紫外光谱结合欧氏距离和主成分分析法
快速鉴别牛肝菌

杨天伟1,李 涛2,张 霁3,李杰庆1,刘鸿高1,王元忠3,*

(1.云南农业大学农学与生物技术学院,云南 昆明 650201;2.玉溪师范学院资源环境学院,云南 玉溪 653100;

3.云南省农业科学院药用植物研究所,云南 昆明 650223)

 

摘 要:采用紫外光谱技术建立快速鉴别不同产地、种类食用牛肝菌的方法。通过确定最佳提取试剂(0.5 mol/L NaOH溶液),最适称样量(0.100 0 g)和最佳提取时间(40 min),制备牛肝菌样品测试液;采用夹角余弦、欧氏距离和主成分分析法对牛肝菌样品的指纹图谱进行相似度比较。结果表明,牛肝菌样品NaOH提取液在10 h内稳定性相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)在0.06%~2.33%之间,重复性RSD在0.09%~1.81%之间,精密度RSD在0.11%~1.92%之间。样品间的夹角余弦值最大为0.999、最小为0.823,夹角余弦值相差较小,不适于鉴别牛肝菌。欧氏距离最大值为873.17,最小值为31.36,样品间距离差异明显;主成分分析的前3 个主成分累积贡献率达到93.626%,能够反映样品的主要信息,说明欧氏距离和主成分分析法可用于不同产地、种类牛肝菌的快速鉴别和质量控制。

关键词:紫外光谱;牛肝菌;夹角余弦;欧氏距离;主成分分析;鉴别

 

Rapid Identification of Bolete Mushrooms by UV Spectroscopy Combined with Euclidean Distance and
Principal Component Analysis

 

YANG Tian-wei1, LI Tao2, ZHANG Ji3, LI Jie-qing1, LIU Hong-gao1, WANG Yuan-zhong3,*

(1. College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;

2. College of Resources and Environment, Yuxi Normal University, Yuxi 653100, China;

3. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China)

 

Abstract: In this study, an ultraviolet (UV) spectroscopic method was established for rapid identification of different species of bolete mushrooms from different areas. For preparation of boletes extracts, the optimal extraction extraction solvent, sample amount and extraction time were determined as 0.5 mol/L NaOH, 0.100 0 g and 40 min, respectively. The similarity of UV spectral fingerprint of bolete samples was analyzed by included angle cosine (IAC), Euclidean distance (ED) and principal component analysis (PCA). The results showed that, within 10 h, the RSDs of stability, repeatability and accuracy for bolete extracts were 0.06%–2.33%, 0.09%–1.81% and 0.11%–1.92%, respectively. The difference of IAC values among samples was small, ranging from 0.823 to 0.999. But the difference of ED values among samples was large, ranging from 31.36 to 873.17. PCA showed that the cumulative contribution rate of the first three factors was 93.626%, which could reflect most information about the samples. These findings suggested that the ED and PCA methods can be used for rapid identification and quality control of different specices of boletes from different areas.

Key words: ultraviolet spectroscopy; bolete; included angle cosine; Euclidean distance; principal component analysis; identification

中图分类号:TS201.2 文献标志码:A 文献编号:1002-6630(2014)16-0105-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201416020

牛肝菌为肉质中大型真菌,是菌物界中大型担子菌的重要类群[1],也是目前最具经济价值、应用前景较广阔的真菌之一[2]。我国牛肝菌种质资源非常丰富,种类多达390 种以上,其中199 种可食用;云南是我国牛肝菌种类较为丰富的地区之一,已知牛肝菌种类有224 种,其中可食用的有144 种[1],分别约占我国牛肝菌种类的57.4%和72.3%。牛肝菌子实体味道鲜美,富含蛋白质、氨基酸、维生素、多糖类物质和钙、磷、铁等多种矿质元素[3-7],其中多糖和碱性蛋白提取物具有增强人体免疫力,抗肿瘤、抗病毒等功能[8-9]。

长期以来,人们对如此众多复杂的牛肝菌种类凭借经验,根据牛肝菌的外表特征、生长特性、孢子型貌等理化指标和色、香、味等感官指标来进行分类及品质评价[10]。然而很多牛肝菌外表型貌极其相似,如茶褐牛肝菌(Boletus brunneissimus)和深褐牛肝菌(Boletus obscureumbrinus)[11],依靠感官不易作出正确的分类和评价。尤其是经过烘干的牛肝菌很难通过以上方法作出种类的判断,难以鉴别;部分不良商贩为获取利润将不同品质、种类的牛肝菌混合出售,甚至收购有毒牛肝菌,如类铅紫粉牛肝菌(Tylopilus plumbeoviolaceoides)干燥后混入其他可食牛肝菌中出售[11]。因此,寻求能够快速、准确鉴别牛肝菌种类及作出品质评价的方法显得重要。目前,对食用菌种类鉴别的研究主要集中在红外光谱法,如周在进等[10,12]利用傅里叶变换红外光谱结合分层抽样、聚类分析等方法对牛肝菌科、鸡油菌科和红菇科的几种不同属蘑菇进行鉴别研究;刘刚等[13]根据食用菌傅里叶变换红外光谱的峰形、峰高等特征对部分食用菌进行了鉴别研究,但这种鉴别需要具有丰富的经验,难以形成完整的鉴别体系。

紫外指纹图谱技术是一种灵敏可靠、简便快速的检测技术,其原理是不同物质体系成分的含量及不饱和程度不同,导致其紫外吸收光谱曲线的峰形、峰高、峰面积有一定的差异[14]。将不同物质体系紫外吸收图谱的指纹特性进行比较,即可对物质体系进行分析与鉴别[15]。紫外指纹图谱技术已被广泛用于中药鉴别[16]、真假酒鉴别[17]、食品质量控制[18-19]等多个领域,而在食用牛肝菌种类鉴别方面的应用尚未见报道。本实验采用紫外光谱法测定了14 种采自云南不同产地、不同种类食用牛肝菌的紫外图谱,对所得图谱进行3 组平均、八点平滑和一次微分处理校准和消除干扰,用夹角余弦、欧氏距离和主成分分析(principal component analysis,PCA)法,对牛肝菌样品紫外指纹图谱进行相似度评价和鉴别分析。为快速、准确鉴别不同产地、不同种类食用牛肝菌和牛肝菌品质评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

14 种牛肝菌样品采于2012年7月,来源见表1,经云南农业大学农学与生物技术学院刘鸿高教授鉴定。

表 1 样品名称与来源

Table 1 Specices and sources of bolete samples

编号

样品名称

采集地点

 

编号

样品名称

采集地点

1

皱盖疣柄牛肝菌

曲靖泽州桂花树

 

8

灰褐牛肝菌

易门普贝

2

灰褐牛肝菌

曲靖泽州桂花树

 

9

黄白粘盖牛肝菌

易门六街

3

栗色牛肝菌

曲靖泽州桂花树

 

10

华丽牛肝菌

鹤庆县松桂镇

4

砖红绒盖牛肝菌

晋宁宝峰

 

11

褐盖牛肝菌

鹤庆县松桂镇

5

华丽牛肝菌

晋宁六街镇

 

12

绿盖粉孢牛肝菌

姚安前场

6

紫红牛肝菌

晋宁新寨

 

13

灰褐牛肝菌

鹤庆县马场

7

红网牛肝菌

普达措

 

14

栗色牛肝菌

易门六街

 

 

1.2 试剂与仪器

氢氧化钠、氯仿(均为分析纯) 西陇化工股份有限公司;无水乙醇(分析纯) 云南汕滇药业有限公司。

UV-2550双通道紫外-可见分光光度计(配有UV probe工作站) 日本岛津公司;KQ5200型超声波清洗机 昆明市超声仪器有限公司;AR1140型万分之一分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;FW-100型高速粉碎机 天津市华鑫仪器厂;100目标准筛盘 浙江上虞市道墟五四仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 紫外光谱测试液制备及测定条件

样品采集后,清洗干净,50 ℃烘干,粉碎、过100 目筛,保存于自封袋中备用。准确称取0.100 0 g牛肝菌样品于25 mL比色管中,加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液,超声提取40 min,经三层滤纸过滤得NaOH提取液。以0.5 mol/L NaOH溶液为参比液进行紫外指纹图谱测定,设定扫描波长为190~600 nm,重复3 次,狭缝1.0 nm,采样间隔0.2 nm。

1.3.2 紫外光谱处理

对NaOH提取液所测得的原始光谱进行3 组总平均,8 点平滑和1 次微分处理,以消除噪音干扰和基线漂移,提高光谱分辨率,使图谱清晰[16]。

1.3.3 紫外指纹图谱相似度评价

紫外指纹图谱的相似度是指图谱的整体相关性,参考色谱指纹图谱相似度评价方法,把紫外指纹图谱的重叠率和共有峰的峰强度相结合[20],应用Excel 2007软件和SPSS 17.0软件处理实验数据,分别用以下3 种方法分析图谱整体相关性。

夹角余弦法:将第i个样品的n个测定值(x1i, x2i, …, xni)和第j个样品的n个测定值(x1j, x2j, …, xnj)作为n维向量空间的两个向量,这两个向量夹角的余弦值为两个样品的相似系数;当余弦值接近1时两样品相似度高,当余弦值接近0时两个样品差别较大[21]。以每个样品图谱吸收波长计算夹角余弦值,其计算公式为(1)[21]。

766702.jpg (1)

欧氏距离法:欧氏距离能反映样品间的亲疏程度,距离越小相似度越大,距离越大的相似度越小,样品差异越大。以每个样品图谱吸收波长计算欧氏距离计算公式为(2)[21]。

752468.jpg (2)

式(1)、(2)中:Cij为夹角余弦;dij为欧式距离;Xik为第i个供试品的n个测定值(x1i, x2i, …, xni);Xkj为第j个供试品的n个测定值(x1j, x2j, …, xnj)。

主成分分析法:主成分分析法是将多个指标综合为少数几个指标,用几个综合因子(主成分)来替代多个原始变量,使这些综合因子尽可能地反映原始变量的信息,简化分析过程[21]。

2 结果与分析

2.1 牛肝菌特征成分提取条件的确定

2.1.1 最优提取溶剂的选择

以样品3为考察对象,准确称取0.100 0 g样品分别加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液、无水乙醇、氯仿、蒸馏水,每组平行3 次;超声提取30 min后用3 层滤纸过滤,经190~600 nm紫外光谱测定,以图谱吸收峰数考察不同溶剂对牛肝菌提取率的响应。不同溶剂提取的紫外指纹图谱见图1,从图1可知,用氯仿提取的紫外吸收峰数目最少,用NaOH提取牛肝菌紫外吸收峰数明显多于其他溶剂提取的吸收峰数。

752500.jpg 

图 1 不同溶剂提取牛肝菌的紫外指纹图谱

Fig.1 UV fingerprint spectra of boletes sample No.3 extracted with different solvents

752520.jpg 

图 2 不同NaOH浓度提取牛肝菌的紫外指纹图谱

Fig.2 UV fingerprint spectra of boletes sample No.3 extracted with different concentrations of NaOH

准确称取0.100 0 g样品分别加入10 mL 0.1、0.5、1.0、1.5 mol/L NaOH溶液,超声提取30 min后用3 层滤纸过滤,进行紫外光谱测定,考察不同NaOH浓度对牛肝菌样品提取率的影响。由图2可看出,不同NaOH浓度对牛肝菌样品的提取效果有一定影响,0.1 mol/L NaOH提取液测得的紫外光谱吸收峰数较少,吸光度小;0.5 mol/L NaOH提取液测得的紫外吸收峰数较多,且吸光度适中,所以用0.5 mol/L NaOH溶液作为提取溶剂。

2.1.2 最适称样量的确定

以样品3为考察对象,准确称取0.100 0、0.150 0、0.200 0、0.300 0 g样品分别加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液,超声提取30 min,3 层滤纸过滤,进行紫外光谱测定。由图3可知,不同称样量的紫外吸收峰数基本一致,故选取0.100 0 g为实验称样量。

752535.jpg 

图 3 不同称样量的牛肝菌紫外指纹图谱

Fig.3 UV fingerprint spectra of boletes sample No.3 with
different sample sizes

2.1.3 最佳提取时间

752553.jpg 

图 4 不同提取时间的牛肝菌紫外指纹图谱

Fig.4 UV fingerprint spectra of boletes samples with
different extraction times

以样品3为考察对象,准确称取0.100 0 g样品,加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液,分别超声提取20、30、40、60 min,3 层滤纸过滤,进行紫外光谱测定。由图4可看出,提取20 min时牛肝菌样品的紫外吸收峰主要集中在190~350 nm波长范围内;提取40 min时吸收峰数较多,因此,选择40 min为超声提取时间。

2.2 重复性、精密度和稳定性实验

以样品3为考察对象,称取0.100 0 g样品5 份,同1.3.1节制取测试液并进行紫外光谱扫描,光谱数据经1.3.2节处理后以吸收波长计算相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)在0.09%~1.81%之间,表明该方法重复性好。

取一份样品3的提取液重复测定10 次,光谱数据经1.3.2节处理后以吸收波长计算的RSD在0.11%~1.92%之间,表明该方法精密度良好。

取一份样品3提取液分别在2、4、6、8、10 h时进行紫外光谱测定,光谱数据经1.3.2节处理,以吸收波长计算的RSD在0.06%~2.33%之间,表明制备液在10 h内稳定。

2.3 不同产地、种类食用牛肝菌紫外指纹图谱分析

752569.jpg 

1~14为样品编号,下同。

图 5 0.5 mol/L NaOH溶液提取的14 种牛肝菌的紫外指纹图谱

Fig.5 UV fingerprint spectra of 14 species of boletes extracted with
0.5 mol/L NaOH (numbered 1 through 14, the same below)

由图5可以看出,牛肝菌样品紫外图谱在190~370 nm波长范围内图谱重叠率较高,在370~500 nm波长范围内图谱重叠率低;每个牛肝菌样品都具有多个特征吸收峰,表现出指纹特性,有利于牛肝菌样品的鉴别分析。

752585.jpg 

图 6 同一产地不同种类牛肝菌紫外指纹图谱

Fig.6 UV fingerprint spectra of different species of boletes from
the same area

752604.jpg 

图 7 同一种类不同产地牛肝菌紫外指纹图谱

Fig.7 UV fingerprint spectra of the same species of boletes from different areas

由图6、7可知,同一产地不同种类和同一种类不同产地牛肝菌样品紫外图谱的峰形、峰高等都具有差异,表现出明显的指纹特性,这可能与气候条件、土壤环境等多种生态因子及不同牛肝菌种类之间差异有关。

2.4 牛肝菌紫外指纹图谱相似度评价

2.4.1 夹角余弦法

表 2 样品间的夹角余弦值

Table 2 The included angle cosine between different samples

夹角余弦值

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

1

1.000

0.936

0.999

0.999

0.929

0.955

0.960

0.955

0.878

0.925

0.998

0.951

0.953

0.950

2

 

1.000

0.936

0.934

0.960

0.956

0.959

0.900

0.854

0.930

0.930

0.956

0.949

0.954

3

 

 

1.000

0.999

0.930

0.955

0.961

0.958

0.884

0.924

0.998

0.950

0.953

0.950

4

 

 

 

1.000

0.926

0.955

0.960

0.955

0.868

0.915

0.999

0.951

0.945

0.951

5

 

 

 

 

1.000

0.933

0.938

0.902

0.874

0.942

0.919

0.933

0.960

0.928

6

 

 

 

 

 

1.000

0.999

0.914

0.836

0.906

0.953

0.998

0.938

0.999

7

 

 

 

 

 

 

1.000

0.924

0.851

0.915

0.959

0.998

0.946

0.998

8

 

 

 

 

 

 

 

1.000

0.860

0.887

0.953

0.904

0.929

0.904

9

 

 

 

 

 

 

 

 

1.000

0.924

0.858

0.833

0.945

0.823

10

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.000

0.903

0.910

0.989

0.900

11

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.000

0.948

0.936

0.949

12

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.000

0.936

0.999

13

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.000

0.930

14

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.000

 

 

由表2可知,夹角余弦为0.999的有7 组,分别是1∶3(样品1与样品3之间的夹角余弦,下同)、1∶4、3∶4、4∶11、6∶7、6∶14和12∶14,表明这7组中两个样品间相似度较高,难以区分。夹角余弦值最小的是9∶14,为0.823,表明两个样品差别大;样品9与其他样品夹角余弦值均在0.900以下,该样品易于区分;同一产地不同物种和同一物种不同产地之间夹角余弦值除1∶3为0.999外,其余都在0.949~0.900之间,样品不易区分开;因此,夹角余弦法对于准确鉴别不同产区、不同种类牛肝菌样品具有一定局限性。

2.4.2 欧氏距离法

表 3 样品间的欧氏距离

Table 3 The Euclidean distance between different samples

编号

欧氏距离

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

1

0.00

310.72

48.64

137.13

433.53

241.41

211.68

313.95

572.27

471.36

80.40

235.03

521.64

245.18

2

 

0.00

320.36

363.68

234.59

279.82

229.68

482.72

718.85

310.99

327.96

241.95

344.61

267.98

3

 

 

0.00

106.18

448.24

228.42

208.04

285.34

542.56

475.83

59.02

231.36

529.14

235.79

4

 

 

 

0.00

503.07

205.87

227.15

223.57

488.00

493.58

79.44

235.48

557.46

220.88

5

 

 

 

 

0.00

429.12

373.98

616.30

849.68

267.08

460.11

387.77

254.37

415.88

6

 

 

 

 

 

0.00

87.34

315.51

558.90

415.53

212.18

69.80

475.64

31.36

7

 

 

 

 

 

 

0.00

352.24

602.97

396.08

205.55

47.23

446.11

77.12

8

 

 

 

 

 

 

 

0.00

425.22

586.53

272.01

361.62

651.58

339.60

9

 

 

 

 

 

 

 

 

0.00

793.21

548.06

603.07

873.17

583.53

10

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0.00

474.30

395.47

106.25

406.90

11

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0.00

224.04

528.18

219.50

12

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0.00

450.49

51.56

13

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0.00

464.63

14

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0.00

 

 

由表3可知,样品间距离最大的是9∶13(样品9与样品13之间的欧氏距离,下同),为873.17,样品9与其他样品间的欧氏距离都十分明显,表明,样品9最易于区分,这与夹角余弦法结论一致;欧氏距离最小的是6∶14,为31.36;同一产地不同种类牛肝菌之间的欧氏距离1∶2、1∶3、2∶3分别为310.72、48.64和320.36,表明同一产地不同种类牛肝菌具有一定差异;同一种类不同产地牛肝菌样品间的欧氏距离2∶8、2∶13、8∶13分别为482.72、344.61和475.64,表明同一种类在不同的环境条件下营养成分及含量具有较大差异,这与2.3节中紫外指纹图谱反映的信息一致。样品间的欧氏距离具有较大差异,能直观地体现样品间差异性,可用于不同产地、种类牛肝菌样品快速鉴别。

2.4.3 主成分分析法

表 4 主成分的特征根及贡献率

Table 4 Characteristic values and contribution rates of three first principal components

主成分

特征值

贡献率/%

累积贡献率/%

PC1

15.548

77.741

77.741

PC2

1.866

9.329

87.070

PC3

1.311

6.556

93.626

 

762126.jpg 

图 8 牛肝菌样品主成分分析的三维图

Fig.8 Three-dimensional diagram of bolete samples by PCA

752659.jpg 

图 9 牛肝菌样品前两个主成分分析的二维图

Fig.9 Two-dimensional diagram of bolete samples by PCA (PC1-PC2)

用SPSS 17.0软件对14 种不同产地、种类食用牛肝菌样品进行主成分分析,前3 个主成分的特征值和贡献率见表4。由表4可看出,主成分1的累积贡献率为77.741%,是牛肝菌样品最重要的成分;前两个主成分的累积贡献率为87.07%(大于85%),前3 个主成分的累积贡献率为93.626%(大于85%),分别能够表达牛肝菌样品紫外指纹图谱全部信息的87.07%和93.626%。以PC1、PC2、PC3构成不同产地、种类牛肝菌主成分的三维投影图,见图8。由图8可看出,样品6与样品14重叠在一起,此外,有部分样品表现成分相似或相近,难以区分所有牛肝菌样品。比较发现,由PC1、PC2构成的二维图中(图9),样品9与其他样品化学成分差异明显,样品6与样品14主成分差异较小;样品间无重叠现象。主成分分析法能够反映出不同产地、种类牛肝菌样品成分差异,可用于牛肝菌样品鉴别和品质评价。

3 结 论

通过单因素试验确定牛肝菌特征成分的提取条件:最佳提取溶剂(0.5 mol/L NaOH溶液),最适称样量(0.100 0 g)和最佳提取时间(40 min)以建立牛肝菌的紫外指纹图谱;分析得出牛肝菌样品的重复性、精密度和稳定性的RSD分别在0.09%~1.81%、0.11%~1.92%、0.06%~2.33%之间,表明该方法具有可靠性。不同产地、种类食用牛肝菌样品紫外光谱曲线具有明显的指纹特性,采用夹角余弦、欧氏距离和主成分分析法进行相似度分析,结果表明3 种分析方法在一定程度上能反映不同产地、种类牛肝菌的特征,但夹角余弦法用于鉴别牛肝菌有一定局限性;欧氏距离法和主成分分析法能较好地反映牛肝菌样品间的差异性,可用于不同产地、种类牛肝菌的快速鉴别和质量控制。紫外指纹图谱分析鉴别技术显示不同产地、种类食用牛肝菌的成分有明显差异,这可能与气候条件、土壤环境等多种生态因子及种间差异有关,今后对食用牛肝菌鉴别分类的研究可以综合考虑生态因子、种间差异的影响。

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收稿日期:2013-08-26

基金项目:国家自然科学基金地区科学基金项目(31260496;31160409);云南省自然科学基金项目(2011FB053;2011FZ195)

作者简介:杨天伟(1989—),男,硕士研究生,主要从事真菌资源研究。E-mail:861825996@qq.com

*通信作者:王元忠(1981—),男,助理研究员,硕士,主要从事真菌资源及药用植物研究。E-mail:boletus@126.com