超高效合相色谱法直接检测VC方法

刘倩倩1，周 围1,2,3,*，王 波2，王丽婷3，杨盛鑫3

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃出入境检验检疫局综合技术中心，

甘肃 兰州 730000；3.西北师范大学地理与环境科学学院，甘肃 兰州 730070）

摘 要：建立超高效合相色谱法分离和测定VC的方法。超高效合相色谱技术集合超临界流体色谱和超高效液相色谱的技术优点，流动相以CO2为主体，甲醇（含0.05% H3PO4）为助溶剂。选用Waters CSH Fluoro-Phenyl（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱，流速0.6 mL/min，检测波长为245 nm，方法检出限为1.5 mg/kg，线性范围为5～200 mg/L；加标回收率范围为96.05%～101.15%；相对标准偏差为0.52%～0.76%，具有高效、检测速度快、操作简单、灵敏度高、检出限低、重复性好、实验成本低等优点。

关键词：超高效合相色谱；VC；测定；食品

Direct Determination of Vitamin C by Ultra Performance Convergence Chromatography

LIU Qian-qian1, ZHOU Wei1,2,3,*, WANG Bo2, WANG Li-ting3, YANG Sheng-xin3

(1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;

2. Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 730000, China;

3. College of Geography and Environment Science, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China)

Abstract: A new method was developed for the determination of vitamin C in foods by ultra performance convergence chromatography (UPC2). The mobile phase was a mixture of supercritical CO2 and methanol (containing 0.05% H3PO4) at a flow rate of 0.6 mL/min. A Waters CSH Fluoro-Phenyl column (3.0 mm × 100 mm, 1.7 μm) was used, and the UV detector was set at 245 nm. The limit of detection (LOD) was 1.5 mg/kg, and the calibration linear range was between 5 and 200 mg/L.
The spiked recoveries of vitamin C were 96.05%–101.15%, with relative standard deviation (RSD) ranging from 0.52% to 0.76%. The method is efficient, rapid, simple, sensitive, accurate, repeatable and low-cost with a low limit of detection. It can be applied for the determination of vitamin C in foods.

Key words: ultra performance convergence chromatography (UPC2); vitamin C; determination; food

中图分类号：TS201.6 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）16-0208-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201416040

VC又叫L-抗坏血酸，属于水溶性维生素，具有较强的还原作用，参与体内氧化还原反应，是维持人体正常生理代谢不可缺少的一类有机化合物[1]。医学研究还发现它不但具有生理活性，而且在人体内能够阻止亚硝胺的形成，具有一定的防癌作用，增加机体对传染病的抵抗力，对肝炎、肝硬变有疗效[2-6]。同时又是一种理想的食品抗氧化剂。但是人体本身不能合成，必须依靠膳食供给，VC广泛存在于新鲜的水果、蔬菜中[7-9]。因此建立准确测定VC含量的方法有着非常重要的现实意义。

VC测定的方法一般有碘量法[10]、比色法[11]、电位法[12]、紫外分光光度法[13]、荧光法[14]等，这些方法选择性较差，容易受其他还原性成分、丙酮酸和糖等成分的干扰，所需试剂较多、操作繁琐[15]。近年来高效液相色谱法发展迅速，它具有高效、快速等特点，但是在实验过程中有机溶剂耗费多，实验成本较高，并对环境或多或少造成一定的污染。众多文献均在传统的反相液相色谱中对VC进行分离分析，由于VC本身具有较高极性而导致保留时间较短，严重影响到VC的准确定量。采用超高效合相色谱法对VC进行直接检测的方法却鲜有报道，超高效合相色谱除了具有传统超高效液相色谱所具有的优点外，还与超临界流体色谱技术进行结合，以超临界流体CO2为流动相主体，依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱过程[16-17]。加之亚2 μm填料技术，能够通过精确地调节流动相强度、压力和温度，获得所需的系统分辨率和选择性，对待测物的保留和分离进行有效调控，具有操作温度低，有机溶剂使用量少、灵敏度高、重复性好、分析速度快等优点[18-21]。超临界流体是指物质高于其临界温度和临界压力时的一种物态，它既不是气体，也不是液体，但它兼有气体的低黏度、液体的高密度、以及介于气液体之间的扩散系数的特征[22]。VC在紫外波长245 nm处有特异性吸收峰，样品经均质、稀释、过膜后，直接检测食品中的VC，可通过保留时间定性，峰面积定量。本实验通过系统考察超高效合相色谱对VC分离的影响因素，为准确检测VC建立一种可靠、快速、节约型的分离分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜橘子、鲜枣、干枣、饮料（水溶C100） 市购。

VC（纯度99%） 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司 ；CO2（纯度99.997%） 兰州汇能公司；甲醇、乙腈、异丙醇（色谱纯） 德国Merck KGaA公司；H3PO4（色谱纯） 天津科密欧公司；蒸馏水 广州屈臣氏。

1.2 仪器与试剂

超高效合相色谱仪（配有Waters EmpowerTM 3数据处理系统） 美国Waters公司；冷冻离心机 美国Sigma公司；均质机 德国IKA公司；移液枪 美国Thermo Electron公司；50 mL聚乙烯管、容量瓶。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

标准贮备液：精确称取0.020 g VC，用含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液，准确定容至100 mL容量瓶中，配制成200 mg/L的标准储备液，4 ℃冷藏待用（4 h后重新配制）。

标准工作液：准确转移1 000、750、500、250、100、50、25 μL标准贮备液分别稀释为200、150、100、50、20、10、5 mg/L的标准工作液，4 ℃冷藏待用（4 h后重新配制）。

1.3.2 超高效合相色谱条件

色谱柱：Waters CSH Fluoro-Phenyl（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：A为CO2，B为甲醇（含0.05% H3PO4溶液）；流速0.6 mL/min；进样量1 μL；柱温30 ℃；检测波长245 nm；动态背压2 000 psi；梯度洗脱：0～0.2 min时8%甲醇，3 min时甲醇8%～35%，4.3 min时甲醇35%～8%。

1.3.3 样品处理

固体及半固体样品：分别准确称取样品5.00 g于50 mL聚乙烯管中，加入15 g含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液后，均质5 min，高速冷冻离心机于4 ℃条件下以13 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL（VC含量较高时可适当进行稀释），经0.22 μm滤膜过滤后，直接进样分离分析。

液体样品：准确称取2.00 g饮料于50 mL聚乙烯管中，加入含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液至20 g，置于高速冷冻离心机于4 ℃以13 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，直接进样分离分析。

2 结果与分析

2.1 流速的选择

超临界CO2作为流动相时，由于具有的低黏度和高的扩散系数，使它在分离过程中具有较高的线速度，分析速度比传统高效液相色谱快3～10 倍，分析时间更短，同样，在此情况下，超临界流体色谱可以使用更长的色谱柱，得到更大的柱效及分离效率。

本实验通过使用超高效合相色谱，对亚2 μm填料的色谱柱进行流速优化，流速在0.4～1.0 mL/min范围内进行优化，为了保证较好的灵敏度、色谱柱压力以及尽可能与杂质的分离，本实验选择0.6mL/min为最佳流速。VC标准色谱图见图1。

图 1 VC标准色谱图

Fig.1 Chromatogram of vitamin C

2.2 助溶剂选择

由于超高效合相色谱流动相主要是以CO2为主体的超临界流体，为了调整流动相的极性以及对目标物的溶解性，可加入甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、乙酸乙酯等助溶剂，以适应对不同目标化合物的不同溶解性，有效改变目标化合物的峰形及保留时间。本实验通过使用甲醇、异丙醇、乙腈3 种常用的、不同极性的助溶剂对VC进行分离，分别见图2。

A.助溶剂为甲醇（无磷酸）

B.助溶剂为异丙醇

C.助溶剂为乙腈

图 2 不同助溶剂分离的VC标准品的色谱图

Fig.2 Chromatograms of vitamin C separated with different co-solvents

由图2可以看出，随着助溶剂极性的降低，流动相的溶解能力也相应得到改变，使得VC的出峰时间很大程度的推迟，甚至在使用乙腈为助溶剂时，VC因为保留太强而没有出峰，因此，可以推断出助溶剂的选择对于目标化合物的峰形及保留时间起着至关重要的作用。

2.3 改性剂的选择

由于VC为弱酸性、水溶性维生素，在酸性条件下可以适当改善维生素的峰形，故在流动相中加入少量的磷酸作为改性剂，实验选择0.05% H3PO4、0.1% H3PO4、0.15% H3PO4作为改性剂，结果发现3 种不同水平梯度的磷酸-甲醇溶液均对VC的拖尾峰形有较好的改善，VC标准色谱图和未添加改性剂的色谱图见图1、图2A。鉴于流动相酸性较高，长时间使用时会损伤色谱柱、降低柱效，故将0.05% H3PO4作为流动相的改性剂。

2.4 动态背压的选择

超高效合相色谱中，动态背压是影响分离过程的重要因素之一。它主要作用是控制CO2在整个操作过程中维持超临界状态，当背压升高时，超临界流体密度会增大，溶剂化能力增强，柱压升高。本实验以CO2和甲醇（含0.05% H3PO4）为流动相，考察背压在1 800～2 200 psi范围内对样品分离的影响。结果表明，背压越大，密度、黏度随之增加，柱压也会升高，使得目标物色谱峰的保留时间减少。通过对样品基质、保留时间及色谱柱压力的综合考虑，当背压为2 000 psi时，VC与杂质分离最好，时间最短、峰形对称，故选择背压为2 000 psi。

2.5 色谱柱温度选择

为了对样品中VC得到更好的分离效果，保持其他色谱条件不变，本实验还考察柱温在25～55 ℃范围内对分离的影响。结果表明，随着温度的升高，VC的保留时间逐渐延长，这与传统超高效液相色谱是不相同的。这是因为色谱柱温度越高，超临界流体密度越小，溶剂化能力降低，超临界流体可能对VC溶解及交换能力减弱，使得VC的保留时间增大。另外，考虑到色谱柱温度较高时，会加速VC的氧化分解，故本实验选择温度30 ℃为最佳分离温度。

2.6 方法考察

2.6.1 线性范围和灵敏度

在优化实验条件下，选取200、150、100、50、20、10、5mg/L的VC系列标准溶液按1.3.2节色谱条件进行测定，绘制样品水平（横坐标x，mg/L）与峰面积（纵坐标y，μU/s）标准曲线，进行线性回归。结果表明，该方法在5～200 mg/L范围内有较好的线性关系，线性方程为Y=3.13×103X－2.66×103，线性相关系数R2=0.998 9。该方法对VC的检出限为1.5 mg/kg，定量限为5 mg/kg。

2.6.2 回收率和精密度

分别准确称取5.00 g橘子和2.00 g饮料样品，加入3 个水平的添加量（5、50 mg/kg和200 mg/kg）的VC，置于50 mL聚乙烯管中，加入15 g含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液后，均质5 min，高速冷冻离心机于4 ℃条件下以13 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，按1.3.2节色谱条件进样测定，计算其回收率。结果表明，该方法的加标回收率在96.05%～101.15%之间，相对标准偏差为0.52%～0.76%。方法的回收率和重复性均较好。

2.7 实际样品测定

利用上述实验优化条件，分别称取橘子、饮料、鲜枣、干枣各5.00 g，置于50 mL聚乙烯管中，加入15 g含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液后，经均质、离心后，取上清液1 mL过膜，按1.3.2节色谱条件进样测定，见图3，结果表明，橘子、饮料、鲜枣、干枣中VC含量分别为184.35、324.78、2 163.62、20.12 mg/kg。该测试方法可以对含VC的食品，无需进行复杂前处理，直接进样、直接检测。本方法完全能够满足VC的检测。

A.橘子

B.饮料

C.鲜枣

D.干枣

图 3 样品测定色谱图

Fig.3 Chromatograms of samples

3 结 论

利用超高效合相色谱对VC进行检测，整个前处理过程简单、分析时间短、结果可靠，有效避免VC在长时间、复杂、繁琐的前处理及检测过程中的损失，很大程度的提高了食品中VC检测的准确性。由于流动相为CO2超临界流体，对环境几乎不造成污染，运行成本低。本实验通过超高效合相色谱法对VC检测的研究可以看出，超高效合相色谱将对未来的色谱分析提供新的方向。

参考文献：

[1] 杨建洲, 张荣莉. 毛细管区带电泳分析果蔬中的维生素C含量[J]. 分析化学, 2002, 30(1): 120.

[2] 成志强, 孙成均, 黎源倩. 反相高效液相色谱法同时测定食品和多维片中8种水溶性维生素[J]. 分析化学, 2001, 29(9): 1068-1071.

[3] 高志杰, 李静涛, 饶小思. 高效液相色谱-二极管阵列检测器法测定饮料中维生素C的研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2006, 16(4): 446-447.

[4] 桑宏庆, 王丽, 柯林俊. 采用褪色光度法测定维生素C[J]. 饮料工业, 2010, 13(11): 79-82.

[5] 陈再洁, 郑建明, 王智. 高效液相色谱法测定维生素C片中VC含量[J]. 分析仪器, 2008(6): 37-39.

[6] 胡应杰, 潘康标, 陈昌云, 等. 高效液相色谱法测定辣椒中维生素C的含量[J]. 南京晓庄学院学报, 2008, 11(6): 30-32.

[7] 魏峰, 计双芝, 彭铁军. 维生素C的高效液相色谱检测方法研究[J]. 黄山学院学报, 2010, 12(5): 47-49.

[8] 高申. 食品中维生素C含量的测定[J]. 天津化工, 2002(4): 39-40.

[9] 崔容, 李皎, 王洪伟. 水溶性维生素的高效液相色谱测定方法的研究[J]. 中国卫生检验杂质, 2005, 15(1): 55-57.

[10] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 二部[M]. 北京: 化学工业出版社, 2005: 669.

[11] 杨宇民, 沈毅. 催化分光光度法测定生物样品中维生素C[J]. 中国卫生检验杂志, 2000, 10(5): 566-567.

[12] 陈秋丽, 甘振威, 张娅婕, 等. 电位滴定法测定深色蔬菜和水果中的维生素C[J]. 吉林大学学报, 2004, 30(5): 821-822.

[13] 冰冰, 周晓光, 朱泮民. 紫外光度法测定药品中抗坏血酸的研究[J]. 光谱实验室, 2005, 22(1): 152-153.

[14] 曾美云, 邱海鸥, 郑洪涛, 等. 动力学荧光法测定抗坏血酸[J]. 分析试验室, 2008, 27(1): 16-18.

[15] 郝学宁, 郝嫱嫱, 刘雪莲. HPLC法测定果蔬中维生素C[J]. 现代农业科技, 2011(3): 30-31.

[16] 徐永威, 孙庆龙, 黄静, 等. 沃特世超高效合相色谱[J]. 分析化学, 2012, 40(5): 674.

[17] 徐永威, 孙庆龙, 黄静, 等. Waters ACQUITY UPC2仪器结构和性能特点[J]. 现代仪器, 2012, 18(5): 45-48.

[18] GOURMEL C, GRAND-GUILLAUME PERRENOUD A, WALLER L, et al. Evaluation and comparison of various separation techniques for the analysis of closely-related compounds of pharmaceutical interest[J]. Journal of Chromatography A, 2013, 1282: 172-177.

[19] GRAND-GUILLAUME PERRENOUD A, VEUTJEY J L, GUILLARME D. Comparison of ultra-high performance supercritical fluid chromatography and ultra-high performance liquid chromatography for the analysis of pharmaceutical compounds[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1266: 158-167.

[20] GRAND-GUILLAUME PERRENOUD A, BOCCARD J, VEUTJEY J L, et al. Analysis of basic compounds by supercritical fluid chromatography: attempts to improve peak shape and maintain mass spectrometry compatibility[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1262: 205-213.

[21] 徐永威, 孙庆龙, 黄静, 等. 沃特世超高效合相色谱系统: ACQUITY UPC2[J]. 现代科学仪器, 2012, 10(5): 153.

[22] BERRY A J, GAMES D E, PERKINS J R. Supercritical fluid chromatographic and supercritical fluid chromatographic-mass spectrometric studies of some polar compounds[J]. Journal of Chromatography A, 1986, 363(3): 147-158.