UPLC-MS-MS法测定饲料、原料乳及乳制品中3 种氯霉素类药物残留

胡 雪，李翠枝*，刘丽君，康 恺，白艳梅，段国霞，张立佳

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

摘 要：建立超高效液相色谱-质谱联用法检测饲料、牛乳及广义乳制品中氯霉素类药物残留的通用检测方法。研究适用于检测饲料、原料乳、液体乳、发酵乳、含乳饮料、乳粉、奶片、冷冻饮品中氯霉素类药物的前处理方法以及适用的超高效液相色谱及质谱条件。样品经低温冷冻沉淀蛋白质后，乙腈提取，饱和氯化钠使乙腈、水分层，取上清液氮气吹干定容后，正己烷除脂，乙腈、水梯度洗脱，电喷雾负离子多反应监测模式进行检测。氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素定量限0.1 μg/kg。氯霉素类药物添加范围0.1～2.5 μg/kg时，基质效应为57.9%～139.2%，回收率为64.3%～120.2%，相对标准偏差为2.1%～10.0%。该方法具有简单方便、检测周期短、适用于更广泛样品检测的特点。

关键词：超高效液相色谱-质谱联用；氯霉素类药物；饲料；乳制品

Determination of Chloramphenicol, Thiamphenicol and Florfenicol Residues in Feed, Raw Milk and
Dairy Products by UPLC-MS-MS

HU Xue, LI Cui-zhi*, LIU Li-jun, KANG Kai, BAI Yan-mei, DUAN Guo-xia, ZHANG Li-jia

(Inner Mongolia Yili Industrial Group Co. Ltd., Hohhot 010110, China)

Abstract: An ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS) method for simultaneous determination of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol residues in feed, raw milk and dairy products was developed. The extraction procedures and the UPLC-MS-MS conditions for feed, raw milk, liquid milk, fermented milk, milk drinks, milk powder, milk tablet and frozen drinks were studied. After protein in samples was precipitated by cooling down, the compounds were extracted into acetonitrile, which was separated into layers in the presence of added saturated sodium chloride. The supernatant was dried under nitrogen, and then re-dissolved before the removal of fat by addition of n-hexane. The compounds were analyzed in a negative electrospray ion multiple reaction monitoring mode with a mobile phase composed of acetonitrile and water by means of gradient elution. The limit of quantification (LOQ) was 0.1 μg/kg
for chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol. The matrix effects, recovery rates, and relative standard deviation (RSD) were 57.9%–139.2%, 64.3%–120.2% and 2.1%–10.0%, at fortification levels of 0.1–2.5 μg/kg for chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol, respectively. This method is simple, convenient, fast and suitable for the quantification and confirmation of chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol in feed, milk and dairy products.

Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS); chloramphenicol; feed; dairy products

中图分类号：TS252.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）16-0110-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201416021

农业部235号公告中规定，乳中不得检出氯霉素，甲砜霉素残留限量为50 μg/kg，GB/T 22338—2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》中规定动物源性食品中氯霉素的定量限0.1 μg/kg。对于大型的乳品企业或者检测机构来说，经常要同时监测原料乳及各种乳制品中的氯霉素类药物残留，有时还要溯源到奶牛食用的饲料。但是在检测的时候饲料和乳制品需要用不同的检测方法[1-2]，而且国标和参考文献中涉及到的样品都有一定的适用范围[3-9]，步骤较为繁琐[10-15]，检验成本较高[16]，不适用于大量、快速地对饲料、原料乳及乳制品中氯霉素类药物残留进行排查。广义的乳制品除了常规认为的液体乳、乳粉，还包括发酵乳、奶片、含乳饮料及含乳冷冻饮品等。虽然有针对含乳冷冻饮品的检测方法[17]，但其乙酸乙酯的提取方法只适用于纯乳雪糕及老冰棍，大部分成分复杂的冷冻饮品在液-液萃取的时候会出现严重的乳化现象。本工作拟利用一种简单并适用于更多样品的前处理方法结合超高效液相色谱-质谱联用（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS）法实现对乳品行业所涉及到的饲料及产品中氯霉素类药物残留的快速、高效、准确排查。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

饲料包括青贮饲料和豆粕饲料；液体乳包括纯牛乳和核桃乳；发酵乳包括原味发酵乳和大果粒发酵乳；乳粉包括婴幼儿配方乳粉和成人乳粉；冷冻饮品包括含巧克力的和含豆类的。

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素（纯度均大于97%） 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；同位素标准品氯霉素-D5 美国Cambridge Isotope Laboratories公司；乙腈（色谱纯）、正己烷（色谱纯） 德国Meker公司。

1.2 仪器与设备

SIGMA 3K30低温高速离心机（温度可设置0 ℃，转速可设置20 000 r/min） 德国Sigma公司；TQ Detector超高效液相色谱-质谱联用仪（配有电喷雾离子源） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 前处理

牛乳、液体乳、发酵乳、含乳饮料等液体样品称取5 g试样，置于30 mL具塞离心管中，加入2 g氯化钠、10 mL乙腈和100 μg/mL的内标溶液50 μL，涡旋混匀。在4 ℃冰箱中静置20 min，之后0 ℃、10 000 r/min离心5 min。取5 mL上清液于35 ℃氮气流下吹干，用0.5 mL 20%甲醇溶液溶解，旋涡振荡，加入0.5 mL正己烷，旋涡振荡，转移至1.5 mL离心管中，4 ℃、20 000 r/min
离心5 min，吸取下层液体至进样瓶中，供超高效液相色谱-质谱联用仪分析使用。饲料、乳粉、奶片、冷冻饮品等固体样品均质粉碎后取0.5 g试样，置于30 mL具塞离心管中，加入5 mL、40 ℃超纯水，混匀后前处理步骤与液体样品相同。成分复杂的冷冻饮品用正己烷除脂两次，可以得到清澈的待测液。

1.3.2 标准曲线的制备

分别准确称取适量的氯霉素、氯霉素-D5、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准物质，用乙腈配制成100 μg/mL标准储备溶液，4 ℃避光保存，标准储备液在6 个月内稳定。将氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素用20%甲醇溶液配制成100 μg/L的混标，氯霉素-D5单独稀释成100 μg/L的中间工作液。将100 μg/L的混标用20%甲醇溶液配制为适当质量浓度（0.25、0.5、1、2.5、5、10、25 μg/L）的标准工作液，标准工作液含内标质量浓度为2.5 μg/L。氯霉素用内标法定量，甲砜霉素、氟甲砜霉素用外标法定量。

1.3.3 空白基质标线的制备及添加回收率

样品相同的前处理方法得到空白基质液，用该空白基质液将混标配制成所需质量浓度的标准工作液，上机后得到空白基质标线。添加回收率实验，在阴性样品中添加一定质量浓度的混标，混匀后按照样品前处理方法进行处理，上机后得到的结果与理论添加值的比值，即为回收率。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流动相：A为乙腈，B为水；流速：300 μL/min；线性梯度洗脱条件：0～2 min，5%～45% A；2～3 min，45%～55% A；3.0～3.5 min，55%～100% A；3.5～4.0 min，100%～5% A；4～5 min，5% A。

1.3.5 质谱条件

电离模式：电喷雾负离子模式；毛细管电压：2.8 kV；源温：120 ℃；脱溶剂温度：400 ℃；脱溶剂气流量：600 L/h；碰撞室压力：0.31 Pa（3.1×10–3 mbar）。多反应监测方式检测，其他质谱条件见表1。

表 1 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的质谱条件

Table 1 MS-MS conditions for chloramphenicol,
thiamphenicol and florfenicol

注：*.定量离子。

2 结果与分析

2.1 前处理方法选择

乙腈和乙酸乙酯是氯霉素类药物常用的提取液，经过实验发现大多数成分复杂的婴幼儿乳粉及冷冻饮品用乙酸乙酯提取时会发生严重的乳化现象，因此选择乙腈作为提取液。但是乙酸乙酯可以和水分层，乙腈和水互溶，因此添加氯化钠，使得饱和氯化钠溶液和乙腈分层明显。经过实验发现，常温离心和冷冻离心的区别非常明显，样品经过充分降温并在0 ℃高速离心后，脂肪蛋白沉淀增多，上清液更加透明，因此选择冷冻离心。除了成分复杂的冷冻饮品以外，其他的样品经过正己烷一次除脂以后可达到上机要求，部分冷冻饮品经过正己烷一次除脂以后依然混浊，此时弃去上层正己烷，进行二次除脂可达到上机要求。

2.2 液相条件选择

色谱柱选择Acquity UPLC BEH C18柱，氯霉素类药物在C18柱上的保留性不是很强，为了推后出峰时间，实现更好地分离效果，减少基质效应，选用梯度洗脱，起始流动相中有机相含量选择C18柱的最低耐受量5%。流动相体系选择6 种进行比较，分别为0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、10 mmol/L乙酸铵-甲醇、10 mmol/L乙酸铵-乙腈、水-甲醇、水-乙腈，纯牛乳空白基质配制标准工作液质量浓度为2.5 μg/L，不同液相条件下的总离子流色谱图如图1所示。甲醇体系虽然分离效果更好，但是都有严重的拖尾现象，乙腈体系峰形优于甲醇体系，而且甲砜霉素在乙腈体系中响应值更高。在3 种乙腈体系中，水-乙腈的响应值最高。因此，综合考虑基质效应、分离效果、峰形和响应值高低，最终选择水-乙腈体系。

1.甲砜霉素；2.氟甲砜霉素；3.氯霉素。

a. 0.1%甲酸-甲醇；b. 10 mmol/L乙酸铵-甲醇；c. 水-甲醇；d. 0.1%甲酸-乙腈；e. 10 mmol/L乙酸铵-乙腈；f. 水-乙腈。

图 1 不同液相条件下的总离子流色谱图

Fig.1 Total ion chromatograms obtained with different mobile phases

2.3 基质效应实验

质谱基质效应的影响因素有很多，可以优化的条件包括样品前处理、同位素内标、色谱分离、质谱分析等[18-19]。本实验采用的前处理方法和液相方法较简便，同时检测的样品种类繁多，因此氯霉素采用内标法定量。针对不同类样品，选择具有代表性的样品进行了基质效应的考察。用每种空白基质配制2.5 μg/L
的标准工作液与用20%甲醇配制的标准工作液进行比较，二者峰面积做比值，大于100%的有基质增强作用，小于100%的有基质抑制作用[20]。每个样品重复条件下做5 次，取平均值，不同类样品基质效应的结果见表2。饲料有明显的基质抑制作用，其他样品都有不同程度的基质增强作用，基质增强较明显的是发酵乳，因此在定量的时候，饲料和发酵乳要用空白基质配制标准曲线。

表 2 各种样品的基质效应

Table 2 Matrix effects of different samples

%

2.4 准确度与精密度实验

每类样品选择具有代表性的样品进行回收率实验，6 次结果计算平均值，对于基质效应较强的样品如饲料和发酵乳，用空白基质配制标准曲线进行定量，测定数据见表3。

表 3 不同样品回收率及相对标准偏差实验结果

Table 3 Recovery and relative standard deviation (RSD) of different samples

由表3可知，按已确定的样品前处理条件和仪器条件测定添加回收率，其回收率达到64.3%～120.2%，相对标准偏差在2.1%～10.0%，说明该方法适用于饲料、原料乳和广义乳制品中不同含量氯霉素类药物残留的测定，均有较好的准确度和精密度。选择国标规定的定量限0.1 μg/kg做回收率添加实验，其中，基质抑制最明显，响应值最低的青贮饲料，氯霉素信噪比为29.6，甲砜霉素信噪比为17.0，氟甲砜霉素信噪比为26.9，所有样品在该添加水平测得的信噪比均大于定量限信噪比10。因此该方法定量限依据国标定为0.1 μg/kg。

3 结 论

提供了一种适用于饲料、原料乳及更广泛样品快速简单的UPLC-MS-MS检测方法，对前处理、液相条件进行了优化，在氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的添加量为0.1～2.5 μg/kg时，其准确度和精密度均符合要求，定量限和国标中规定的一致。考察了饲料、原料乳及广义乳制品用冷冻法沉淀蛋白，乙腈提取，正己烷除脂的前处理条件下，不同样品的基质效应，保证了该检测方法的可靠性。与其他检测方法相比，该检测方法具有以下特点：前处理简单，节省检测成本，检测周期短，适用于乳品行业从源头（饲料）一直到产品（更广泛样品）所涉及到的样品的检测。

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