液相色谱-质谱同时测定水产品中78 种兽药残留

李仲超1,2

(1.厦门市产品质量监督检验院,福建 厦门 361004;2.厦门市工业产品生产许可证审查技术中心,福建 厦门 361004)

 

摘 要:运用液相色谱-质谱技术建立水产品(鱼、虾和贝)中78 种兽药的同时测定方法。含0.1%甲酸的乙腈溶液进行提取,考察不同萃取溶剂及Na2EDTA添加量对目标兽药回收率影响。目标兽药在0.1~100 μg/kg范围内线性良好;以基底匹配工作曲线和替代物法分别进行定量和质控,4 μg/kg和20 μg/kg两个加标量条件下鱼、虾、贝肉的加标回收率和相对标准偏差(n=4)分别为40.8%~125.6%和0.1%~16.0%(鱼)、42.9%~131.9%和0.1%~14.0%(虾)、及43.5%~136.4%和0.3%~15.8%(贝),方法检测限为0.1~0.5 μg/kg。方法灵敏、准确、快速,可应用于福建漳州养殖区虾样兽药污染情况调查。

关键词:液相色谱-质谱;同时测定;水产品;兽药

 

Simultaneous Determination of Veterinary Drug Residues in Aquatic Products by Liquid
Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS-MS)

 

LI Zhong-chao1,2

(1. Xiamen Products Quality Supervision and Inspection Institute, Xiamen 361004, China;

2. Xiamen Industrial Products Production License Review Technology Center, Xiamen 361004, China)

 

Abstract: A method for the simultaneous determination of 78 veterinary drugs in aquatic products (fish, shrimp and shellfish) was established using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). Effects of experimental conditions such as extraction solvents and Na2EDTA adding on extraction efficiency were investigated. Under the optimized conditions, recoveries of 78 target drugs calculated from matrix match calibration curve at spiked level of 4 and 20 μg/kg were 40.8%–125.6% for fish, 42.9%–131.9% for shrimp and 43.5%–136.4% for shellfish with RSD (n = 4) of 0.1%–16.0%, 0.1%–14.0% and 0.3%–15.8%, respectively. The detection limits drugs ranged from 0.1 to 0.5 μg/kg. The method is sensitive, accurate and fast and can be successfully applied in the analysis of residual veterinary drugs in shrimp samples from the aquatic farming areas of Zhangzhou, Fujian province.

Key words: liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS-MS); simultaneous determination; aquatic products; veterinary drugs

中图分类号:TS207.53 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2014)16-0217-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201416042

兽药是用以防治禽畜和水产品疾病、促进其生长繁育的药品。主要种类包括抗生素类、激素类和抗寄生虫药等[1]。随着近年来水产养殖业的发展,越来越多的兽药投入使用以提高水产品的质量与产量[2]。与此同时,残留在水产品中的兽药也引起了广泛关注,国际食品法典委员会、欧盟指令条例、日本肯定列表制度等对水产品中多种兽药规定了最大残留限量(maximum residue limit,MRL)[3-4]。兽药的MRLs经常成为我国水产品出口贸易中遇到的“绿色壁垒”,造成水产养殖业的巨额损失[5]。现有研究多针对水产品中单一或者热点种类兽药、操作繁琐、仪器检测限高、应对突发水产品安全事件时的检测效率低[6-13]。本实验选择多种类兽药作为目标物,液相色谱-质谱进行分析检测[14-15],建立了在水产品(鱼、虾、贝)中灵敏、准确、快速的同时分析方法,为水产品中兽药残留情况调查提供了技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

巴浪鱼和牡蛎,购自福建厦门水产品超市;南美白对虾,采自漳州紫泥养殖虾池塘。

标准品分别购自德国奥格斯堡公司和美国Sigma公司,其中包括:17 种磺胺类、9 种喹诺酮类、4 种四环素类、4 种工业染料类、9 种β-受体激动剂类、7 种β-内酰胺类、8 种硝基呋喃及其代谢物衍生物类、4 种大环内酯类、3 种氯霉素类、5 种雌激素类、2 种雄激素类、乙胺嘧啶、喹乙醇、卡巴氧、螺旋霉素、玉米赤霉醇、尼卡巴嗪、10 种替代物。取适量兽药标准品,以甲醇为溶剂,配成一定质量浓度的单标储备液;78 种目标兽药的混合标准溶液用甲醇为溶剂配制,置于-4 ℃冰箱中避光保存。

乙腈、甲醇、正己烷(均为色谱纯) 美国Tedia公司;甲酸(色谱纯) 美国Fluka公司;Na2EDTA 上海
申博化工有限公司;无水硫酸钠、柠檬酸(均为分析纯) 西陇化工股份有限公司;磷酸氢二钠(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

含0.1%甲酸的乙腈作为萃取溶剂:将1 000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液与625 mL 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液混合,得到柠檬酸缓冲溶液;正己烷溶液中加入少量乙腈,剧烈振荡分层弃去下层乙腈,得到乙腈饱和正己烷溶液;含0.1%甲酸的乙腈-水(14,v/v)作为定容溶剂。

6410 Triple Quad液相色谱-质谱联用仪(包括1260液相色谱系统和电喷雾电离(electronic spray ionization,ESI)源 美国Agilent公司;色谱分离柱Kinetex C18(100 mm×3 mm,2.6 μm) 美国Phenomenex公司;12通道固相萃取装置 美国Supelco公司;0.22 μm亲水性聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)注射过滤器 天津津腾实验设备有限公司;500 mg/6 mL Oasis HLB固相萃取(solid phase extraction,SPE)柱 美国Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 分析仪器条件

1.2.1.1 色谱条件

柱温:30 ℃;流速:0.25 mL/min。进样量:10 μL。目标物分为ESI+项目A、B两组和ESI-项目C共3组,其中,ESI+项目组的流动相为:含0.10%甲酸的超纯水(A1)和含0.10%甲酸的乙腈(B1);梯度洗脱程序为:0~2 min,10% B1;2~10 min,10%~15% B1;10~12 min,15% B1;12.01~16 min,25% B1;16~24 min,25%~80% B;24~26 min,80% B1;26.01~30 min,10% B1。ESI-项目组的流动相为:超纯水(A2)和乙腈(B2);梯度洗脱程序为:0~1 min,25% B2;1.01~5 min,45% B2;5~9 min,45%~80% B2;9~12 min,80% B2;12.01~15 min,25% B2

1.2.1.2 质谱条件

离子源:ESI+和ESI-;离子源温度:350 ℃;毛细管电压:4000 V;雾化气流速:10 L/min;检测模式:多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM);目标兽药及替代物的质谱参数优化结果见表1。

1.2.2 样品前处理

1.2.2.1 样品的制备

鱼肉:去鳞,沿背脊取鱼肉、皮部分,搅拌机绞碎后放入-4 ℃冰箱中保存备用;虾肉:去头、壳、肠腺,取肌肉部分,搅拌机绞碎后放入-4 ℃冰箱中保存备用;贝肉:去壳,取可食用部分,搅拌机绞碎后放入-4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2.2 样品的提取

称取5.0 g制备后样品于80 mL聚乙烯离心管,加入0.5 g Na2EDTA、30 mL含0.1%甲酸的乙腈提取溶剂和20 mL乙腈饱和的正己烷,中速均质2~3 min后以3 500 r/min
离心5 min,取中间层乙腈溶液于150 mL旋转烧瓶中,残渣中再加入20 mL乙腈,超声萃取10 min,3 500 r/min离心5 min后合并乙腈萃取液。

1.2.3 样品的净化

1.2.3.1 有机溶液除油净化法

上述1.2.2.2节萃取液旋转蒸发至干后,以定容溶剂定容至1.0 mL,加入1.0 mL乙腈饱和正己烷净化除油,离心后取下层乙腈液,经0.22 μm PVDF滤膜过滤后,待液相色谱-质谱检测。

1.2.3.2 SPE净化法

将1.2.2.2节萃取液旋转蒸发至干后,加入20 mL超纯水后,再加入10 mL正己烷,振摇后弃去正己烷,重复一次;依次以6 mL甲醇和6 mL水活化HLB柱,吸取旋转烧瓶中的水样通过HLB柱进行净化,上柱完毕后以6 mL的甲醇-水(595,v/v)进行淋洗后,抽干后依次用8 mL的甲醇和4 mL甲醇-二氯甲烷(11,v/v)进行洗脱;接取的洗脱液在40 ℃氮吹浓缩至干,以定容溶剂定容至1 mL,经0.22 μm PVDF过滤器过滤后,待液相色谱-质谱检测。

2 结果与分析

2.1 目标物质谱参数优化

以适当浓度目标物和替代物的单标溶液进行质谱参数优化。首先进行全扫描,优化目标物的[M+H]+或[M-H]-准分子离子峰响应;然后对准分子离子进行轰击,监测二次碎裂产生的子离子,最后将准分子离子和2~3 个信号强度适宜的子离子组成监测离子对,以MRM模式进行检测。优化后的目标物母离子(parent ion,PI)、源内碎裂电压(fragmenter voltage,FV)、子离子(daughter ions,DI)、碰撞能(collision energy,CE)等质谱参数和以5 倍信噪比计算的仪器测定限(instrument detection limit,IDL)见表1。

2.2 色谱条件的优化

在流速0.25 mL/min、进样量10 μL的条件下,分别用流动相A1和B1优化正离子目标兽药的分离;用流动相A2和B2来优化负离子目标兽药的分离。首先通过洗脱程序较长且梯度较缓的慢梯度程序确定各目标物的大致出峰时间顺序和分离情况,再分段调整梯度洗脱程序,实现最佳分离效果。优化后目标兽药分组分析梯度程序见1.2.1.1节,MRM谱图见图1。

771161.jpg 

771151.jpg 

771139.jpg 

图中序号对应目标兽药见表1。

图 1 目标兽药分组分析的质谱多反应监测谱图

Fig.1 MRM chromatograms of grouped target veterinary drugs

2.3 水产品萃取条件优化

2.3.1 萃取溶剂优化

水产品中蛋白质和脂肪杂质较多,需要选择合适的萃取溶剂。本研究以养殖的南美白对虾为基底,添加目标兽药混标至10 μg/kg,参照1.2.2节进行前处理,考察含0.1%甲酸的乙腈溶液、乙腈-柠檬酸-磷酸缓冲溶液(43,v/v)和乙腈-柠檬酸-磷酸缓冲溶液(91,v/v)对目标兽药的萃取回收率,最终选择回收率高且具有较好的蛋白质沉淀作用的含0.1%甲酸的乙腈进行萃取。

2.3.2 Na2EDTA添加量的优化

水产品中的重金属可能会对萃取效果产生影响。本研究以养殖的南美白对虾为基底,添加目标兽药混标至理论添加量10 μg/kg,加入0.0、0.5 g和1.0 g的Na2EDTA,参照1.2.2节进行前处理,结果显示添加Na2EDTA后,样品中喹诺酮类和硝基呋喃类目标兽药的回收率显著优于未添加组,而添加0.5 g 和1.0 g时的回收率无明显区别,因此,后续研究选择在5.0 g样品萃取前加入0.5 g Na2EDTA。

表 1 目标兽药的质谱检测参数、工作曲线线性范围、相关系数和IDLs

Table 1 Tandem mass parameters, linear ranges, correlation coefficients and IDLs of target veterinary drugs

编号

目标兽药

质谱参数

线性范围/(ng/mL)

r2

IDL/

(ng/mL)

PI(m/z)

DI(m/z)

FV/V

CE/eV

S

磺胺类 sulfonamides

 

 

 

 

 

 

 

S01

磺胺甲恶唑 sulfamethoxazole

254.1

156.1*,160.1

100

10,15

0.5~100

1.000 0

0.1

S02

胺甲噻二唑 sulfamethizole

271.0

156.0*,108.1

100

10,20

0.1~100

1.000 0

0.02

S03

磺胺吡啶 sulfapyridine

250.0

156.0*,184.1

100

10,15

0.5~100

0.999 9

0.1

S04

磺胺噻唑 sulfathiazole

256.0

156.0*,108.0

100

10,20

0.5~100

1.000 0

0.1

S05

磺胺喹恶啉 sulfaquinoxaline

301.0

156.0*,208.0

120

10,15

0.5~100

0.999 9

0.1

S06

磺胺氯哒嗪 sulfamonomethoxine

285.0

156.0*,108.0

100

10,20

0.1~100

1.000 0

0.02

S07

磺胺甲基嘧啶 sulfamerazine

265.1

156.0,172.0*

110

10,10

0.5~100

1.000 0

0.1

S08

磺胺二甲氧嘧啶 sulfadimethoxine

311.1

156.0*,245.1,218.0

120

18,15,15

0.1~100

1.000 0

0.02

S09

磺胺间甲氧嘧啶 sulfameter

281.1

156.0*,188.0

120

10,10

0.1~20

1.000 0

0.02

S10

磺胺对甲氧嘧啶 sulfamonomethoxine

281.0

156.0*,215.1

120

15,15

0.1~100

1.000 0

0.02

S11

磺胺二甲基嘧啶 sulfamethazine

279.1

156.0,186.0*

120

15,15

0.5~100

1.000 0

0.1

S12

磺胺嘧啶 sulfadiazine

251.0

156.0*,185.1

100

10,15

1.0~100

1.000 0

0.2

S13

磺胺二甲基异嘧啶 sulfaisodimidine

279.0

124.1*,186.0

120

20,10

0.2~100

1.000 0

0.04

S14

磺胺醋酰 sulfacetamide

215.0

156.0*,108.0

80

5,15

0.5~100

1.000 0

0.1

S15

磺胺二甲异恶唑 sulfisoxazole

268.0

156.0*,113.0

100

10,10

0.1~100

1.000 0

0.02

S16

磺胺硝苯 sulfanitran

336.0

156.1*,294.0

120

5,5

0.5~500

0.999 9

0.1

S17

磺胺邻二甲嘧啶 sulfamethoxypyridazine

281.0

156.0*,126.0,108.0

120

10,15,20

0.5~100

1.000 0

0.1

Q

喹诺酮类 quinolone

 

 

 

 

 

 

 

Q01

环丙沙星 ciprofloxacin

332.1

314.1*,288.1

120

15,15

5.0~100

0.997 5

1.0

Q02

诺氟沙星 norfloxacin

320.1

302.1*,276.1

120

15,10

5.0~100

0.997 5

1.0

Q03

恩诺沙星 enrofloxacin

360.1

342.1*,316.1

120

15,15

5.0~100

0.993 0

1.0

Q04

氧氟沙星 ofloxacin

362.1

318.1*,261.0

140

15,20

0.5~100

0.995 8

0.1

Q05

达氟沙星 danofloxacin

358.1

340.0*,283.1

150

20,20

5.0~100

0.990 9

1.0

Q06

氟甲喹 flumequine

262.0

244.0*,202.0

100

15,20

0.2~40

0.999 6

0.04

Q07

麻保沙星 marbofloxacin

363.1

345.1*,320.0

120

15,20

5.0~500

0.995 0

1.0

Q08

沙拉沙星 sarafloxacin

386.0

368.0*,342.1,299.0

150

20,15,25

1.0~100

0.997 3

0.2

Q09

恶喹酸 oxolinic acid

262.0

244.0*

100

12

0.5~100

0.999 6

0.1

B

β-受体激动剂 β-agonists

 

 

 

 

 

 

 

B01

莱克多巴胺 ractopamine

302.1

164.1*,284.1

100

10,5

0.5~100

1.000 0

0.1

B01-D

莱克多巴胺-d3 ractopamine-d3

305.3

135.0*,93.2

120

20,28

0.5~100

1.000 0

0.1

B02

克伦特罗 clenbuterol

277.0

259.0,203.0*

100

5,10

0.1~20

0.999 9

0.02

B02-D

克伦特罗-d9 clenbuterol-d9

286.3

204.1*,268.1

100

15,5

0.1~20

0.999 9

0.02

B03

特步他林 terbutaline sulphate

226.1

152.1*,170.1

100

10,5

0.5~100

0.999 9

0.1

B04

沙丁胺醇 salbutamol

240.1

148.1*,222.1,166.1

100

15,5,10

0.2~40

0.999 9

0.04

B04-D

沙丁胺醇-d3 salbutamol-d3

243.3

151.1*,225.2,169.0

100

15,5,10

0.2~40

0.999 9

0.04

B05

西马特罗 cimaterol

220.1

202.0*,160.1

80

5,15

5.0~100

0.999 5

1.0

B06

非诺特罗 fenoterol

304.1

135.0*,107.0

120

15,20

5.0~100

0.998 3

1.0

B07

氯丙那林clorprenaline

214.1

154.1*,196.1

80

15,5

5.0~100

0.999 2

1.0

B08

妥布特罗tulobuterol

228.1

154.0*,172.0

100

15,5

1.0~100

0.999 8

0.2

B09

喷布特罗penbutolol

292.2

236.1*,201.0

100

10,20

0.5~100

0.999 4

0.1

M

大环内酯类macrolides

 

 

 

 

 

 

 

M01

红霉素erythromycin

734.4

576.4*,158.1

150

15,20

0.1~20

0.999 9

0.02

M02

泰乐菌素tylosin

916.4

772.3,174.1*

220

30,40

0.5~100

1.000 0

0.1

M03

替米考星tilmicosin

869.5

696.3,174.1*

250

40,45

2.0~40

0.999 5

0.4

M04

林可霉素lincomycin

407.2

126.1*,359.1

150

20,15

0.1~20

0.999 9

0.1

T

四环素tetracyclines

 

 

 

 

 

 

 

T00

土霉素oxytetracycline

461.1

443.1,426.1*

120

5,15

1.0~100

0.999 1

0.2

T01

金霉素chlortetracycline

479.1

462.1,444.1*

120

10,15

5.0~100

0.998 2

1.0

T02

四环素tetracycline

445.1

427.1,410.0*

120

5,15

5.0~100

0.998 0

1.0

T03

强力霉素doxycycline

445.1

428.1*,410.1

120

15,20

5.0~100

0.998 3

1.0

b

β-内酰胺类β-lactams

 

 

 

 

 

 

 

b01

阿莫西林amoxicillin

398.1

349.1*,160.0

100

10,20

5.0~100

0.998 0

1.0

b02

头孢噻呋ceftiofur

524.0

241.0*,285.0

150

10,15

0.5~100

1.000 0

0.1

b03

青霉素G penicillin G

367.1

217.1*,160.1

100

15,10

0.5~100

1.000 0

0.1

b04

双氯青霉素 dicloxacillin

502.0

160.1,212.1*

120

15,20

0.5~100

1.000 0

0.1

b05

苯唑青霉素 oxacillin

434.1

160.0,186.0,144.0*

120

10,15,25

0.5~100

1.000 0

0.1

b06

氯唑青霉素 cloxacillin

468.1

160.0*,436.0

120

15,10

0.1~20

1.000 0

0.02

b07

氨苄青霉素 ampicillin

382.1

160.0*,333.1,223.1

120

15,10,5

1.0~100

0.999 9

0.02

D

工业染料类 dye drugs

 

 

 

 

 

 

 

D01

结晶紫 crystal violet

372.2

356.2*,340.1

200

40,50

0.008~8.0

0.995 9

0.002

D02

隐性结晶紫 leucocrystal violet

374.2

358.2*,239.1

180

30,35

5.0~100

0.996 9

1.0

D03

隐性孔雀石绿 leucomalachite green

331.1

239.1*,314.9

150

30,30

5.0~100

0.998 9

1.0

D03-D

隐性孔雀石绿-d5 leucomalachite green-d5

337.4

125.1*,109.1

120

20,20

5.0~100

0.998 9

1.0

D04

孔雀石绿 malachite green

329.4

313.2*,208.1

180

45,45

0.1~100

0.999 3

0.02

D04-D

孔雀石绿-d5 malachite green-d5

334.1

318.1*,213.1

200

40,35

0.1~100

0.999 3

0.02

A

雄激素类 androgens

 

 

 

 

 

 

 

A01

甲基睾丸酮 methyl testosterone

303.2

97.1*,109.1

150

20,20

0.1~100

1.000 0

0.02

A02

丙酸睾丸酮 testosterone propionate

345.3

109.1*,175.2

120

20,15

1.0~100

0.999 5

0.02

N

硝基呋喃及其代谢物类 nitrofurans

 

 

 

 

 

 

 

N00

呋喃唑酮 furazolidone

226.1

122.1*,138.7

120

20,10

2.5~500

0.999 9

0.5

N01

呋喃它酮 furaltadone

325.1

252.1*,281.1

100

10,5

5.0~100

0.999 2

1.0

N02

呋喃妥因 nitrofurantoin

239.0

222.0*,122.0

120

10,20

5.0~500

1.000 0

1.0

N03

呋喃西林 nitrofurazone

199.1

182.0*,139.1,136.1

80

5,5,10

5.0~500

0.999 8

1.0

N04

NP-AOZ

236.0

134.0*,104.0

100

5,20

5.0~100

0.999 7

1.0

N04-D

NP-AOZ-d4

239.8

166.4*

100

5

5.0~100

0.999 7

1.0

N05

NP-AMOZ

335.1

291.1*,262.1

100

5,10

5.0~100

0.999 1

1.0

N05-D

NP-AMOZ-d5

340.1

296.2*,265.1,133.0

100

5,10,20

5.0~100

0.999 1

1.0

N06

NP-AHD

249.0

134.0*,178.1

100

5,10

5.0~500

0.999 6

1.0

N06-C

NP-AHD-13C3

252.0

176.2*,134.2

150

20,30

5.0~500

0.999 6

1.0

N07

NP-SCA

209.0

192.0*,166.0

80

5,5

2.5~500

0.999 8

0.5

N07-C

NP-SCA-13C15N2

208.7

165.1*,193.0

150

10,20

2.5~500

0.999 8

0.5

E

雌激素类 estrogens

 

 

 

 

 

 

 

E01

己烯雌酚 diethylstilbestrol

-267.3

237.1*,222.1

150

25,30

5.0~100

0.998 8

1.0

E02

雌三醇 estriol

-287.0

170.6*,144.8

200

34,34

125~25000

1.000 0

25.0

E03

雌二醇 estradiol

-271.0

183.0*,145.0

200

35,40

125~25000

0.997 9

25.0

E04

己烷雌酚 hexoestrol

-269.2

119.0,134.1*

120

20,5

0.5~500

1.000 0

0.1

E05

双烯雌酚 dienoestrol

-265.2

235.3*,249.2

150

20,20

0.5~500

0.999 5

0.1

E06

氯地孕酮 chlormadinone

405.1

309.1*,301.0

120

10,15

0.5~500

1.000 0

0.1

C

氯霉素类 chloromycetins

 

 

 

 

 

 

 

C01

氯霉素 chloramphenicol

-321.1

257.0,151.0*

120

5,10

0.5~500

0.999 9

0.1

C01-D

氯霉素-d5 chloramphenicol-d5

-328.2

157.0*,126.0

130

10,20

0.5~500

0.999 9

0.1

C02

甲砜霉素 thiamphenicol

-354.1

290.0,185.1*

130

5,15

0.5~500

1.000 0

0.1

C03

氟甲砜霉素 florfenicol

-356.1

336.2,185.0*

110

10,12

0.5~500

1.000 0

0.1

O

其他类 others

 

 

 

 

 

 

 

O00

乙胺嘧啶 pyrimethamine

249.0

177.0*,233.0

150

30,30

1.0~100

0.999 5

0.2

O02

卡巴氧 carbadox

263.0

231.0*,130.0

120

5,20

1.0~100

0.997 9

0.2

O03

螺旋霉素 spiramycin

875.4

174.3*,145.3

220

35,35

10~1000

0.999 2

2.0

O04

玉米赤酶醇 zeranol

-321.3

303.0,277.3*

160

15,15

0.2~10

0.999 8

0.04

O05

尼卡巴嗪 nicarbazin

-301.1

137.0*

80

2

0.1~10

0.999 8

0.02

 

注:*.定量离子;编号中的D、C后缀分别表示氘代物和13C代物;PI前的“-”表示负离子检测。

 

2.4 净化方式的选择

与水产品共萃出的脂肪、蛋白质等杂质须在前处理中尽量去除,避免干扰检测、污染和损害检测仪器。本研究以虾肉为基底,参照1.2.2节进行前处理,采用有机溶液除油净化和SPE净化两种常见方式对萃取液进行净化,在m/z 100~1 000范围内进行质谱全扫描,如图2所示。可以发现,SPE净化的谱图净化效果并不显著。

771182.jpg 

图 2 水产品样品SPE净化与否的总离子流色谱图对比

Fig.2 Comparison of TICs of aquatic product samples with and without SPE clean-up

在液相色谱-质谱分析中,由于基底杂质的干扰,目标物被ESI电离源电离的能力受到影响,造成目标物信号强度改变的现象称为基底效应 [16-21],根据公式(1)对两种净化方式中水产品的基底效应进行考察,发现在SPE净化方式下,喹诺酮类、大环内酯类和部分β-受体激动剂类目标兽药的基底效应有一定改善,但是同时也发现,β-内酰胺类、雌激素类和工业染料类目标兽药的回收率有一定损失。

基质效应/%= ×100

783566.jpg

定容样品标准品的响应

相同浓度标准品的响应

(1)

综合考虑方法的准确性、灵敏度与成本、效率,本研究在采用基底匹配工作曲线法尽可能克服基底效应干扰的前提下,采用有机溶剂除油法对萃取液进行净化处理。

2.5 定量方法选择

在最优条件下,以南美白对虾基底为例,添加目标兽药混标至理论添加量10 μg/kg,参照1.2.2节进行前处理,比较了外标法、替代物法、基底匹配法的定量结果。其中,基底匹配法是将未检出目标物的空白样品基底经过与样品相同的前处理后,加入系列梯度水平的目标物标准溶液,以此绘制工作曲线用来计算检测结果定量的回收率[22-23],其结果较外标法和替代物法均有显著改善,有效克服了基底效应的干扰,因此,选择基底匹配法作为后续研究的定量方式。

2.6 水产品基底加标回收率、重现性和方法检测限

在最优化的条件下,以1.1节所述的水产品为基底,加入兽药混合标准品至理论添加量4 μg/kg和20 μg/kg,每个添加平行4 份,参照1.2.2节进行前处理,以基底匹配工作曲线法进行定量、替代物进行质控,考察了目标兽药的回收率与重复性,根据表1所列IDLs,综合考虑水产品的基质效应和低浓度加标条件下的回收率情况最终确定MDLs,结果显示除了少数目标兽药在低加标条件下未能检出外,78 种目标兽药在两个加标水平下的回收率均较佳,鱼、虾、贝的加标回收率分别为40.8%~125.6%、42.9%~131.9%和43.5%~136.4%;RSD(n=4)分别为0.1%~16.0%、0.1%~14.0%和0.3%~15.8%,方法满足质量控制要求[24];大部分兽药的MDLs在0.1~0.5 μg/kg,可以满足水产品中多种类兽药残留的检测。

2.7 方法应用

2011年3—11月,运用建立的方法对福建漳州养殖虾塘中的养殖虾进行兽药残留污染检测,养殖虾中检出6 种兽药,含量在0.02~2.6 μg/kg,均低于国内外相关标准的MRLs,其中,环丙沙星和结晶紫在3月的虾样中普遍检出,诺氟沙星、恩诺沙星和氧氟沙星在7月的虾样中普遍检出,氟甲砜霉素在11月的虾样中多数检出。

3 结 论

本研究建立了水产品(鱼、虾、贝)中多种类兽药灵敏、准确、快速同时分析方法,方法质量控制合格、可以满足水产品中多种类兽药残留的检测要求,并成功应用于福建漳州养殖虾塘中养殖虾地检测。

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