核桃粕中蛋白提取工艺的优化

赵见军1，张润光1，马玉娟1，王小纪2，封斌奎3，张有林1,*，李龙柱1

（1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062；

2.西安市林业技术推广中心，陕西 西安 710003；3.陕西大统生态产业开发公司，陕西 西安 710065）

摘 要：以冷榨核桃粕为原料，研究核桃粕中蛋白提取工艺及优化。采用超声波辅助提取核桃粕中蛋白，在单因素试验的基础上，进行正交试验及Box-Behnken试验设计，通过比较、分析确定核桃粕蛋白最佳提取工艺及其优化方法。结果表明，响应面法较正交试验更好的对核桃粕中蛋白提取工艺进行了优化，各因素对蛋白提取率的影响次序为碱溶pH值＞液料比＞超声温度＞超声时间，超声功率150 W时，核桃粕蛋白最佳提取工艺为超声时间60 min、超声温度48 ℃、液料比25∶1（mL/g）、碱溶pH 8.7，pH 5.0时进行沉淀，此条件下核桃粕蛋白质的提取率达69.62%。

关键词：核桃粕；正交试验；响应面法；核桃粕蛋白；优化

Optimization of Protein Extraction from Walnut Dregs

ZHaO Jian-jun1, ZHaNG Run-guang1, Ma Yu-juan1, WaNG Xiao-ji2, FENG Bin-kui3, ZHaNG You-lin1,*, LI Long-zhu1

(1. College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China;

2. Xi’an Center of Forestry Technology Popularization, Xi’an 710003, China;

3. Ecological Industry Development Company of Shaanxi Da-Tong, Xi’an 710065, China)

Abstract: The objective of this study was to optimize the ultrasonic-assisted extraction of protein from walnut dregs as a byproduct from the production of cold-pressed walnut kernel oil. A comparative study was carried out to optimize the extraction process using orthogonal array design and Box-Behnken design. The results showed that response surface methodology was more suitable to optimize protein extraction from walnut dregs than orthogonal array design. The extraction yield of protein was influenced in decreasing order by pH, liquid-to-solid ratio, extraction temperature, and ultrasonication time. The optimized extraction process was determined as extraction using an alkali solvent (pH 8.7) at 48 ℃ with a liquid to solid ratio of 25:1 (mL/g) by ultrasonication for 60 min at a power of 150 W followed by protein precipitation by acidification to pH 5.0, resulting in an extraction yield of 69.62%.

Key words: walnut dregs; orthogonal array design; response surface methodology; walnut protein; optimization

中图分类号：TS219 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）18-0040-07

doi:10.7506/spkx1002-6630-201418008

核桃（Juglans regia L.）又名胡桃、羌桃，属胡桃科胡桃属植物[1]。核桃、扁桃、腰果、榛子并列为世界四大干果[2]。核桃仁蛋白质含量在15%～25%[3-4]，具有健胃、补血、润肺、养神等功效，是食疗佳品[5]。作为冷榨后的副产物核桃粕保留了核桃仁的主要营养成分，脱脂核桃粕中蛋白含量高达53.89%[6]，核桃蛋白中含有18 种氨基酸，其中有8 种人体必需氨基酸，精氨酸和谷氨酸含量很高[7]，表现出很高的营养价值，具有很好的开发前景。但目前对于核桃粕的研究及开发利用不够，大多用于动物饲料和植物肥料[8]，造成核桃蛋白资料的严重浪费。

正交试验[9]以概率论、数理统计和实践经验为基础，利用标准化正交表安排试验方案，采取部分试验来代替全面试验的方法，挑选出有代表性的试验点来进行试验，通过对代表性的试验结果分析，了解全面试验的情况，迅速找到优化方案，以实现工艺的优化，是一种高效处理多因素优化问题的科学计算方法[10]。响应面法是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法[11-12]。用响应面法优化工艺过程主要涉及三步：试验设计、建立数学模型评估相关性，预测响应值考察模型的准确性[13]。

本实验研究核桃粕中蛋白质的提取工艺，在单因素试验的基础上，应用正交试验及响应面法对核桃粕蛋白的提取条件进行优化，通过结果分析以期得到更好的工艺优化方法及最佳蛋白提取工艺，为核桃粕利用提供技术支持，也为生产高蛋白产品提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃粕（蛋白质质量分数50.28%）为实验室自制；所用试剂均为分析纯 西安晶博生物有限公司。

1.2 仪器与设备

KDN-102F型凯氏定氮仪 上海纤检仪器有限公司；
JB-3型定时恒温磁力搅拌器 上海雷磁新泾仪器有限公司；TP310台式精密酸度计 北京时代新维测控设备有限公司；WFJ2000型分光光度计 优尼柯上海仪器有限公司；NH-S4型数显恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；PL203型电子分析天秤 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LD-200型小型万能粉碎机 长沙常宏制药机械厂；KQ-3200DE型数控超声波仪 江苏省昆山市超市仪器有限公司；800B型台式离心机 上海安亭实验仪器有限公司；LGJ-10型冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃蛋白提取工艺流程

冷榨核桃粕→粉碎→烘干（55 ℃）→筛分→浸泡→调pH值至碱性（加NaOH溶液）→超声波＋搅拌60 min→4 000 r/min离心20 min→去油层及下层沉淀→过滤→调节滤液至酸性（加1 mol/L HCl溶液）并搅拌→
4 000 r/min离心20 min→水（蒸馏水）洗沉淀层至中性→冷冻干燥→核桃粕蛋白

1.3.2 核桃粕中蛋白质含量测定

根据GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》采用凯氏定氮法测定。

1.3.3 核桃粕可溶性蛋白提取率及沉淀率测定

采用双缩脲法[14-15]测定可溶性蛋白含量。

1.3.3.1 双缩脲试剂的配制[16]

准确称量（精确至0.001 g）1.5 g硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0 g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6•4H2O）溶于500 mL蒸馏水中，加入300 mL质量分数10%的NaOH溶液并搅拌（加1 g KI可防止Cu2+自动还原成一价氧化亚铜沉淀），加蒸馏水稀释至1 000 mL，可长期保存，若出现黑色沉淀需重配。

1.3.3.2 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）标准曲线的绘制[17]

取6 支有刻度的试管，依次编号，按次序分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准BSA溶液（质量浓度为10 mg/mL），加蒸馏水补足1.0 mL，然后每支试管加入4.0 mL双缩脲试剂，振荡使其充分混合，室温静置30 min，在540 nm波长处测定吸光度。以BSA质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3.3 样品可溶性蛋白质量浓度测定

取样品液1.0 mL于试管中，加入1.0 mL蒸馏水，再加入4.0 mL双缩脲试剂，振荡均匀后室温静置30 min，在540 nm波长处测定吸光度，对照标准曲线求得样品液蛋白质量浓度。

可溶性蛋白提取率及沉淀率计算如式（1）、（2）所示。

（1）

（2）

式中：W1为浸提液中可溶性蛋白质量浓度/（g/mL）；V1为浸提液体积/mL；W2为核桃粕中可溶性蛋白质量浓度/
（g/mL）；V2为核桃粕样品液体积/mL；M0为酸沉前蛋白含量/g；M1为酸沉后蛋白含量/g。

1.3.4 单因素试验

分别以超声时间、液料比、碱溶pH值及超声温度为单因素进行试验设计，以核桃粕蛋白提取率为指标，考察各因素对其影响。

1.3.5 正交试验

在单因素试验基础上，以超声时间、超声温度、碱溶pH值及液料比为因素进行四因素三水平L9（34）正交试验设计，以核桃粕蛋白提取率为指标，考察各因素对其综合影响。

1.3.6 响应面法优化分析

在单因素试验的基础上，运用Design-Expert 7.1软件，根据Box-Behnken试验设计原理[18]，采用四因素三水平的响应面分析法，以核桃粕蛋白提取率为响应值，对其提取条件进行优化。

1.4 数据处理

每个实验重复5 次，结果表示为

±s

。采用Excel 2010统计分析软件进行基础数据整理、分析与作图，利用DPS软件进行方差分析，运用SPSS 17.0对结果进行统计分析，显著水平取P＜0.05（差异显著）。

2 结果与分析

2.1 可溶性蛋白质测定标准曲线

得到溶液吸光度（y）和BSA溶液质量浓度（x）的回归方程为：y=0.504 6x＋0.001 3。标准曲线的相关系数R2达0.999 6，说明BSA在0～10 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2 超声波辅助提取核桃粕蛋白单因素试验

2.2.1 超声时间对蛋白提取率的影响

准确称取2.00 g脱脂核桃粉6 份，分别加入50 mL的蒸馏水，超声温度50 ℃、碱溶pH 8.5、液料比20∶1（mL/g）及超声功率120 W的条件下分别超声20、40、60、80、100、120 min，离心后取上清液，测定540 nm波长处的吸光度，超声时间对蛋白提取率的影响见图1。

图 1 超声时间对蛋白提取率的影响

Fig.1 Effect of ultrasonication time on the extraction yield of walnut protein

由图1可知，蛋白提取率随超声时间延长而增大，超声时间延长到60 min后蛋白提取率趋于平稳，再延长时间，提取率变化不大，因此选择40、60、80 min 3 个水平进行正交及响应面试验分析。

2.2.2 超声功率对蛋白提取率的影响

准确称取2.00 g脱脂核桃粉6 份，分别加入60 mL的蒸馏水，在超声温度50 ℃、碱溶pH 8.5的条件下分别在超声功率75、90、105、120、135、150 W时超声60 min，离心后取上清液，测定540 nm波长处的吸光度，超声功率对蛋白提取率的影响见图2。

图 2 超声功率对蛋白提取率的影响

Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of walnut protein

由图2可知，蛋白提取率随着超声功率的增大而增大，因此功率大些为好，选取150 W进行后续的正交及响应面试验分析。

2.2.3 超声温度对蛋白提取率的影响

准确称取2.00 g脱脂核桃粉6 份，分别加入60 mL的蒸馏水，在超声功率150 W、碱溶pH 8.5的条件下分别使用温度35、40、45、50、55、60 ℃超声60 min，离心后取上清液，测定540 nm波长处的吸光度，以蛋白提取率为指标，得到超声温度对蛋白提取率的影响见图3。

图 3 超声温度对蛋白提取率的影响

Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of walnut protein

由图3可知，蛋白提取率随着超声温度的升高而增大，在45 ℃时达到最大值，随后稍有下降。这可能是由于超声过程中介质吸收超声波后，将其转化成热能，从而导致物料内部温度升高较快，对蛋白有一定的破坏作用。选取45、50、55 ℃ 3 个水平进行后续的正交及响应面试验分析。

2.2.4 液料比对蛋白提取率的影响

准确称取5.00 g脱脂核桃粉6 份，分别以10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1和35∶1的液料比加入50 mL的蒸馏水，在碱溶pH 8.5、超声功率100 W、超声温度45 ℃的条件下超声20 min，然后离心取上清液，测其所在540 nm波长处的吸光度，以蛋白提取率为指标，分析液料比对蛋白提取率的影响，见图4。

图 4 液料比对蛋白提取率的影响

Fig.4 Effect of lipid-to-solid ratio on the extraction yield of walnut protein

由图4可知，蛋白提取率随着液料比的增大而增大，液料比大于25∶1时，蛋白提取率的增加趋于缓慢，继续增大液料比对蛋白的溶出效果不明显。这可能是由于核桃粕蛋白在溶液中具有一定的溶解度，在溶解达到饱和时，过量的核桃粕蛋白不再溶解，提取率不再提高。因此选取20∶1、25∶1、30∶1三个水平进行正交及响应面试验分析。

2.2.5 碱溶pH值对蛋白提取率的影响

准确称取2.00 g脱脂核桃粉6 份，分别加入50 mL的蒸馏水，超声温度为45 ℃，在碱溶pH 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的条件下超声60 min，然后离心取上清液，测其所在540 nm波长处的吸光度，碱溶pH值对蛋白提取率的影响见图5。

图 5 碱溶pH值对蛋白提取率的影响

Fig.5 Effect of solvent pH for the extraction yield of walnut protein

由图5可知，蛋白提取率随着碱溶pH值的增大而升高，在pH 8.5时达到最大值，随后蛋白的溶出率有所下降。这说明碱溶pH值升高到8.5后，大部分可溶性蛋白质都呈离子化状态被溶解出来，再提高pH值，就会溶入更多的非蛋白杂质，造成蛋白提取率降低。因此选择pH 8.5为适宜的碱溶pH值条件。在试验中发现，pH值的变化会影响所提取蛋白成品的颜色，而且随着pH值的增大，颜色也来越深。但pH值在8.0～11.0范围内，颜色较浅。因此，选取8.0、8.5、9.0三个水平进行正交及响应面试验分析。

2.3 正交试验优化核桃粕蛋白提取工艺

2.3.1 蛋白提取工艺L9（34）正交试验

在单因素试验基础上，以超声时间、液料比、碱溶pH值和超声温度4 个因素为自变量（分别以A、B、C、D表示），以蛋白提取率为指标，进行四因素三水平
L9（34）正交试验，试验设计结果见表1。

表 1 核桃粕提取蛋白工艺L9（34）正交试验设计及结果

Table 1 Orthogonal array design L9 (34) and results

由表1极差分析结果可以看出，C＞B＞D＞A，4个因素对核桃粕蛋白提取率的影响大小依次为：碱溶pH值（C）＞液料比（B）＞超声温度（D）>超声时间（A）。4 个因素中，碱溶pH值、液料比和超声温度的影响较为显著，其中碱溶pH值影响最为显著。试验设计范围内，优化得到提取蛋白最佳方案为C2B2D3A2，即碱溶pH值、液料比、超声温度、超声时间分别为8.5、25∶1、50 ℃、60 min。

2.3.2 验证实验

在超声功率为150 W时，正交优化后核桃粕中蛋白提取的最佳工艺为超声时间60 min、液料比25∶1、碱溶pH 8.5、超声温度50 ℃，在此最优方案条件下进行验证实验，做5次平行取平均值，蛋白提取率达67.39%。

2.4 响应面法优化核桃粕蛋白提取工艺

2.4.1 响应面分析法优化工艺试验设计及结果

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验原理，以超声时间、液料比、碱溶pH值和超声温度4 个因素为自变量（分别以X1、X2、X3、X4 表示），以蛋白提取率为响应值设计了四因素三水平共29 个试验点的响应面分析试验，响应面试验设计及结果见表2。

表 2 响应面试验设计及结果

Table 2 Experiment design and result for response surface analysis

利用Design-Expert软件对表2试验数据进行回归拟合[19-21]，得到核桃粕蛋白提取率对超声时间、液料比、碱溶pH值和超声温度4 个变量的二次多项回归模型方程：

Y＝68.01＋0.14X1＋0.87X2＋1.24X3＋0.34X4＋0.38X1X2－1.02X1X3＋0.12X1X4－1.67X2X3＋0.58X2X4＋0.13X3X4－4.58X12－4.85X22－10.54X32－0.79X42

对该模型进行回归方差分析（表3），结果表明，回归模型极显著（P＜0.01），复相关系数为0.951 8，校正相关系数为0.903 6，说明模型可以较好的拟合超声时间、液料比、碱溶pH值和超声温度对核桃粕中蛋白提取率的影响情况，可用于分析和预测提取结果。回归模型系数显著性检验结果（表4），可知模型的一次项和交互项均不显著；二次项X12、X22、X32显著，X42不显著。通过对回归系数的检验可知，各因素对核桃粕蛋白提取率影响次序为：X3＞X2＞X4＞X1。

表 3 回归模型方差分析

Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

表 4 回归分析结果

Table 4 Results of regression analysis

2.4.2 核桃粕蛋白提取率响应面分析及优化

根据二次回归方程利用Deign-Expert软件作超声时间、液料比、碱溶pH值、超声温度4 个因素的响应面分析图和等高线图（图6～11），响应面图形是响应值Y与其对应因素X1、X2、X3和X4构成的三维空间在二维平面上的等高线图，考察拟合响应面及等高线的形状可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响，椭圆形表示两因素交互作用显著，圆形则与之相反[22-24]，分析
图6～11表明，碱溶pH值对蛋白提取率的影响最为显著，液料比、超声温度、超声时间依次降低，对拟合方程求偏导可得模型最大值，即为优化试验方案。

图 6 超声时间（X1）和液料比（X2）对蛋白提取率影响的
响应面及等高线

Fig.6 Response surface and contour plot for the effects of ultrasonication time and liquid to solid ratio on the extraction yield of protein

图 7 超声时间（X1）和碱溶pH值（X3）对蛋白提取率
影响的响应面及等高线

Fig.7 Response surface and contourplots for the effects of ultrasonication time and solvent pH on the extraction yield of protein

图 8 超声时间（X1）和超声温度（X4）对蛋白提取率
影响的响应面及等高线

Fig.8 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonication time and extraction temperature on the
extraction yield of protein

图 9 液料比（X2）和碱溶pH值（X3）对蛋白提取率
影响的响应面及等高线

Fig.9 Response surface and its contours plot of effects of liquid-to-solid ratios and pH on extracting ratio of protein

图 10 液料比（X2）和超声温度（X4）对蛋白提取率
影响的响应面及等高线

Fig.10 Response surface and contour plots for the effects of extraction temperature and liquid-to-solid ratio on the extraction yield of protein

图 11 碱溶pH值（X3）和超声温度（X4）对蛋白提取率
影响的响应面及等高线

Fig.11 Response surface and contour plots for the effects of extraction temperature and solvent pH on the extraction yield of protein

2.4.3 最佳提取工艺验证实验

超声功率为150 W，以蛋白提取率为响应值，通过Design-Expert软件进行响应面分析，得到最佳提取工艺为超声时间59.83 min、液料比24.87∶1、碱溶pH 8.72、超声温度48.11 ℃，预测的核桃粕蛋白提取率为70.42%。取脱脂核桃粉1 000 g，选取超声波时间60 min、液料比25∶1、碱溶pH 8.7、超声温度48 ℃进行放大验证实验，做4 次平行取其均值，得到核桃粕蛋白提取率达69.62%，与理论预测值的相对误差为0.27%，证明了方程可靠性与响应面分析法的有效性。

2.5 酸沉pH值对核桃粕蛋白的沉淀作用

表 5 酸沉pH值对核桃粕蛋白沉淀的影响

Table 5 Effect of pH on the precipitation of walnut protein

对比可得响应面法较正交试验优化效果较好，应用响应面法得到的最优工艺进行蛋白质酸沉淀，由表5可知，pH值在4.5～5.5时蛋白质沉淀迅速，离心后上清液清亮，效果较好，沉淀率达94.5%，因此核桃粕蛋白质酸沉pH值以5.0为好。

3 结 论

在单因素试验的基础上，确定超声功率150 W，通过四因素三水平正交试验和响应面分析法对核桃粕中蛋白提取工艺进行优化。结果表明，正交试验和响应面法优化后的最佳提取工艺分别为：超声时间60 min、液料比25∶1、碱溶pH 8.5、超声温度50 ℃；超声时间60 min、液料比25∶1、碱溶pH 8.7、超声温度48 ℃。响应面法得到最优提取工艺条件下实验得到最优酸沉pH 5.0。正交试验和响应面法两种优化方法得到各因素对蛋白提取率的影响次序均是碱溶pH值＞液料比＞超声温度＞超声时间，以上两种方法优化后得到核桃粕蛋白提取率分别达67.39%、69.62%。说明响应面法较正交试验优化效果较好，更适合于核桃粕中蛋白提取工艺的优化，放大实验为规模化核桃粕蛋白的提取提供了数据参考，对核桃仁的综合利用及满足人们对高品质蛋白产品的需求具有重要意义。

参考文献：

[1] 郭从善. 核桃及其加工与利用[J]. 粮油食品科技, 1999, 7(5): 23-25.

[2] 黄黎慧, 黄群, 孙术国. 核桃的营养保健功能与开发利用[J]. 粮食科技与经济, 2009, 3(4): 48-50.

[3] 凌育赵, 刘经亮. 核桃果实各部位脂肪酸的组成与含量分析[J]. 食品研究与开发, 2007, 28(10): 139-142.

[4] 吴开志, 肖千文, 唐礼贵, 等. 核桃种仁粗脂肪和氨基酸含量的差异性分析[J]. 经济林研究, 2007, 25(2): 15-18.

[5] 李仁敏. 核桃营养及药用研究进展[J]. 农产品加工, 2004(12): 26-27.

[6] 杜蕾蕾, 郭涛, 万辉, 等. 冷榨核桃饼中核桃蛋白的提取与纯化的研究[J]. 粮油加工, 2008(10): 78.

[7] 姜莉, 徐怀德, 陈金海, 等. 核桃多肽的制备及核桃多肽酒的研制[J]. 食品科学, 2009, 30(8): 307-311.

[8] LU Bin, NING Delu, BAO Jiangshan. The research progress of walnut nutrition medicinal value and processing technology[J]. Fruit and Vegetable Processing, 2006, 4: 41-43.

[9] 胡良平. 正交试验设计的意义及其方法和要点[J]. 中国卫生统计, 1989, 6(1): 44-46.

[10] 刘瑞江, 张业旺, 闻崇炜, 等. 正交试验设计和分析方法研究[J]. 实验技术与管理, 2010, 27(9): 52-55.

[11] AN D, ZHU B W. Optimization of enzyme extraction condition of polysaccharide using surface methodology[J]. Agricultural Science and Technology, 2012, 13(9): 1977-1981.

[12] 王永菲, 王成国. 响应面法的理论与应用[J]. 中央民族大学学报: 自然科学版, 2005, 14(3): 236-240.

[13] VOHRa a, SaTYaNaRaYaNa T. Statistical optimization of the medium components by response surface methodology to enhance phytase production by Pichia anomala[J]. Process Biochemistry, 2002, 37(9): 999-1004.

[14] NIELSEN S S. 食品分析[M]. 2版. 北京: 中国轻工业出版社, 2002: 165-172.

[15] 陈永绥. 血清总蛋白测定不同双缩脲试剂及标准化评价[J]. 临床检验杂志, 1996, 14(3): 115-117.

[16] 杨爱华. 单试剂与双试剂双缩脲法测定血清总蛋白的比较[J]. 淮海医药, 2006, 24(4): 311-312.

[17] 陈晓梅, 刘雅文, 程熠, 等. 考马斯亮蓝法蛋白定量标准曲线稳定性观察[J]. 中国公共卫生, 2006, 22(3): 380-381.

[18] 张润楚, 郑海涛, 兰燕, 等. 实验设计与分析及参数优化[M]. 北京: 中国统计出版社, 2000: 341-382.

[19] 徐志敏, 刘希玉. 多元回归分析及其在辅助决策中的应用[J]. 计算机工程, 2004, 30(21): 129-131.

[20] 秦艳, 冯卫华, 白卫东, 等. 响应面分析法优化脐橙皮中多酚类物质提取工艺[J]. 食品工业科技, 2012, 33(20): 231-235.

[21] 杨佳, 张国文, 汪佳蓉, 等. 响应面分析法优化超声提取赣南脐橙皮中黄酮类化合物的工艺研究[J]. 食品科学, 2009, 30(16): 94-97.

[22] 李亚娜, 林永成, 佘志刚. 响应面分析法优化羊栖菜多糖的提取工艺[J]. 华南理工大学学报: 自然科学版, 2004, 32(11): 28-32.

[23] 刘军海, 任惠兰, 管波, 等. 响应面分析法优化白术多糖提取工艺[J]. 中成药, 2008, 30(5): 667-670.

[24] 佘小翠, 刘高峰. 响应面分析法在中药提取和制备工艺中的应用[J]. 中药材, 2010, 33(10): 1651-1655.