离子沉淀法分离八月瓜果皮中的总多酚

欧阳玉祝，李雪峰，姚懿桓

（吉首大学食品科学研究所，湖南 吉首 416000）

摘 要：以八月瓜果皮干粉为原料分离总多酚，在单因素试验基础上，采用响应面法优化钙沉淀分离总多酚的工艺条件，考察沉淀剂用量、沉淀温度和时间对总多酚提取率的影响。结果表明，钙沉淀分离总多酚的最佳工艺条件为：在50 mL提取液中，添加90 mL饱和石灰水，70 ℃沉淀38 min。总多酚提取率为5.103 7%。试验模型的预测值与组合实验结果吻合，分离产品总多酚纯度为84.417 4%。

关键词：八月瓜；总多酚；响应面法；钙沉淀

Separation of Total Polyphenols from Akebia trifoliate Peel by Calcium Precipitation Method

OUYANG Yu-zhu, LI Xue-feng, YAO Yi-huan

(Institute of Food Science, Jishou University, Jishou 416000, China)

Abstract: A calcium precipitation method to separate total polyphenols from a 70% ethanol extract of dried powdered Akebia trifoliate peel was proposed and optimized by response surface methodology. The yield of total polyphenols was investigated as a function of precipitator dosage, precipitation temperature and time. The results showed that the optimum precipitation conditions that provided maximum total polyphenol yield of 5.103 7% were obtained when 50 mL of the extract was precipitated by adding 90 mL of clear saturated limewater at 70 ℃ for 38 min. There was a good agreement between the predicted and experimental data for total polyphenol yield. The separated precipitate contained 84.417 4% total polyphenols.

Key words: Akebia trifoliate; total polyphenols; response surface methodology; calcium precipitation

中图分类号：TQ351.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）16-0076-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201416014

八月瓜是一种原生态无污染绿色水果，又称三叶木通果、羊开口、牛腰子果、八月扎等，是天然药食两用野生经济木质藤本半常绿缠绕植物果实[1-2]。八月瓜是养颜美容、健身壮体、延年益寿不可多得的保健水果，具有很高的开发利用价值[3-5]。植物多酚是一种多环多酚羟基化合物，具有良好的抑菌抗炎、抗氧化和自由基清除能力，广泛用于食品、日化、酿酒和医药等领域[6-13]。多酚的提取分离主要有超声提取法、超临界萃取法、微波提取法和树脂分离法等[14-17]。响应面优化法是一种新的工艺优化方法，广泛用于天然产物活性成分分离和矿产资源加工等领域[18-20]。目前，八月瓜的研究主要有化学成分分析、总黄酮含量测定与分离以及齐墩果酸的含量测定等[21-24]，多酚的分离研究较少。本研究以八月瓜果皮为原料，用响应面试验设计法优化钙沉淀分离总多酚工艺，期望研究结果能为八月瓜的开发利用和单宁酸的制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

八月瓜由湘西自治州农业科学研究院提供，鲜果采回后，取果皮切成片，晒干后用粉碎机粉碎到20～30 目备用。

单宁酸标准品 国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、氢氧化钙、无水碳酸钠、浓硫酸、钨酸钠、磷钼酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2450型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；KQ-250E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器、SHB-III循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；JA2003N型电子天平 上海精密仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 总多酚提取液的制备

称取100 g八月瓜果皮干粉于2 000 mL圆底烧瓶中加入1 000 mL体积分数70%乙醇溶液，60 ℃条件下超声提取3 h，抽滤，提取液定容于2 000 mL容量瓶中，得总多酚提取液，保存于冰箱中备用。

1.3.2 总多酚的分离

取50 mL提取液加一定量饱和澄清石灰水沉淀剂，搅拌沉淀，抽滤，滤渣用少量去离子水洗脱，加足量2%稀硫酸分解，抽滤，滤液定容到50 mL容量瓶中，用紫外-可见分光光度计测总多酚含量。

1.3.3 分析方法

1.3.3.1 标准曲线的绘制

用单宁酸为对照品，准确称取0.200 0 g单宁酸标准品，配成1.000 0 mg/mL标准母液，根据文献[25]配制梯度标准溶液，并按文献[26]用Folin-Denis法测760 nm波长处的吸光度，以吸光度为横坐标、质量浓度为纵坐标绘制标准曲线，经线性回归得回归方程和相关系数为：ρ=0.516 3A（R2=0.996 1，式中：ρ为标准溶液质量
浓度/（mg/mL）；A为吸光度）。

1.3.3.2 样品中总多酚含量测定

取1 mL实验样品按1.3.3.1节方法用紫外-可见分光光度计测760 nm波长处吸光度，将吸光度代入回归方程计算总多酚质量，按下式计算总多酚提取率。

1.3.4 响应面试验

根据Box-Behnken试验设计原理[18-19]，在单因素试验结果基础上，以沉淀温度（X1）、沉淀时间（X2）和饱和石灰水用量（X3）为试验因素，以总多酚提取率为响应值，设计三因素三水平响应面优化试验，试验因素水平见表1。

表 1 Box-Behnken试验设计

Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 沉淀剂用量对总多酚提取率的影响

取50 mL提取液，按1.3.2节方法加不同体积的饱和澄清石灰水溶液，50 ℃条件下沉淀40 min，由图1可知，随石灰水用量的增加，总多酚提取率不断增加，当石灰水用量为80 mL时达最大值4.743%，随后缓慢减小。这是因为石灰水用量少，沉淀不完全，用量大于80 mL后因沉淀剂过量，碱性太强，总多酚容易氧化。

图 1 石灰水用量对总多酚提取率的影响

Fig.1 Effect of limewater dosage on the yield of total polyphenols

2.1.2 沉淀温度对总多酚提取率的影响

图 2 沉淀温度对总多酚提取率的影响

Fig.2 Effect of precipitation temperature on the yield of
total polyphenols

取50 mL提取液，以80 mL饱和澄清石灰水为沉淀剂，按1.3.2节方法，在30、40、50、60、70、80、90 ℃温度条件下沉淀40 min，图2结果表明，随沉淀温度的升高，总多酚提取率随之增大，温度达到70 ℃时总多酚提取率达最大值4.985 9%，继续升高温度，总多酚的提取率稍有下降，因为碱性条件下，温度越高，总多酚越易氧化。

2.1.3 沉淀时间对总多酚提取率的影响

图 3 沉淀时间对总多酚提取率的影响

Fig.3 Effect of precipitation time on the yield of total polyphenols

取50 mL提取液，按1.3.2节方法加入80 mL饱和澄清石灰水，在50 ℃条件下沉淀不同时间，由图3可知，随着沉淀时间的延长，总多酚提取率增加，沉淀40 min时达到最大值4.712%，随后稍有减小。因为时间太短，总多酚沉淀不完全，沉淀时间太长，碱性条件下产品容易氧化，产品的颜色加深。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 Box-Behnken试验设计及结果

按照Box-Behnken试验共设计17 个试验点，其中12 个为分析因子，5 个为中心试验点。按1.3.2节方法分离总多酚，并按1.3.3节方法测定总多酚含量，试验结果见表2。

表 2 Box-Behnken试验设计及结果

Table 2 Results of Box-Behnken experimental design

2.2.2 模型的建立及显著性检验

用Design Expert 8.00软件对表2数据进行二次线性回归拟合和显著性分析，回归拟合数学模型为：Y=4.99＋0.018X1－0.022X2＋0.18X3＋0.048X1X2－9.0×10－3X1X3－7.15×10－3X2X3－0.22X12－0.071X22－0.032X32，回归统计分析结果见表3。

表 3 回归统计分析结果

Table 3 Results of statistical regression analysis

注：*. 差异显著（P＜0.05）；**. 差异极显著（P＜0.01）。

由表3可以看出，数学模型极显著，模型的相关系数R=0.962 2，表明因变量与所考察自变量之间的线性关系良好；模型调整相关系数R2Adj=0.913 7，说明该模型能解释91.37%响应值变化，拟合程度较好，试验能很好地对响应值进行预测[18]。X3和X12表现为极显著，X22表现为显著，试验模型预测3 个影响因素的顺序依次为：石灰水用量＞沉淀时间＞沉淀温度。

2.2.3 响应面分析

将八月瓜果皮总多酚的钙离子沉淀分离工艺试验结果用Design Expert 8.00软件进行响应面分析，得到响应面图见图4。

图 4 沉淀分离的响应面图

Fig.4 Response surface plots for the precipitation efficiency of total polyphenols

响应面图坡度陡峭程度和等高线形状可以反映各因素间交互作用强弱和影响程度大小。曲面坡度陡峭、等高线密集呈椭圆形表示两因素交互影响加大，而坡度平缓、等高线呈圆形则与之相反[27]。图4a沉淀时间与沉淀温度交互的响应面坡度陡峭，等高线排列紧密且趋向于椭圆，因此，沉淀温度与时间的交互影响相对较大；图4b、4c响应面坡度都很平缓，等高线趋入圆形，说明石灰水用量与沉淀时间、温度的交互影响相对较小。试验模型预测总多酚分离的最佳工艺条件为：饱和澄清石灰水用量90 mL/50 mL提取液、沉淀温度69.98 ℃、沉淀时间37.91 min，模型对总多酚提取率的预测值为5.114 6%。

2.2.4 模型验证实验

为了检验该模型预测值的准确性，同时考虑到分离条件的可操作性，将2.2.3节得到的最佳分离工艺条件微调为饱和石灰水用量90 mL/50 mL提取液、沉淀温度70 ℃、沉淀时间为38 min，在此条件下进行验证组合实验，重复5 次的提取率分别为5.095 4%、5.110 2%、5.100 8%、5.106 6%、5.1053%，取平均值5.103 7%，与模型的预测值5.114 6%相比，相差0.010 9%，由此说明，响应面法所得的优化条件可靠，进一步验证了回归模型的合理性。

2.2.5 分离产物的总多酚纯度分析

由于沉淀分离得到的产物是粗品，其中含有机酸等非多酚类物质，为了测定产品中总多酚含量，准确称取分离的干燥总多酚固体粉末0.026 5 g溶于水，定容于25 mL容量瓶中。取溶液1 mL按1.3.3节方法测定总多酚含量，平行测定3 次，其纯度取平均值为84.417 4%。

3 结 论

以八月瓜为原料，以总多酚提取率为响应值，在单因素试验基础上，采用响应面法优化了钙离子沉淀分离总多酚的工艺条件。结果表明，50 mL提取液中，用90 mL饱和石灰水作沉淀剂，70 ℃条件下沉淀38 min，总多酚提取率为5.103 7%，实验结果比模型预测值小0.010 9%。分离产品中总多酚纯度为84.417 4%。该法具有分离效率高、分离时间短、操作简单易行、不影响目标产物活性等特点。

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