发利用研究远不如玉米等其他粮食作物广泛和深入，因此高粱的种植面积正逐渐缩小。然而，高粱的高产性、高光合效率、强抗逆性和生产成本低决定了其在许多地区难以完全被别的作物取代。同时高粱还含有必需脂肪酸[2]、酚酸、类黄酮等多种酚类化合物[3-5]，对治疗心血管疾病、降低血液胆固醇起到积极作用[6]，高粱还具有抗炎作用[7]。因此，开展对高粱的综合利用研究势在必行。

高粱中淀粉含量为65.3%～81%，平均为79.5%[8]，以高粱籽粒的粗磨粉为原料可以制备出质量较高的淀粉[9]。然而高粱中含有天然红色素，它的存在对高粱淀粉的品质有一定影响[10]，因此为保证制备的高粱淀粉品质必须对其中的色素进行清除。目前有关高粱全粉中的色素提取及其性质的研究还鲜见报道。本实验利用超声波辅助法提取高粱全粉色素，并通过响应面法对提取工艺进行优化，得到提取高粱色素的最优工艺，同时对提取的高粱色素体外抗氧化活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高粱籽粒，晋杂22号，由山西省农业科学院高粱研究所提供。

芦丁标准品（生化试剂，质量分数大于或等于98.0%） 国药集团化学试剂公司；1,1-二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH） 美国Sigma公司；甲醇、无水乙醇、三氯乙酸、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯化铁、30%双氧水均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-700DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机 北京成萌伟业科技有限公司；WFJ72系列721型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；KDC-40低速离心机、HC-2516高速离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司。

1.3 方法

1.3.1 高粱的预处理

将高粱籽粒的外种皮用谷物脱壳机去掉，用40 ℃温度烘箱烘干，在实验室粉碎磨粉，全粉过80 目筛，测得水分含量为11.35%，置于4 ℃冰箱中备用。

1.3.2 高粱色素的提取及提取率测定方法

高梁色素提取工艺：干燥高粱全粉→加适量一定体积分数的乙醇溶液→超声波提取→3 500 r/min离心→上清液浓缩→干燥→高梁色素粗品。

采用间接法（NaNO2-Al(NO3)3-NaOH）测定高粱色素的提取量[11]。参考Bao Jinsong等[12]方法略有改动，加入样品液300 µL，然后加入质量分数5% NaNO2溶液200 µL漩涡混匀，室温放置6 min，再加入质量分数10%的Al(NO3)3溶液200 µL漩涡混匀，室温放置6 min继续加入质量分数4%NaOH溶液2 mL，用蒸馏水将各试管补至5 mL后混匀在暗处放置15 min显色，510 nm波长处测定吸光度。以芦丁标准溶液质量浓度（mg/mL）为横坐标、510nm波长处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为：y=10.18x＋0.0065，R2=0.999 6。

根据已有研究[13-14]优化出高梁色素的工艺条件多次提取，合并提取液，浓缩，按高粱色素含量的测定方法得出高粱全粉中色素的总量为0.91%。根据色素含量和提取量按式（1）计算高粱率色素提取率。

（1）

式中：m0为高粱粉中色素的提取量/g；m1为高粱粉中色素的含量/g。

1.3.3 单因素试验

准确称取高粱粉3.0 g，放入150 mL烧杯中，在其他条件一定的情况下，采用不同乙醇体积分数、料液比、超声功率、提取时间、提取温度、提取次数进行单因素试验[15-17]，以高粱色素提取率为响应值，逐个考察各个提取条件对提取率的影响。

1.3.4 高粱色素提取响应面优化试验设计

根据单因素试验结果，以影响色素提取率的最主要因素为变量，以提取率为响应值，以对超声提取色素影响效果显著的3 个因素：乙醇体积分数（A）、超声功率（B）和料液比（C）为自变量，采用响应面Box-Behnken试验设计方法，对超声波辅助提取高粱色素工艺试验结果进行参数优化，设计三因素三水平试验，因素及水平如表1所示。

表 1 响应面试验因素与水平

Table 1 Factors and levels used for response surface analysis

1.3.5 高粱色素体外抗氧化性测定

用响应面方法分析得出的最佳条件提取高粱全粉中色素，得到的提取液浓缩干燥后用体积分数70%的乙醇溶液配制不同质量浓度的高粱色素溶液。

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力测定[18-19]

取不同质量浓度的高粱色素溶液1.0 mL于试管中，分别加入提前配制的DPPH溶液（0.002 6 g DPPH，甲醇定容至50 mL，避光放置）1.0 mL，以2.0 mL甲醇作空白、1.0 mL DPPH与1.0 mL甲醇混合液作对照，振摇混匀后置于暗室中静置30 min，于517 nm波长处测定吸光度，按式（2）计算DPPH自由基清除率。

（2）

式中：Ax为样品溶液的吸光度；A0为对照溶液的吸光度。

1.3.5.2 •OH清除率测定[20-21]

在试管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1.0 mL、不同质量浓度的高粱色素溶液1.0 mL。再加入8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL启动反应，振摇混匀后将试管迅速移入37 ℃水浴锅中，静置30 min后于510 nm波长处测定不同质量浓度样品液的吸光度Ax。用蒸馏水代替H2O2时在510 nm波长处测得对应质量浓度的本底吸光度。用蒸馏水代替样品在510 nm波长处测得对照吸光度，按式（3）计算样品对•OH的清除率。

（3）

式中：Ax为样品溶液的吸光度；Ax0为用蒸馏水代替H2O2时测得对应浓度的本底吸光度；A0为蒸馏水代替样品测得对照吸光度A0。

1.3.5.3 还原力测定[22-23]

取不同质量浓度的高粱色素溶液1.0 mL于试管中，再依次加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液和质量分数1%铁氰化钾溶液各2.0 mL，混合均匀后，立即放入50 ℃水浴反应20 min，取出冷却至室温，加入2.0 mL质量分数10%三氯乙酸终止反应。离心后吸取反应液2.0 mL，再加入2.0 mL蒸馏水和0.4 mL 质量分数0.1% FeCl3溶液，振摇混匀，暗室反应30 min后于700 nm波长处测定吸光度。

1.4 数据分析

采用Excel 2003对单因素试验中的各因素进行比较分析。采用Design-Expert 7.0.0数据处理专家进行响应面试验设计和分析。同时所有实验均重复3 次。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对色素提取率的影响

图 1 乙醇体积分数对色素提取率的影响

Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of pigment

控制提取条件为料液比1∶15（g/mL）、提取温度40 ℃、超声功率420 W、提取时间30 min，研究乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%时色素提取率变化。由图1可以看出，在试验设定范围内，随着乙醇体积分数的增大提取率先增大后减小，当乙醇体积分数达到50%时，随着体积分数的增加提取率急速下降。这可能是乙醇体积分数过高增加了高粱粉中有其他醇溶性物质的溶出，影响了色素的溶解[14]。而乙醇体积分数过低影响色素的溶解，色素提取率低，所以当其他条件确定时，最佳的乙醇体积分数选择50%。

2.1.2 料液比对色素提取率的影响

图 2 料液比对色素提取率的影响

Fig.2 Effect of material/liquid ratio on the extraction yield of pigment

控制提取条件为乙醇体积分数50%、提取温度40 ℃、超声功率420 W、提取时间30 min，研究料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）时色素提取率变化。由图2可知，随着提取剂用量比例的增大色素提取率增加，达到1∶15（g/mL）后随着提取剂用量的增加，提取率增加缓慢。提取剂量太小提取不完全，色素提取率过低，试验用的是高粱全粉，提取剂量太大时又浪费溶剂。因此当其他条件确定时，选用料液比1∶15（g/mL）为最佳。

2.1.3 提取时间对色素提取率的影响

图 3 提取时间对总色素提取率的影响

Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of pigment

控制提取条件为乙醇体积分数50%、料液比1∶15（g/mL）、提取温度40 ℃、超声功率420 W，研究提取时间为25、35、45、55、65 min时色素的提取率变化。由图3可知,在提取时间为35 min之前，随着时间的延长，色素提取率也随之增加；时间超过35 min后提取率反而降低。高于35 min，随着时间的延长，提取率反而下降，这可能是长时间超声破坏了色素的结构，降低了其在乙醇溶液中的溶解性导致提取率下降。因此，当其他条件确定时，超声时间选择在35 min左右。

2.1.4 超声功率对提取率的影响

图 4 超声功率对总色素提取率的影响

Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of pigment

控制提取条件为乙醇体积分数50%、料液比
1∶15（g/mL）、提取温度40 ℃、提取时间30 min，研究超声功率为350、420、490、560、630 W时色素的提取率变化。由图4可以看出，超声功率350～490W范围内，色素提取率逐渐增加，而超声功率490～630W范围内恰好相反，提取率下降剧烈。超声功率太低，空化效应不强烈，分子扩散速度较慢，色素提取量少，提取率低。但是过高的超声功率，可能对色素分子造成破坏，同时对高粱淀粉的组织结构产生了破坏作用，部分色素分子会被破坏作用产生的细小微粒吸附，导致色素提取率下降。因此当其他条件确定时，超声功率选择在490 W左右为宜。

2.1.5 提取温度对色素提取率的影响

图 5 提取温度对色素提取率的影响

Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction yield of pigment

控制提取条件为乙醇体积分数50%、料液比1∶15（g/mL）、超声功率420 W、提取时间30 min，研究超声提取温度为35、40、45、50、55、60 ℃时色素的提取率变化。从图5
可以看出，随着温度的升高，色素提取率缓慢增加，当温度达到55 ℃时，色素提取率又开始呈现下降趋势。这说明温度越高色素提取量越大，色素提取率也就越高。但当温度达到一定程度时，可能由于高温导致色素不稳定或色素分解、被破坏，色素提取率降低。因此，当其他条件确定时，超声温度选择在55 ℃为宜。

2.1.6 提取次数对色素提取率的影响

图 6 提取次数对色素提取率的影响

Fig.6 Effect of number of repeated extractions on the
extraction yield of pigment

在单因素试验已得到的最佳因素条件下，每次提取后的残渣继续提取，连续提取3 次。由图6可以看出，提取1 次色素提取率就达到50%以上，在第2次时候提取率不足10%，第3次更小，不足1%。这说明本试验中色素提取1 次效果已经很好，对于本试验选择提取1 次即可。

2.2 响应面分析法对高粱色素提取工艺的优化

表 2 响应面分析设计及结果

Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

利用Design Expert 7.0.0软件对表2的数据进行分析，得到回归方程：

Y=－1 299.411 84＋21.256 91A＋21.296 49B＋6.296 51C＋0.010 395AB＋0.078 707AC＋0.037 126BC－20.229 68A2－0.156 92B2－0.387 10C2

对上述回归模型进行了方差分析，结果见表3，该表表明该回归模型显著（P=0.013 8）。回归模型的R2=0.971 2，失拟项P=0.073 7＞0.05，不显著，说明该回归模型充分拟合试验数据，可以用该模型分析和预测超声波辅助提取高粱色素的工艺结果。回归模型中的一次项因素C显著，二次项均为极显著。3 个因素中对提取结果影响最大的为料液比，其次为超声功率，影响程度最小的为乙醇体积分数。

表 3 回归方程方差分析表

Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation

注：**. 差异极显著（P＜0.01）；*. 差异显著（P＜0.05）。

响应面图形是对各试验因子A、B、C所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上可看出最佳参数及各参数之间的相互作用。根据回归方程得出不同因子的响应面分析图及相应等高线图结果见图7。曲线越陡峭，则表明该因素对总色素提取率的影响越大，相应表现为响应值变化的大小[16] ，由图7可较直观地看出各因素交互作用对高粱色素提取率的影响，料液比和乙醇体积分数的交互作用对试验影响最大，超声功率和乙醇体积分数这两个因素交互作用程度较小。从图7可以看出各因素中对提取结果影响最大的为料液比，其次为超声功率，影响程度最小的为乙醇体积分数，表3回归分析结果也与此相吻合。

a.乙醇体积分数和超声功率

b.乙醇体积分数和料液比

c.超声功率和料液比

图 7 两因素交互作用对色素提取率的响应面图和等高线图

Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of operating parameters on the extraction yield of pigment

由响应面试验结果，得到色素的最佳超声波辅助提取条件：乙醇体积分数50.76%、超声功率500.64 W、料液比1∶16.72（g/mL）。在此优化的最佳条件下，色素提取率理论值为54.26%，结合实际在乙醇体积分数51%、超声功率504 W、料液比1∶17（g/mL）条件下，经过3 次平行验证实验，实际得到的色素提取率的平均值为（53.99±0.26）%，与预测的理论值很接近，这说明该回归模型具有可靠性。利用超声波辅助方法提取高粱全粉色素具有一定的可行性与应用价值。

2.3 高粱色素体外抗氧化测定结果

2.3.1 高粱色素对DPPH自由基清除作用

图 8 不同质量浓度色素对DPPH自由基的清除作用

Fig.8 Scavenging activity of sorghum pigment at various concentrations against DPPH• free radicals

DPPH自由基是一种稳定的自由基，其醇溶液在517 nm波长处有一吸收峰。在反应系统中加入的自由基清除剂可以和DPPH自由基的单电子配对而使在517 nm波长处吸光度降低。可根据在517 nm波长处吸光度的变化来检测DPPH自由基的清除情况，从而评价样品的抗氧化能力[24]。由图8可以看出，高粱色素提取液具有较好的DPPH自由基清除能力，但低于VC。在质量浓度0～30 μg/mL范围内高粱色素提取液对DPPH自由基清除率迅速增加，之后随着色素质量浓度的增加，DPPH自由基的清除率增加缓慢。质量浓度达到40 μg/mL，清除率达到了93.23%；质量浓度增加到60 μg/mL时，DPPH自由基清除率只提高了1.1%。当质量浓度大于40 μg/mL时，VC和色素提取液对DPPH自由基的清除能力相当。

2.3.2 高粱色素对•OH的清除作用

图 9 不同质量浓度色素对•OH的清除作用

Fig.9 Scavenging activity of sorghum pigment at various concentrations against hydroxyl free radicals

由图9可以看出，在试验的质量浓度范围，随着高粱色素质量浓度增加，对•OH清除率不断增加。在质量浓度低于1.0 mg/mL时，高粱色素提取液质量浓度与对•OH的清除能力具有良好的线性关系；质量浓度高于1.0 mg/mL
后，清除率的增加缓慢，当质量浓度达到2.0 mg/mL时，色素提取液对•OH清除率可达91.99%。VC和色素提取液的IC50值分别为0.263 mg /mL与0.635 5 mg/mL，
说明色素溶液对•OH具有很好的清除作用。

2.3.3 高粱色素的还原能力

图 10 不同质量浓度色素的还原能力

Fig.10 Reducing power of sorghum pigment at various concentrations

物质的还原性作用可以还原力来体现，还原性物质在反应体系中反应，反应体系在700 nm波长处的吸光度越大，表明抗氧化剂还原力越强[25]。由图10可以看出，在实验范围内，VC和高粱色素提取液的还原能力随着其质量浓度的增加而增加，而且还原力的增加呈直线上升趋势。在质量浓度为20 μg/mL时，VC和高粱色素提取液的还原力分别为0.267和0.097；当质量浓度达到30 μg/mL时，色素提取液的还原力为0.231，说明高粱色素具有很强的还原性。

3 结论与讨论

超声波辅助提取高粱全粉中的色素操作简便、能耗低、提取效率高，以响应面方法分析得出提取色素的最佳条件，结果可用。最佳条件为乙醇体积分数50.76%、超声功率500.64 W、料液比为1∶16.72
（g/mL），此条件下，色素提取率理论值54.26%。在乙醇体积分数51%、超声功率504 W、料液比1∶17（g/mL）
条件下，经过3 次平行验证实验，实际得到的色素提取率为（53.99±0.26）%。

本实验通过色素溶液对•OH和DPPH自由基的清除以及对总还原力的测定，与VC作对照[25]，说明高粱粉中的色素具有有较好的抗氧化能力，且在一定的质量浓度范围内呈现一定线性关系，但是其抗氧化性低于VC。

高粱粉中色素提取工艺和其抗氧化能力的研究为高粱粉中色素的进一步开发研究提供了理论依据。实验中所用是色素的粗提物，可能含有蛋白质、纤维素等杂质，高粱粉中色素的组成、结构以及纯化等还需进一步的研究。

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