QuEChERS-高效液相色谱-质谱法检测食品中14 种真菌毒素

史 娜1,2，侯彩云1,*，路 勇2，姜 杰2，张学亮3

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；

2.北京市食品安全监控中心，北京 100041；3.北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124）

摘 要：建立QuEChERS-高效液相色谱-质谱检测食品中14 种真菌毒素的方法。均质样品用1%乙酸-乙腈提取，经分散固相萃取净化后，采用ACQUITU UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）分离。采用电喷雾电离、多反应监测方式，可同时对食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇、青霉酸、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素G2、桔青霉毒素、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、杂色曲霉毒素、HT-2毒素、T-2毒素、鬼臼毒素14 种真菌毒素进行定性和定量分析。最低检出限为0.5～1 μg/kg。该方法简便快速、选择性佳、灵敏度高，适用于食品安全事件分析中真菌毒素的分析。

关键词：真菌毒素；QuEChERS；高效液相色谱-质谱；筛选；食品

Simultaneous Screening for 14 Mycotoxin Contaminants in Foods by QuEChERS-LC-MS-MS

SHI Na1,2, HOU Cai-yun1,*, LU Yong2, JIANG Jie2, ZHANG Xue-liang3

(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China;
2. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring, Beijing 100041, China;

3. College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)

Abstract: This paper presents a QuEChERS-liquid chromatography-tandem mass chromatography (LC-MS-MS) method for the simultaneous screening for 14 mycotoxin contaminants (deoxynivalenol, penicillic acid, aflatoxin M1, aflatoxin G2, citrinin, aflatoxin B1, aflatoxin B2, aflatoxin G1, zearalenone, ochratoxin A, sterigmatocystin, HT-2 toxin, T-2 toxin and podophyllotoxin) in foods. The homogenized samples were extracted with 1% acetic acid in acetonitrile. The separation was performed on an ACQUITU UPLC BEH C18 column (2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) by gradient elution after purification by dispersive-solid-phase extraction (d-SPE). The 14 mycotoxin contaminants in foods analyzed by LC-MS-MS-ESI in the positive ionization, multiple-reaction monitoring (MRM) mode. The minimum detection limit was 0.5–1 μg/kg. The developed method proved to be simple, rapid, highly selective and sensitive, and suitable for the analysis of mycotoxin contaminants in food safety incidents.

Key words: mycotoxin contaminants; QuEChERS; liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS); screening; food

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）16-0190-07

doi:10.7506/spkx1002-6630-201416037

真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，是有毒的二级代谢产物，目前已知的真菌毒素有200多种，按其主要产毒菌种可分为曲霉菌毒素（如黄曲霉毒素、棕曲霉毒素等）、青霉菌毒素和镰刀菌毒素（如T-2毒素、HT-2毒素、二乙酰藨镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等）等几大类。人或动物摄入被真菌毒素污染的食物可引发多种中毒症状，严重危害人类的身体健康。据调查，除饲料和粮食外，在花生、烘焙食品、水果和果汁、蔬菜等人们常食用的食物中都发现了有真菌污染的现象。因此，控制真菌毒素对于生产效益、动物福利、产品质量和食品安全都是至关重要的[1-4]。

对于食品中真菌毒素的检测方法很多[1,5]，薄层层析法虽然简便，但精确度低、操作过程复杂、分析结果的可重复性和再现性差；免疫化学检测法通常具有高的选择性和很低的检出限，广泛用于各种抗原、半抗或抗体的测定，一般可分为荧光免疫法、发光免疫法、免疫法及电化学免疫法等非放射免疫法和放射免疫法[6-10]；色谱法主要包括薄层色谱、气相色谱、液相色谱、液相色谱-质谱联用等。真菌毒素大部分是热不稳定的，因此气相色谱法只应用于个别真菌毒素的检测[11-13] ；高效液相色谱法灵敏度高、稳定性好，但是对于同分异构体和同系物就无法进行多组分析；液相色谱-质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS-MS）法[14]的优点非常显著，LC与高选择性、高灵敏度的MS-MS结合，可对复杂样品进行实时分析，即使在LC难分离的情况下，只要通过MS1及MS2对目标化合物进行中性碎片扫描，则可发现并突出混和物中的目标化合物，显著提高信噪比，LC-MS-MS技术在食品中毒物分析中显示出越来越广阔的应用前景。目前国内对多种真菌毒素同时检测多采用免疫亲和柱、凝胶色谱等进行净化处理[15-17]，对于采用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）进行净化处理的文献鲜有发表。

QuEChERS是由美国化学家Lehotay和德国的Anastassiadas于2003年提出的一种快速、简便、便宜、有效、可靠及安全的样品处理技术[18]，最早在农药多残留中使用[19-20]。本实验采用先进的QuEChERS技术进行样品处理，通过优化样品前处理条件及色谱-质谱条件，建立了多反应离子模式分别测定14 种真菌毒素的新方法。本方法可为处理食品安全事件中真菌毒素的筛选提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱氧雪腐镰刀烯醇、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素G2、桔青霉毒素、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、鬼臼毒素（均为规格1 mg、纯度98%） 美国TRC公司；杂色曲霉毒素、HT-2毒素、T-2毒素、青霉酸（均为规格1 mg、纯度99%） 美国Sigma公司，用甲醇溶液将标准样品配制成100 μg/mL标准储备液。甲醇、乙酸铵、甲酸 United States Dikma Dikmapure公司；实验室用水符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》中二级水的规定。

1.2 仪器与设备

TQ-S超高效液相色谱-四极杆质谱联用仪、DisQuE基质固相分散样品制备试剂盒、DisQuE提取管（1 支50 mL体积的离心管，内装4 g硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸三钠和二水结晶盐以及0.5 g的柠檬酸氢二钠合一个半水结晶盐）、高速冷冻离心机 美国Waters公司；Milli-Q纯水仪 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；流动相：0.1%甲酸（B）和乙腈（A），洗脱条件见表1。

表 1 液相色谱梯度洗脱条件

Table 1 HPLC Gradient elution conditions

1.3.2 质谱条件

表 2 MRM所用的母/子离子

Table 2 Precursor/daughter ions used in multiple-reaction
monitoring (MRM) mode

电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源，正离子扫描，多反应监测（multi-reaction monitoring，MRM）；毛细管电压2.5 kV；离子源温度900 ℃；脱溶剂气温度600 ℃；锥孔气流速150 L/h；脱溶剂气流速1 000 L/h，14 种化合物的质谱分析参数见表2，总离子流图见图1，MRM色谱图见图2。

图 1 14 种药物的TIC色谱图

Fig.1 TIC chromatograms of 14 mycotoxins

A.鬼白毒素

B.T-2毒素

C.青霉酸

D.脱氧雪腐镰刀菌烯醇

E.黄曲霉毒素G2

F.黄曲霉毒素M1

G.黄曲霉毒素B1

H.桔青霉毒素

I.黄曲霉毒素G1

J.黄曲霉毒素B2

K.赭曲霉毒素A

L.玉米赤霉烯酮

M.HT-2毒素

N.杂色曲霉毒素

图 2 14 种药物的多反应监测色谱图

Fig.2 MRM chromatograms of 14 mycotoxins

1.3.3 样品前处理方法

粉碎样品后精密称取4.000 g于50 mL DisQuE提取管中，加入16 mL 1%的乙酸-乙腈。涡旋振荡5 min至充分混匀，超声5 min，10 000 r/min离心10 min。吸取8.0 mL上述乙腈提取液至15 mL DisQuE清除管中，涡旋振荡30 s，10 000 r/min离心5 min。吸取4.0 mL上述提取液至旋蒸瓶中，旋蒸至近干，用乙腈-0.1%甲酸溶液（5∶95）定容至1 mL，涡旋使其充分溶解，过有机膜后待进样分析。

1.3.4 标准工作曲线的制备

将14 种标准样品分别用甲醇配制成100 μg/mL的标准储备液，保存期限为半年。做实验时现配1 μg/mL混合标准液（分别吸取14 种标准储备液10 μL，用甲醇定容至10 mL），然后在逐级稀释成需要的质量浓度。采用高效液相色谱-质谱进行测定，以质量浓度X为横坐标、峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的优化

由于不同样品基质性质相差较远，如果要快速同时筛查出多种真菌毒素，就要将提取效率提高的同时还要把不同样品中目标化合物损失降到最小。因此，食品中有毒化合物的前处理方法的关键是选择提取效率好的提取溶剂和净化好的净化方法，减少目标化合物在不同样品前处理过程中的损失。

2.1.1 提取溶剂的选择

考察不同提取剂在豆制品、面制品、牛奶样品中的真菌毒素的的提取效果，发现甲醇、无水乙醇、丙酮对部分化合物的回收率影响很大。用1%乙酸-乙腈提取所有目标物的回收率基本可以满足分析要求，回收率为65.3%～130.1%，且干扰较少，因此选择乙腈作为提取剂。

2.1.2 净化条件的优化

实验过程中发现直接用提取剂提取时，基质效应比较强，导致色谱峰不好，而且同时对色谱柱和仪器的损坏较大。基质固相分散是一种新的提取净化技术，可以将样品的分散、萃取及净化一次完成，省时省力，操作方便，对色谱柱和仪器起到了很好的保护作用。因此选为本研究的样品处理方法。

同时对DisQuE基质分散样品制备试剂盒里两种不同的提取管A和B做了比较。其中，DisQuE基质固相分散样品制备试剂盒（DisQuE提取管A：1支50 mL离心管，内装1.5 g无水乙酸钠和6 g无水硫酸镁。DisQuE净化管：15 mL管内有 900 mg无水硫酸镁和150 mg PSA的硅胶基伯胺仲胺键合相吸附剂；DisQuE提取管B：1支50 mL离心管，内装4 g硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸三钠和二水结晶盐、以及0.5 g的柠檬酸氢二钠合一个半水结晶盐）。比较结果见表3，发现使用DisQuE提取管B的多数回收率稍高，因此选用DisQuE提取管B提取目标物。

表 3 DisQuE提取管的毒素种类比较

Table 3 Comparison of different extraction tubes

注：数据为毒素种类数。

2.1.3 样品浓缩方式的选择

实验过程中在对样品的有机氮吹和旋转蒸发两种常见的浓缩方式进行了探究，结果发现氮吹导致样品损失比较大，耗时比较长，耗费氮气比较多，且提取液直接到大气中对身体和环境的负面影响较大，因此实验选择了旋转蒸发的方式进行浓缩。

2.1.4 样品过滤器的选择

样品经溶剂提取浓缩后，可能存在一些残渣或杂质，容易导致液相色谱柱堵塞，同时也会污染串联四极杆质谱，影响筛查结果也会损伤仪器，因此需要使用过滤器对样品进行净化。实验室常用的过滤器主要有聚醚砜、尼龙和聚四氟乙烯。聚醚砜过滤器主要是用于过滤水系样品，实验考察了尼龙和聚四氟乙烯过滤器对目标化合物的吸附作用。实验考察发现，聚四氟乙烯过滤器对药物的吸附作用不大，因此采用聚四氟乙烯过滤器对样品进行净化。

2.2 色谱与质谱条件的优化

2.2.1 流动相的选择

实验对流动相的选择考察水-甲醇、乙酸胺-甲醇、水-乙腈、乙酸胺-乙腈、甲酸溶液-乙腈由于14 种毒素采用电喷雾正电离模式采集，结果表明0.1%的甲酸溶液-乙腈的整体分离效果比较好，因此，选择0.1%甲酸溶液-乙腈作为流动相，进行梯度洗脱，在7 min内对14 种毒素进行分离。

2.2.2 质谱条件的选择

对研究的14 种毒素的化学结构进行研究和相关文献资料表明电喷雾正离子模式扫描就可以满足实验研究的需求。因此，选择电喷雾正离子模式扫描。

2.3 方法的验证

2.3.1 标准曲线和检出限

根据14 种化合物的响应强弱，配制不同质量浓度的混合标准溶液标准曲线。以峰面积对样品的浓度进行线性回归，结果表明在0.5～20 μg/L质量浓度范围内具有良好的线行关系（表4）。在定量下限附近添加一系列低质量浓度的样品，以信噪比大于等于3（RSN≥3）的最低质量浓度为最低检出限，实验得出检出限为0.5～1 μg/kg。

表 4 14 种化合物标准溶液通过LC-MS-MS分析所得曲线

Table 4 LC-MS-MS analytic curves of 14 standard solutions

2.3.2 方法回收率和精密度

表 5 14 种化合物的回收率和相对标准偏差

Table 5 Average recoveries and relative standard deviations of 14 compounds

分别取豆制品、面粉、牛奶制品空白食品样品（均为实验室已有阴性样本），添加低、中、高3个水平的14 种化合物混合标准溶液，进行前处理，测定目标化合物。每个水平进行6 次实验，结果见表5，14 种化合物的平均回收率为65.3%～130.1%，相对标准偏差为0.56%～11.40%。

3 结 论

本研究通过对样品前处理方法、提取剂和LC-MS-MS条件优化，建立了一套可以同时检测豆制品（如豆腐干）、面粉（如玉米面）、牛奶制品（如奶粉）中真菌毒素的筛查方法。本方法利用基质固相分散样品制备试剂盒，采用乙腈提取，得到了较好的提取效果。同时利用定性定量离子对进行确证，通过MRM进行信号采集，空白样品加标回收实验得到了较高且稳定的回收率。该方法快速、简便、灵敏、准确，适用样品基质范围广，尤其适合食品安全突发事件的快速应急处置工作。

对于本实验研究的方法，已经多次成功应用于北京市食品安全突发事件处理中，并且取了很好的效果，在食品安全监管工作中的技术支撑作用，切实为首都食品安全保驾护航。

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