利用核磁共振法定量分析植物油中
多种脂肪酸及水含量

李添宝，吴 越，罗 敬

（湖南师范大学化学与化工学院，湖南 长沙 410081）

摘 要：采用核磁共振波谱分析技术，归属了植物油中亚麻酸、亚油酸、油酸等不饱和脂肪酸甘油酯、饱和脂肪酸甘油酯及水的核磁共振质子谱的主要特征峰。在无需预处理条件下，以苯甲酸作为内标，对植物油中各种脂肪酸及水进行定量分析，加标回收率可达98%～102%。亚麻酸、亚油酸、油酸、总饱和脂肪酸、水的精密度分别为0.11%、0.12%、0.68%、0.70%、2.65%。该法取样量少、无需昂贵的标样，可直接快速定量，结果准确，可为植物油的质量标准研究提供一种简单可行的新方法。

关键词：核磁共振；不饱和脂肪酸；饱和脂肪酸；水

Quantitative Analysis of Fatty Acids and Water in Vegetable Oils by Nuclear Magnetic Resonance

LI Tian-bao, WU Yue, LUO Jing

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Normal Uinversity, Changsha 410081, China)

Abstract: The main characteristic peaks of linolenic, linoleic, oleic acid, saturated fatty acids and water in vegetable oils were analyzed by 1H-NMR spectroscopy. Benzoic acid was selected as an internal standard to quantify the contents of linolenic, linoleic, oleic acid, saturated fatty acids and water in vegetable oils by this method without any pretreatment. The recoveries were 98%–102% with RSD of 0.11%, 0.12%, 0.68%, 0.70% and 2.65% for linolenic, linoleic, oleic acid, total saturated fatty acids and water, respectively. The contents of linolenic, linoleic, oleic acid, total saturated fatty acids and water can be determined directly and accurately with less sample consumption and without using expensive standards. This new method is simple and applicable for studying quality standards for vegetable oils.

Key words: nuclear magnetic resonance (NMR); unsaturated fatty acid; saturated fatty acids; water

中图分类号：O65 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）16-0212-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201416041

市场上常见的植物油主要是由多种不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸混合脂肪酸的甘油酯组成，在测定植物油里各脂肪酸含量的方法中，最常用的方法有气相色谱法[1-4]，气相色谱-质谱联用法[5-8]，但这些方法存在许多问题，比如：测定之前繁琐的甲酯化预处理，长链碳的酯不容易气化，不饱和脂肪酸酯的热不稳定性，绘制标准曲线的复杂，标准样品的昂贵等，这些都造成了在检测食用油中脂肪酸时步骤繁多，样品用量大，耗时长，结果也不一定准确。

目前，利用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）定量分析植物油中亚麻酸、亚油酸、油酸等不饱和脂肪酸、总饱和脂肪酸以及水含量的方法研究很少[9-15]。本实验通过核磁共振技术，在对原料无需任何预处理的情况下，通过分析各种植物油的1H-NMR谱，归属了植物油中亚麻酸、亚油酸、油酸等不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸以及水等的质子特征峰，并且以苯甲酸为内标，测定了以上各种物质的含量及方法的精密度，通过加标回收率验证方法的准确性。同时增加对比实验，利用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪检测各种植物油，通过面积归一化法测出各植物油中亚麻酸、亚油酸、油酸和饱和脂肪酸的含量，也验证了该方法准确可靠。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

9 种常见植物油（紫苏籽油、芝麻油、大豆油、菜籽油、橄榄油、玉米油、花生油、茶油、葵花籽油）、氘代氯仿 青岛腾龙微波科技有限公司；苯甲酸 成都化学试剂厂；油酸甲酯 美国Sigma公司；无水乙醇、甲醇、苯（均为分析纯） 湖南师范大学化学试剂厂；无水Na2SO4（分析纯） 上海山浦化工有限公司；石油醚（60～90 ℃、分析纯）、KOH（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；NaHSO4（自制）。

1.2 仪器与设备

AVANCE 500 MHz超导傅里叶变换核磁共振仪 瑞士
Brüker公司；5 mm核磁共振样品管、电子分析天平、GC/MS-QP2010气质联用仪 日本岛津公司；电热干
燥箱 武汉市无线电元件厂；恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；电子调温电热套 天津市泰斯特仪器有限公司；自动双重纯水蒸馏器 上海亚太技术玻璃公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的1H-NMR测定

由于市场上无法购买到纯的三亚麻酸甘油酯、三亚油酸甘油酯、三油酸甘油酯标准样品，但亚麻酸甲酯、亚油酸甲酯和油酸甲酯与其对应的脂肪酸甘油酯化学位移基本相同，故实验选取了油酸甲酯标样、以及自制的亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯样品对各种不饱和脂肪酸甘油酯的质子峰进行了归属。

称取约70 mg植物油至5 mm的核磁共振样品管中，再加入约0.6 mL氘代氯仿，用于绘制植物油的核磁谱图。

将制好的样品充分振摇，每次测定都进行调谐、匀场；测定条件控制在：温度297.3 K；500 MHz核磁共振仪的频率500.13 MHz；氢谱谱宽10 330.578 Hz；扫描16 次；空扫2 次；每个核磁样品管测量6 次；谱图处理时以四甲基硅烷定位。

1.3.2 各种脂肪酸及水的含量测定

分别称取约70 mg 9 种植物油，分别添加约18 mg苯甲酸，充分摇匀后待测。

1.3.3 回收率测定

实验采用油酸甲酯标准品作为内标的添加物来测定方法的回收率。

选取其中1 种食用油（大豆油），称取约70 mg，添加约28～78 mg油酸甲酯标准样品，约18 mg苯甲酸作为内标，充分摇匀后待测。

1.3.4 精密度测定

选取其中1 种食用油（大豆油），称取约70 mg，添加约18 mg苯甲酸，充分摇匀后测量6 次。

1.3.5 利用GC-MS测定植物油中各种脂肪酸的含量

取食用油10 g于平底烧瓶中，加入0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液；于60 ℃恒温磁力搅拌器中搅拌回流1 h，至溶液澄清；待冷却到室温后加入NaHSO4溶液，调至pH值为2～3；溶液分层，用分液漏斗分出上层油相。

将上层油相物转移到三颈烧瓶中，加入2 g NaHSO4固体，少量水将其溶解，2 mL苯，20 mL甲醇；三颈瓶口分别装上温度计、分水器，磨口塞；然后将三颈瓶放置恒温磁力搅拌器上加热搅拌，保持反应物微沸，加热回流1 h，直到分水器中水液面不再上升即可；将生成物冷却至室温后转移到分液漏斗中，蒸馏水洗涤5～6 次，石油醚萃取上层油相，用无水Na2SO4干燥，过滤后放入烘箱中烘干溶剂，得到混合脂肪酸甲酯；最后进行GC-MS检测得到总离子流图。

色谱柱：Rtx-wax 弹性石英毛细管柱；升温程序：柱温100 ℃；进样口温度250 ℃；初始温度100 ℃保持1min，以15 ℃/min升到175 ℃保持12 min；再以2 ℃/min
升到245 ℃保持2 min；离子源温度250 ℃；进样量0.5 mL；不分流；柱前压67.9 kPa；质量扫描范围33～500 u；溶剂延迟时间3.5 min。

2 结果与分析

2.1 脂肪酸甘油酯1H-NMR谱特征峰的确认

植物油中不饱和脂肪酸甘油酯主要成分为亚麻酸、亚油酸、油酸和饱和脂肪酸混合脂肪酸的甘油酯，对应结构和化学位移（图1）。

图 1 脂肪酸甘油酯结构及化学位移

Fig.1 Structures and chemical shifts of fatty acids

其中脂肪酸部分按照从左到右依次给氢原子号为1～8，化学位移相同的H编号一致，由于1 mol甘油醇只能结合3 mol脂肪酸，故图中总饱和脂肪酸结构未画出，但其化学位移类似，只有2.25、1.60、1.29、0.854组峰。以紫苏籽油为例，来确认其1H-NMR谱中各脂肪酸的特征峰（图2）。

图 2 紫苏籽油的1H-NMR谱

Fig.2 1H-NMR spectrum of perilla seed oil

紫苏籽油中从高场到低场分别为：δ=5.32归属为所有脂肪酸中双键上的5号H；δ=5.30为甘油醇上次甲基的H；δ=4.29和δ=4.14归属为甘油醇上亚甲基的2 个H；δ=2.78归属为亚油酸和亚麻酸上位于2 个—C＝C双键之间的亚甲基6号H；δ=2.25归属为和—C＝O直接相连的亚甲基上的1号H；δ=2.02归属为与—C＝C双键相邻的亚甲基上的4号H；δ=1.60归属为与—C＝O相隔一个—CH2的亚甲基上的2号H，其油中微量水的质子峰也在该处；δ=1.29为—CH2上的3号H；因为受到双键个数的影响，δ=0.96归属为亚麻酸末端—CH3上的7 H，而δ=0.85为其余的脂肪酸末端—CH3上的8号H[16]。

芝麻油、大豆油、菜籽油、橄榄油、玉米油、花生油、茶油、葵花籽油1H-NMR图谱见图3。

A.芝麻油

B.大豆油

C.菜籽油

D.橄榄油

E.玉米油

F.花生油

G.茶油

H.葵花籽油

图 3 8 种植物油的1H-NMR谱

Fig.3 1H-NMR spectra of eight kinds of vegetable oils

2.2 脂肪酸及水含量的计算

利用吸收峰面积与氢质子数成正比，通过加入苯甲酸作为内标能准确算出亚麻酸、亚油酸、油酸、饱和脂肪酸及水的含量。根据上述对各质子峰的归属，可以看出δ=0.96的7号H的为亚麻酸末端—CH3的特征峰；δ=2.78的6号H包含了亚油酸和亚麻酸；δ=5.32的5号H包含了油酸、亚油酸和亚麻酸。

按公式（1）计算亚麻酸的峰面积：

A亚麻酸=A7号H积分值 （1）

按公式（2）计算亚油酸的峰面积：

A亚油酸=A6号H积分值－A亚麻酸×4/3 （2）

按公式（3）计算油酸的峰面积：

A油酸=A5号H积分值－A亚麻酸×2－A亚油酸×2 （3）

按公式（4）计算所含水的峰面积：δ=1.60的峰面积为6 个2号H的面积和微量水的氢的面积之和，所以总面积减去6后，剩下的为水的峰面积。

A水=A2号H积分值－6 （4）

（5）

式中：mS为样品质量/g；AS为样品质子吸收峰面积；nS为样品吸收峰所包含质子数；mR为内标物质量/g；
AR内标物吸收峰面积；nR为内标物吸收峰所包含质子数；MS为样品摩尔质量/（g/mol）；MR为内标物摩尔质量/（g/mol）；S为脂肪酸；R为苯甲酸。

m饱和脂肪酸=m总脂肪酸－m亚麻酸－m亚油酸－m油酸 （6）

（7）

按公式（8）、（9）计算各种植物油中各脂肪酸及水的含量：

（8）

（9）

根据上述计算方法，分别计算出各种植物油中各脂肪酸及水的含量，结果见表1。

表 1 植物油中各种脂肪酸及水的含量

Table 1 Contents of fatty acids and water in vegetable oils

%

从表1得到，在常见的植物油里紫苏籽油中亚麻酸和饱和脂肪酸含量最高，葵花籽油中亚油酸最高，茶油中油酸含量最高，其中大豆油中水的含量最高。

2.3 回收率

称取大豆油约70 mg，分别添加28.2、62.4、77.5 mg油酸甲酯标准样品，约18 mg苯甲酸作为内标，充分摇匀后测定，通过计算油酸甲酯的量与实际添加的量进行比较，得出回收率，结果见表2。

表 2 回收率实验结果

Table 2 Results of recovery tests

3 次测得的回收率分别为98.26%、101.81%、98.23%，回收率较高，表明该方法能够准确地测量出样品的含量，结果可靠。

2.4 精密度

表 3 精密度计算结果

Table 3 Results of precision tests

由表3可以得出，各种脂肪酸和水含量的精密度均小于3%，说明该方法的重复性和准确度较好。

2.5 GC-MS检测各种植物油脂肪酸的含量

为了进一步验证上述核磁方法的准确性，本实验还利用GC-MS手段，通过面积归一化法对各种植物油中的饱和与不饱和脂肪酸的含量进行了检测，结果见表4。

表 4 植物油中各种脂肪酸的含量

Table 4 Contents of fatty acids in vegetable oils

%

从表4可以看出，采用GC-MS手段通过面积归一化法得到的各种脂肪酸含量与表2中核磁结果相差不大，说明利用核磁共振仪加入内标的方法检测植物油中亚麻酸甘油酯、亚油酸甘油酯、油酸甘油酯和饱和脂肪酸甘油酯的含量结果可靠。

3 结 论

核磁共振法测定植物油中脂肪酸含量的方法不仅避免了传统气相色谱检测法中繁琐的前处理和色谱条件的摸索，且在定量分析中可以快速计算出其中各种脂肪酸和水的含量[17-20]。其中的回收率和精密度都在允许范围内，为研究脂肪酸含量的测定提供了有效可靠的新方法。

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