腐乳发酵过程挥发性风味成分的变化

卢 靖，刘 平，张丽珠，车振明*

（西华大学生物工程学院，四川 成都 610039）

摘 要：采用固相微萃取法结合气相色谱-质谱法对腐乳发酵过程不同时期的挥发性风味成分进行分析，共鉴定出化合物110 种，包括酯类41 种、醛类19 种、酮类12 种、醇类12 种、酸类9 种、烃类9 种、其他类化合物8 种。不同发酵时期腐乳挥发性风味成分差异明显，随着发酵的进行，挥发性风味成分的种类逐渐增多。在前发酵过程中，豆腐白坯经毛霉发酵成毛坯，醛类相对含量显著降低，酯类、醇类相对含量以及种类逐渐增大；在后发酵过程中，随着后发酵时间的延长，醛类、酸类、酯类相对含量逐渐升高，烃类、醇类相对含量逐渐降低。其中正己醛、苯乙醛、壬醛、双戊烯、异戊醇、己酸乙酯、苯乙酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、2-正戊基呋喃、烯丙基甲基二硫醚对腐乳风味的形成贡献较大。

关键词：腐乳；固相微萃取；挥发性风味成分；气相色谱-质谱法

Changes in Volatile Flavor Compounds in Sufu during Fermentation

LU Jing, LIU Ping, ZHANG Li-zhu, CHE Zhen-ming*

(College of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

Abstract: Volatile compounds in samples collected at different stages during the fermentation of sufu were extracted and analyzed by solid phase micro-extraction (SPME) combined with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that 110 volatile compounds were isolated and identified, which included 41 esters, 19 aldehydes, 12 ketones, 12 alcohols, 9 acids, 9 hydrocarbons and 8 other compounds. Volatile composition differed significantly across various processing stages. More volatile compounds were detected as the fermentation proceeded. The relative contents of aldehydes were decreased significantly after Mucor fermentation, whereas the relative contents and kinds of esters and alcohols were increased. As the post-fermentation proceeded, the relative contents of aldehydes, acids and esters were increased gradually. Among these volatile compounds, caproaldehyde, 2-phenylethanale, nonanal, dipentene, ethyl caproate, ethyl phenylacetate, ethyl valerate, ethyl octanoate, 2-amylfuran and allyl methyl disulphide had an important contribution to the flavor of sufu during the fermentation process.

Key words: sufu; solid phase micro-extraction (SPME); volatile flavor; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）16-0175-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201416034

腐乳又称豆腐乳，是我国传统的大豆发酵制品，有东方乳酪之称[1]。它不仅味道鲜美、风味独特，而且还富含膳食纤维、异黄酮和大豆多肽等多种生理活性物质，深受广大消费者喜爱[2]。近年来，国内外学者对腐乳挥发性风味成分进行了大量研究，如蒋丽婷等[3]采用顶空固相微萃取（headspace-solid phase micro-extraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术分析了白腐乳的挥发性风味成分；黄明泉等[1]对北京地区的2种王致和腐乳和3 种老才臣腐乳的挥发性成分进行了比较分析；Chung等[4]采用超临界萃取仪结合GC-MS联用技术对3 种白腐乳风味成分进行了研究。但是，国内外对腐乳发酵过程风味成分分析、变化以及形成机理等方面的研究却鲜有报道。

本研究跟踪腐乳发酵过程，采用固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）结合GC-MS联用技术分离鉴定腐乳发酵过程主要的风味成分，同时研究其主要风味成分的变化，分析风味的形成机理，以期为腐乳品质的提高及工艺的改进提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

豆腐白坯（A）、毛坯（B）、腌坯（C）、后发酵21 d腐乳（D）、后发酵36 d腐乳（E）均为实验室自制。

1.2 仪器与设备

固相微萃取装置 上海安谱科学仪器有限公司；QP2010Plus气相色谱质谱仪 日本岛津公司；电热恒温水浴锅 江苏省金坛市环宇科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 毛霉纯种发酵腐乳的工艺

工艺流程：大豆精选→浸泡→磨浆→点浆→蹲脑→压榨→白坯→摆盘→接种→前期发酵→毛坯→腌制（7 d）→

↓ ↓

纯种孢子液 各种辅料

→腌坯→密封→后期发酵→成品。

豆腐白坯经过前发酵培养48 h，得到毛坯，搓毛后分别加入适量食盐、白酒、辣椒、生姜和大蒜等拌匀，腌制一周后分装于经消毒的真空袋中，抽真空后置于25 ℃条件下进行后期发酵。分别取白坯、毛坯以及腌坯、后发酵21 d、后发酵36 d样品进行挥发性成分的测定。

1.3.2 挥发性物质的提取

将豆腐样品研磨均匀，取3 g样品加入到15 mL顶空进样瓶中。密封后置于电热水浴锅中在60 ℃加热平衡10 min，将老化后的75 μm PDMS/CAR萃取头插入进样瓶顶空萃取。顶空吸附30 min后，插入GC进样口解吸5 min。

1.3.3 分析条件

色谱条件：色谱柱DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；升温程序：起始温度32 ℃，保持5 min；然后以4 ℃/min的速率升温到130 ℃；最后以10 ℃/min的速率升温到200 ℃；载气（He）流速1.0mL/min。

质谱条件：离子源温度230 ℃；接口温度250 ℃；电离方式：电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z 40～350。

利用计算机NIST谱库数据检索，各组分相对含量按峰面积归一化法进行计算分析。

2 结果与分析

2.1 GC-MS鉴定腐乳挥发性成分

分别对5 个时期样品总离子流图进行数据分析，鉴定出腐乳不同发酵时期的挥发性风味成分及相对含量见表1，将这些挥发性成分按结构分类，结果见表2。

表 1 腐乳发酵过程中挥发性风味成分及其相对含量

Table 1 Volatile compounds and their contents in fermented bean curd during fermentation

表 2 腐乳发酵过程中挥发性化合物的种类及相对含量

Table 2 Changes in the composition and relative contents of volatile compound classes during fermentation

由表1和表2可知，从5 个样品中共检测出110 种挥发性风味物质，包括醛类、酮类、烯烃类、醇类、酸类、酯类等化合物。

A中检测出36种挥发性风味物质，其中醛类化合物14 个，酮类化合物3 个，酸类化合物3个，烃类化合物3 个，醇类化合物3 个，酯类化合物6 个，其他化合物4 个，其中相对含量较大的为正己醛（51.54%）、壬醛（5.17%）、双戊烯（6.59%）、α-松油醇（4.84%）、己酸乙酯（2.41%）、2-正戊基呋喃（5.99%）等。

B中检测出57 种挥发性风味物质，其中醛类化合物11 个，酮类化合物3 个，酸类化合物4 个，烃类化合物6 个，醇类化合物7 个，酯类化合物22 个，其他化合物4 个，其中相对含量较大的为双戊烯（3.2%）、异戊醇（7.85%）、正己醇（6.54%）、己酸乙酯（4.47%）、异戊酸甲酯（6.85%）、（E）-2-甲基-2-丁烯酸甲酯（5.87%）、2-正戊基呋喃（9.17%）等。

C中检测出59 种挥发性风味物质，其中醛类化合物12 个，酮类化合物4 个，酸类化合物4个，烃类化合物6 个，醇类化合物3 个，酯类化合物22 个，其他化合物8 个，其中相对含量较大的为辛醛（2.35%）、双戊烯（16.2%）、异戊醇（23.16%）、己酸乙酯（3.94%）、2-正戊基呋喃（8.11%）、二烯丙基二硫醚（6.3%）等。

D中检测出63 种挥发性风味物质，其中醛类化合物13 个，酮类化合物6 个，酸类化合物4个，烃类化合物5 个，醇类化合物6 个，酯类化合物22 个，其他化合物7 个，其中相对含量较大的为正己醛（5.41%）、壬醛（2.06%）、2-庚酮（2.41%）、双戊烯（3.43%）、异戊醇（17.56%）、己酸乙酯（7.98%）、戊酸乙酯（4.51%）、辛酸乙酯（3.31%）、2-正戊基呋喃（7.9%）、二烯丙基二硫醚（3.29%）、烯丙基甲基二硫醚（2.69%）等。

E中检测出66 种挥发性风味物质，其中醛类化合物9 个，酮类化合物5 个，酸类化合物8个，烃类化合物7 个，醇类化合物8 个，酯类化合物23 个，其他化合物6 个，其中相对含量较大的为正己醛（6.21%）、苯乙醛（2.65%）、壬醛（2.59%）、异戊醇（11.29%）、正己醇（3.72%）己酸乙酯（8.21%）、苯乙酸乙酯（1.36%）、戊酸乙酯（1.31%）、辛酸乙酯（5.38%）、2-正戊基呋喃（7.98%）、烯丙基甲基二硫醚（4.02%）等。

2.2 腐乳发酵过程中挥发性成分分析

酯类物质是食品香气的主要成分，赋予食品香甜、果香[5]。豆腐白坯中检测出7 种酯类物质，相对含量仅为3.09%，白坯经毛霉前发酵形成毛坯后，酯类物质的种类和相对含量迅速增加，共检出22 种酯类化合物，相对含量达到37.2%，说明在此阶段，毛霉以及其他生长在白坯上的微生物生长代谢活跃，产生了大量的醇、酸和酯类物质[6]。毛坯腌制后，酯类物质相对含量显著降低，这是由于加入的辅料中烃类、醛类等物质相对含量较多的原因。另外，由于腌制过程乙醇的加入使得乙酯类物质的种类不断丰富，且除己酸乙酯、戊酸乙酯外，乙酯类物质相对含量都出现了不同程度的增大。乙酯类物质赋予产品果香味和奶油香味[7]，是促进腐乳风味形成的重要物质。例如，己酸乙酯具有强烈的果香和酒香香气，并且有菠萝、香蕉的香气[8]；苯乙酸乙酯具有浓烈而甜的蜂蜜香气[9]；辛酸乙酯具有白兰地酒香味。后发酵21 d的腐乳中酯类物质相对含量相比腌坯增加了13.22%，主要是由己酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯以及乳酸乙酯的含量增加引起，后发酵36 d的腐乳中酯类相对含量与后发酵21 d的相差不大，另外还检出了少量硬脂酸乙酯、十六酸乙酯、亚麻酸乙酯等长链酯类物质，这些酯类物质大多具有轻微的油脂味[10]。因此，可认为酯类物质对腐乳风味的形成做出了贡献。

对发酵食品而言，酸类物质不仅提供酸味而且还提供一定的风味，另外还是合成酯类化合物的前体物质之一[11]。腐乳发酵过程共检测9 种酸类物质，除3-甲基戊酸和2-乙基丁酸外均为脂肪酸。这些脂肪酸的相对含量都较少，随着发酵时间的延长，相对含量有一定的增大。

醛类物质包括单烯醛、二烯醛和饱和醛，多数为直链醛，主要来源于脂类氧化降解[12]。由表2可知，白坯中醛类物质相对含量为69.55%，经毛霉发酵后含量迅速降低至7.92%，后发酵阶段则呈现不断增长的趋势，后发酵36 d为16.7%。其中，白坯中正己醛含量高达51.54%，这可能与豆制品中不良风味（豆腥味）有关[13]，随着腌制与发酵的进行，其含量先降低后升高，这可能与辅料的加入以及不饱和脂肪酸的氧化有关[14]。在发酵过程中多种醛类物质的相对含量不断增多，其中包括正己醛、苯乙醛、壬醛及反-2-壬烯醛等，这些醛类能给予清香、果香和坚果香等芳香特质，且阈值较低[15]，因此对腐乳风味贡献较大。

酮类物质一般由脂肪降解、氧化或者进一步反应生成[12]。在腐乳发酵过程中酮类物质相对含量较低，且其阈值一般高于其同分异构体醛类[16]，对风味的贡献相对较小。

腐乳发酵过程中检测出的醇类物质有12 种，其中白坯中仅有3 种，毛坯中检测出7 种，这可能是由于微生物代谢产生的。异戊醇具有苹果白兰地香气和辛辣味，腌坯中其相对含量迅速增大，从7.85%增加到23.16%，这可能与辅料辣椒的加入有关。后发酵阶段，醇类物质相对含量明显降低，这可能是醇类物质酯化反应或氧化反应的结果[17]。醇类往往具有植物香、芳香和土气味，虽然其阈值较高，但是可以与有机酸形成酯类物质[18]，有利于腐乳风味的形成。

腐乳挥发性成分中还存在多种烃类物质，包括烯烃和烷烃两类。烷烃由于其香气阈值较高[19]，加之相对含量低，因此对腐乳的风味贡献较小；烯烃的阈值较低并具有特殊香气[20]，对腐乳的风味有一定贡献。检出的双戊烯具有类似柠檬的香味，从白坯到毛坯，其相对含量由6.52%降到3.2%，添加食盐、辅料腌制后相对含量增长到16.2%，随着发酵时间的延长，36 d腐乳的相对含量降至1.04%，这可能是由于其化学性质不稳定易氧化造成的。

样品中检测出的其他挥发性成分主要为呋喃类以及含硫化合物。其中2-正戊基呋喃主要来源于亚油酸或2,4-癸二烯醛的氧化，阈值较低，具有豆香和青草味；二烯丙基二硫醚、烯丙基甲基二硫醚阈值较低呈大蒜特殊气味。可以推断这些物质对腐乳的风味也有贡献。

3 结 论

本研究以白坯、毛坯、腌坯、后发酵21 d腐乳、后发酵36 d腐乳为原料，采用固相微萃取法结合气相色谱-质谱联用法检测样品挥发性风味成分，共鉴定出110 种挥发性化合物，包括酮类、醇类、酸类、酯类、醛类、烃类等化合物。豆腐白坯经毛霉发酵后，醛类化合物相对含量显著降低，醇类化合物相对含量有较大的增长，酯类化合物相对含量以及种类都有明显的增加；随着腌制及发酵时间的延长，各类化合物的种类数量变化不大，醛类、酸类、酯类化合物相对含量逐渐增大，烃类、醇类化合物相对含量逐渐降低。通过分析腐乳发酵过程挥发性成分种类及其相对含量的变化，并结合不同种类化合物阈值的大小对其整体风味的贡献进行了判断，可推测正己醛、苯乙醛、壬醛、双戊烯、异戊醇、己酸乙酯、苯乙酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、2-正戊基呋喃、烯丙基甲基二硫醚对腐乳风味的形成有较大贡献。

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