RP-HPLC法分析萱草属植物花蕾中
游离氨基酸组成

杨 利1,2，李晓东2，刘树英1，孙国峰2，林秦文2，刘洪章1,*，张金政2

（1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；2.中国科学院植物研究所，北京 100093）

摘 要：目的：分析萱草属植物8 个野生种和25 个栽培品种花蕾中游离氨基酸的组成特性。方法：以邻苯二甲醛作为衍生试剂，采用柱前在线衍生反相高效液相色谱法对该属植物花蕾中游离氨基酸组成进行分析，利用主成分分析法对游离氨基酸进行综合评价。结果：供试样品游离氨基酸总量在6.864～21.219 mg/g之间；在萱草属植物花蕾中能检测出14～16 种游离氨基酸，且含量存在差异；其中呈味氨基酸以Asp、Gly、Ser和Glu等鲜甜味氨基酸含量最为丰富。通过综合评价指数得出：萱草属植物中食用品种黄花菜、小黄花菜、北黄花菜和‘白花’萱草等的品质最优，‘金娃娃’萱草和‘春节’萱草的品质较优，‘馨口’和‘银光芙蓉’萱草的品质最差。

关键词：萱草；游离氨基酸；反相高效液相色谱；邻苯二甲醛

Analysis of Free Amino Acids in Flower Buds of Hemerocallis Genus Plants by RP-HPLC

YANG Li1,2, LI Xiao-dong2, LIU Shu-ying1, SUN Guo-feng2, LIN Qin-wen2, LIU Hong-zhang1,*, ZHANG Jin-zheng2

(1. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;

2. Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China)

Abstract: Objective: To analyze the composition of free amino acids in flower buds of plants from 8 wild species and 25 cultivated species of the genus Hemerocallis. Methods: A high performance liquid chromatography (HPLC) method to determine free amino acids in flower buds of Hemerocallis genus plants was proposed using on-line precolumn derivatization with o-phthalaldehyde. Comprehensive evaluation of these Hemerocallis species based on free amino acid composition was performed by principal component analysis. Results: The results showed that the total amount of free amino acids varied from 6.864 to 21.219 mg/g in flower buds of the 33 Hemerocallis species tested；14–16 kinds of free amino acids were detected and their contents differed among different Hemerocallis species. All the investigated samples were richest in asparagine, glycine, serine and glutamic acid among the flavor amino acids identified. Based on comprehensive evaluation index, the edible species of Hemerocallis, Hemerocallis citrine, Hemerocallis minor, Hemerocallis lilioasphodelus and Hemerocallis bearing white flowers, had the best quality followed by Hemerocallis ‘Stella Deoro’ and Hemerocallis ‘First Spring’, whereas Hemerocallis ‘Xinkou’ and Hemerocallis ‘Yinguangfurong’ showed the poorest quality.

Key words: Hemerocallis; free amino acids; reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC); o-phthalaldehyde

中图分类号：TS207 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）16-0143-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201416028

萱草属（Hemerocallis L.）植物为百合科（Liliaceae）多年生宿根草本植物，全世界共有14种，其中原产我国约有11 种[1]，直至2002 年底美国萱草协会已被注册登记的萱草园艺种已多达5万个[2]。萱草属植物的花可以观赏，部分野生种和栽培品种可以入药和当蔬菜食用[3]。如其中的黄花菜，又名金针菜就是一种具有较高营养价值的特色蔬菜[4]。
该种植物富含糖类、蛋白质、维生素、无机盐、香气物质及多种人体必需的氨基酸，成为人们餐桌上一道特有的美味[5-6]。目前人们食用的萱草属植物野生种主要包括黄花菜、北黄花菜和小黄花菜[7]。黄花菜产区湖南主栽品种主要是‘猛子花’、‘冲里花’和‘白花’等，甘肃主栽品种主要是马连黄花、线黄花和小花黄花菜等[8]。目前萱草属植物用于观赏的种或品种占绝大部分，而这些种或品种是否具有潜在的食用或药用价值，仍不清楚。

游离氨基酸（free amino acid，FAA）指以游离状态存在、未经水解等处理就能获得的非蛋白质氨基酸[9]。FAA是食品中重要的营养成分，具有增鲜和提高机体免疫力的作用[10-11]。此外，大多数FAA还是甜味或苦味的前体物质[12]，斯特雷克尔退化或美拉德反应中的化合物可能有助于不同途径芳香化合物的形成[13]。因此，FAA的检测是食品检测的一个重要指标。目前FAA的检测方法包括直接分析法和间接分析法，如高效液相色谱-蒸发光散射检测法、液相色谱-质谱联用法、衍生化高效液相色谱法和衍生化离子交换色谱法等[14]。柱前衍生反相高效液相色谱法是近年研究较多的一种氨基酸分析方法，以其灵活和易于推广的特点，成为FAA检测的常规手段。

有关萱草属植物中FAA的研究，不仅可以加深对该属植物营养价值的了解，而且对于建立黄花菜食品产业的质量标准具有重要推动作用。而有关萱草属植物中FAA组成及含量的研究鲜见报道，限制了更多该属植物资源的应用。本研究采用邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）柱前衍生结合反相高效液相色谱法，对萱草属8 个野生种和25 个栽培品种的FAA组成及含量进行分析，以期为进一步扩展萱草属植物资源的利用途径以及寻找有食药价值的育种材料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

萱草属植物8 个野生种和25 个栽培品种的新鲜花蕾（表1）由中国科学院植物研究所萱草种质资源提供，样品采集后加适量液氮研磨成粉末，于－40 ℃冰箱中保存备用。

乙腈和甲醇（色谱纯） 美国Sigma公司；超纯水由美国Milli-Q超纯水系统制备；乙醇、冰乙酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠、四硼酸钠、邻苯二甲醛、巯基乙醇等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DionexU3000HPLC高效液相色谱系统（配DGP-3600泵、WPS-3000自动进样器、TCC-3100自动控温柱箱、DAD-3000检测器）、电子天平 日本岛津公司；HWS-26电热恒温水浴锅 上海一恒公司；KQ-100DE型数控超声波清洗器 江苏昆山超声仪器有限公司；3-30k高速冷冻离心机 美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 样品提取条件优化

准确称取6 份1.0 g新鲜样品，用7 mL不同溶剂（纯水、体积分数10%乙酸溶液和体积分数80%乙醇溶液）研磨后装入试管中分别进行90 ℃水浴20 min和室温超声振荡30 min 2种方法处理，离心（12 000 r/min，10 min），滤渣按上法重新提取一次。合并2 次上清液；0.22 µm滤膜过滤后保存在－20 ℃冰箱，用于反相高效液相色谱分析，每个处理重复3 次；优化后的提取方法用于后续萱草属植物游离氨基酸分析提取方法。

1.3.2 在线衍生化

用自动进样针吸取5.0 µL pH 9.5的硼酸缓冲液，再吸取1.0 µL的OPA，洗针一次，再吸取2.0 µL样品，洗针一次，原位混合6 次，等待90 s，进样。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×
4.6 mm，5 µm）；柱温40 ℃；检测波长338 nm；流速1 mL/min。流动相A：V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（水）=
45∶45∶10；流动相B：10 mmol/L pH 7.5磷酸二氢钠。洗脱程序：0 min，100%B；10 min，82%B；15 min，76%B；21 min，59%B；23 min，57.8%B；25 min，42%B；27 min，41%B；31 min，100%B。

1.3.4 定性与定量分析

以16 种氨基酸标准品的保留时间定性；以氨基酸质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，求得16 种氨基酸的线性方程，面积归一化法对测试样品的游离氨基酸进行定量分析。重复3 次，单位为mg/g。

2 结果与分析

2.1 样品提取条件优化

图 1 不同提取条件下TAA（A）以及Asp（B）含量

Fig.1 Effects of extraction solvents and techniques on the assay of total amino acids and Asp

由图1可以看出，新鲜花蕾中游离氨基酸总量的提取效果分别为纯水超声＞体积分数80%乙醇水浴＞纯水水浴＞体积分数80%乙醇超声＞体积分数10%乙酸超声＞体积分数10%乙酸水浴，水对于总游离氨基酸（total amino acid，TAA）的浸出效果优于乙醇。单个氨基酸天冬氨酸（Asp）含量的提取效果为体积分数80%乙醇水浴优于纯水超声和纯水水浴，乙醇和水的提取效果明显优于乙酸提取。综合考虑单个游离氨基酸提取效率和总氨基酸含量，在萱草属植物游离氨基酸分析中选择水作为提取溶剂，超声波辅助提取。

2.2 氨基酸标准品的色谱图

经OPA在线衍生后用建立的色谱方法能够较好地分离16 种氨基酸混合标准品及样品（图2）。在所检测的质量浓度范围内，响应值与质量浓度呈良好的线性关系，其相关系数均大于0.998 6。

1.天冬氨酸（Asp）；2.谷氨酸（Glu）；3.丝氨酸（Ser）；4.组氨酸（His）；5.甘氨酸（Gly）；6.苏氨酸（Thr）；7.丙氨酸（Ala）；8.精氨酸（Arg）；9.胱氨酸（Cys）；10.酪氨酸（Tyr）；11.缬氨酸（Val）；12.甲硫氨酸（Met）；13.苯丙氨酸（Phe）；14.异亮氨酸（Ile）；15.亮氨酸（Leu）；16.赖氨酸（Lys）。

图 2 氨基酸混合标准品（A）以及黄花菜中氨基酸（B）色谱图

Fig.2 HPLC-DAD chromatograms of free amino acids from mixed standard solution and H. citrina

2.3 萱草属植物游离氨基酸组成

所测萱草属植物中检出16 种已知游离氨基酸中的14～16 种（表2），其中包括7 种必需氨基酸（Lys、Thr、Val、Met、Phe、Ile、Leu），1 种条件必需氨基酸（Tyr），2 种营养半必需氨基酸（His、Arg）和6 种非必需氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、Ala、Cys）。

萱草属植物游离氨基酸总量差异较大，在6.864～21.219 mg/g间波动，其中黄花菜TAA含量最高，为21.219 mg/g。萱草属植物中Glu、Leu、Ile、Asp、Ser、Thr和His为主要游离氨基酸，其含量超过游离氨基酸总量的75%。Glu在第1类样品和第3类样品中含量均高达4 mg/g以上。Phe、Ala、Val、Lys和Tyr，含量较低。在9 个萱草属植物如小黄花菜、北萱草和猛子花等中未检测到Val，在5 个萱草属植物中未检测到Tyr，在‘摩盒’、‘馨口’和‘银光芙蓉’萱草中未检测到Lys。

表 2 萱草花蕾中游离氨基酸的组成及含量分析

Table 2 Free amino acids and their relative amounts in flower buds of Hemerocallis genus plants

mg/g

注：*.人体必需的氨基酸；—.未检出。

2.4 萱草属植物中必需氨基酸和呈味氨基酸的组成

萱草属植物中必需氨基酸含量丰富，第1类样品和第3类样品必需氨基酸含量相差不大，第4类样品中必需氨基酸含量最低。氨基酸在结构上的差别取决于侧链基团的不同，这一差别也影响了氨基酸的口味感官[15]。按照氨基酸的味觉强度，可以大致把氨基酸分为鲜味氨基酸（Asp＋Glu＋Gly＋Ala＋Lys）、甜味氨基酸（Ser＋Thr＋
His）、芳香氨基酸（Cys＋Tyr＋Phe）、苦味氨基酸（Arg＋Val＋Met＋Ile＋Leu）。综合表2和图3可知，第1类测试样品中鲜味氨基酸含量明显高于其他3 类，鲜味氨基酸的含量高于其余3 种味觉氨基酸的含量，鲜味氨基酸是赋予黄花菜的鲜美口味的重要因素。第3类测试样品中甜味氨基酸均值含量偏低，苦味氨基酸含量较高。然而从表3可以看出苦味氨基酸的味觉阈值较高因此萱草属植物中未感觉到苦味感官，而鲜味氨基酸的味觉阈值较低，尤其Asp和Glu所具有的鲜味特征增强了黄花菜中整体风味的鲜味感官。

图 3 4 类萱草属样品中各呈味氨基酸和必需氨基酸的含量均值

Fig.3 Average values of flavor amino acids and essential amino acids in four classes of Hemerocallis samples

表 3 各种风味氨基酸的味觉阈值

Table 3 Taste threshold of each flavor amino acid

2.5 萱草属植物中游离氨基酸综合评价

以萱草属植物中检测到的16 种游离氨基酸含量进行主成分分析，结果见图4。除了小萱草和重瓣萱草外，第1类、第2类和第3类测试样品均分布在A区，影响A、B区域样品分布的主要因素是Glu、His和Arg的含量差异。从图4可以看出，Glu、Asp和Gla 3 种氨基酸的含量差异是影响A区测试样品的主要因素，影响B区测试样品分布的因素主要是Arg、His和Thr 3 种氨基酸的含量变化。

图 4 主成分因子得分图

Fig.4 PCA scatter diagram of samples based on FAA profile

游离氨基酸的种类和含量在一定程度上影响植物的营养价值和风味，游离氨基酸可以直接被人体小肠吸收、利用，为机体提供营养；同时呈现甜味、酸味以及鲜味的不同氨基酸共同作用影响风味[16]。根据综合评价指数分值可知（表2），黄花菜综合评分最高为3.086，小黄花菜次之为2.615。从表2可以看出，黄花菜的TAA含量也是最高的，观赏品种‘金娃娃’萱草综合评分为0.366，该品种TAA含量为15.351 mg/g与‘猛子花’萱草TAA含量接近。由图4可以看出，主成分1主要由鲜味（Glu＋Asp）和苦味氨基酸（Leu＋Met＋Ile）组成，主成分2主要由甜味氨基酸（His＋Thr＋Ser）组成。黄花菜鲜味氨基酸含量最高，小黄花菜鲜味和甜味氨基酸含量均较高，‘金娃娃’萱草和‘春节’萱草甜味氨基酸含量最高鲜味氨基酸含量较低。通过主成分分析对萱草属植物的游离氨基酸进行综合评价，通常综合指数数值越大，综合质量就越好[15,17]。就游离氨基酸含量分析，萱草属植物中食用品种黄花菜、小黄花菜、北黄花菜和‘白花’萱草等的品质最优，‘金娃娃’萱草和‘春节’萱草的品质较优，‘馨口’和‘银光芙蓉’萱草的品质最差。

3 讨论与结论

3.1 游离氨基酸的组成

产物的风味主要决定于游离氨基酸含量的多少，特别是那些具有鲜味的氨基酸含量的多少[16]。因此，一般认为，游离氨基酸含量可以作为食品鲜美度的评价指标[18-19]
或重要影响指标[20]。Yoshie等[21]研究指出，FAA含量越高且Ala、Asp、Gly和Glu等呈味氨基酸越多，越能让人感到味美鲜甜。唐道邦等[22]对鲜黄花菜花蕾氨基酸测定，含量在1.308 g/100 g左右，必需氨基酸含量丰富。本研究以萱草属植物8 个野生种和25 个栽培品种的花蕾为材料，利用PR-HPLC技术检测了萱草属植物花蕾中16 种一级游离氨基酸，测试样品游离氨基酸中必需氨基酸含量丰富，包括7 种必需氨基酸、1 种条件必需氨基酸和2 种营养半必需氨基酸，7种必需氨基酸总含量在2.578～8.583 mg/g之间，与唐道邦等[22]研究相符。黄花菜味美鲜甜的口感可能是其富含游离氨基酸相关，糖类和氨基酸化合物进行美拉德反应，能获得各种不同的风味[23]。但不同氨基酸的味觉阈值不同，含量高的风味氨基酸并非一定对食品的风味贡献大，且同一氨基酸不同的构型呈现不同的口感，有的甚至呈现相反的口感[24]，因此从游离氨基酸种类来看，评价风味品质还需对各氨基酸的构型作更深入的研究工作。

3.2 萱草属植物中游离氨基酸综合评价

本研究比较了33 种（品种）萱草属植物花蕾中游离氨基酸组成与含量的差异，利用综合评分指数对萱草属植物游离氨基酸含量进行评价，综合评分指数越高说明其氨基酸综合质量越好，筛选出萱草属植物中游离氨基酸综合质量较高的种类。单纯考虑游离氨基酸的含量，萱草属植物中食用品种黄花菜、小黄花菜、北黄花菜和‘白花’萱草等的品质最优，‘金娃娃’萱草和‘春节’萱草的品质较优，‘馨口’和‘银光芙蓉’萱草的品质最差。

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