响应面法优化脉冲强光对面包表面细菌的杀菌工艺

王 勃1，刘 昕2，马 涛1,*，刘 贺1，何余堂1，惠丽娟1

（1.渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁 锦州 121013；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

摘 要：采用响应面法分析优化脉冲强光对面包表面杀菌的工艺参数。在单因素试验的基础上，选取闪照次数、闪照距离、闪照能量为影响因素，杀菌率为响应值，应用Box-Behnken试验设计建立数学模型，进行响应面分析。结果表明：优化条件为闪照次数30 次、闪照距离9 cm、闪照能量400 J，此时脉冲强光对面包表面的细菌杀菌率可达到99.99%，检测面包表面的细菌残留量远远小于1 500 CFU/g，符合国标有关规定，因此该模型可应用于实际生产。

关键词：脉冲强光；面包；菌落总数；杀菌率

Optimization of Pulsed Light Parameters for Enhanced Sterilization of Bacteria on Bread Surface by
Using Response Surface Methodology

WANG Bo1, LIU Xin 2, MA Tao1,*, LIU He1, HE Yu-tang1, HUI Li-juan1

(1. College of Chemistry, Chemical Engineering and Food Safety, Bohai University, Jinzhou 121013, China;

2. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Abstract: The pulsed light parameters for sterilizing the surface of bread were optimized by response surface methodology (RSM). The impacts of flash number, distance and energy on sterilization efficiency were investigated. The corresponding mathematical model was established by using Box-Behnken design. Results showed that the optimal pulsed light parameters were determined as 30, 9 cm and 400 J for flash number, distance and energy, respectively. Under the optimized conditions, the total number of bacterial colonies on bread was reduced by 99.99%. The number of residual bacterial colonies on the surface of bread was far less than 1 500 CFU/g, meeting the relevant national standards. Therefore, this method can be used in industrial practice.

Key words: pulsed light; bread; aerobic plate count; sterilization efficiency

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）18-0074-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201418014

脉冲强光杀菌是一种新兴的非热型杀菌技术，它利用瞬时、高强度、广波谱的脉冲光能量来杀灭食品中的微生物，具有杀菌均匀、操作安全、减少环境污染等优点[1]。高强度的脉冲强光可以迅速有效地灭活微生物[2]。脉冲强光是可见光、红外线和紫外线协同作用于微生物，破坏细菌的细胞壁，使细胞液蒸发，彻底破坏细胞结构，导致死亡。

该技术由于只处理食品的表面，从而对食品的风味和营养成分影响很小，可用于延长以透明物料包装的食品及新鲜食品的货架期，很有发展前途[3]。目前，国外对脉冲强光杀菌技术研究较多：Funes等[4]的研究认为脉冲强光杀菌是减少污染在苹果中的棒曲霉素的一种潜在杀菌方法。Aguiló-Aguayo等[5]的研究表明脉冲强光可以有效减少新鲜西红柿的微生物污染而不损害其营养价值。国内近几年才出现关于脉冲强光杀灭微生物的相关研究报道，但大部分都应用于流体[6-8]，有关于焙烤制品目前尚无报道。

面包丰富的营养成分适宜微生物生长繁殖，制作过程中灭菌不彻底及包装贮藏不当都可造成微生物超标[9]，影响面包食用安全，缩短货架期。面包生产普遍依靠添加防腐剂或者利用不同包装形式来延长其保质期[10-11]，在这个谈防腐剂色变的社会，选择一种安全、高效、低成本的杀菌方式势在必行。本实验采用脉冲强光杀菌技术，以闪照次数、闪照距离和闪照能量为参数，利用响应面法对面包表面细菌的杀菌条件进行优化，为降低面包表面初始菌量、延长其货架期及提高其食用安全性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

面包（配料为小麦粉、酵母、鸡蛋、食用盐、白砂糖） 辽宁省沈阳桃李食品股份有限公司；均质袋（25 cm×17 cm） 广州市鸿呈科贸易有限公司；平板计数培养基（BR） 北京奥博星生物计数有限责任公司。

1.2 仪器与设备

ZWB-I-01（LA50-800H）脉冲强光杀菌器 宁波中物光电杀菌技术有限公司；GMSX-280手提式压力蒸汽灭菌器 北京市永光明医疗仪器有限公司；AR224CN电子天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 金坛市鑫鑫试验仪器厂；MiniMix400W拍打均
质器 法国Interscience公司；LRH-150生化培养箱
上海一恒科技有限公司；EC2菌落计数仪 法国梅里埃生物公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

在无菌操作台中使用电子天平准确称量25.0 g面包样品（规格约为8 cm×8 cm，厚度为1 cm）。按照实验条件进行脉冲强光单灯处理，而后放入盛有225 mL无菌生理盐水的均质袋中，用拍击式均质机拍打2 min，制成1∶10的样品匀液，摇匀液进行活菌平板计数。之后按照GB 4789.2－2010《食品微生物检测：菌落总数的测定》进行样品稀释、菌落培养及总数的测定[12]。

取同等质量的面包不做任何处理，培养2 d后得到的活菌数即为对照样品平均菌落数。脉冲强光的杀菌效果依据微生物的杀菌率来评价，杀菌率的计算公式如下：

式中：A0为对照样品平均菌落数，A为被试样品平均菌落数。

1.3.2 单因素试验

选取闪照次数、闪照距离、闪照能量为试验影响因素，闪照频次为2 次/s。固定其中两个因素条件，分别对另外一个影响因素进行试验[13-14]。每个影响因素做3 次平行试验。

固定闪照次数30 次、闪照能量400 J，研究闪照距离为9、10、11、12、13 cm对面包杀菌效果的影响。固定闪照距离10 cm、闪照能量400 J，研究闪照次数为10、15、20、25、30 次对面包杀菌效果的影响。固定闪照次数30 次、闪照距离10 cm，研究闪照能量100、200、300、400、500 J对面包杀菌效果的影响。

1.3.3 响应面法优化脉冲强光对面包表面杀菌效果

根据单因素试验结果，以闪照次数（X1）、闪照距离（X2）、闪照能量（X3）3 个因素为自变量，在前期单因素试验基础上设定试验因素和水平值，以菌落的杀菌率为响应值进行响应面试验设计[15-17]。根据Box-Behnken试验设计原理[18]，通过Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行分析，预测脉冲强光杀菌的最佳工艺条件。各因素及水平编码如表1所示。

表 1 响应面优化试验因素水平表

Table 1 Factors and levels used in response surface design

注：表中各自变量编码值与真实值之间的关系为x1=（X1－20）/10，x2=（10－X2） /1，x3=（X3－300）/100。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 闪照次数对面包表面细菌杀菌效果的影响

图 1 闪照次数对杀菌效果的影响

Fig.1 Effect of flash time on sterilization efficiency

由图1可以看出，随着闪照次数的增大，杀菌率呈增加趋势。在闪照次数为10～20 次时，杀菌率提升的较为显著，在20～30 次时，杀菌率提高趋缓。闪照次数为25 次时，其杀菌率为99.59%，所残留的微生物菌落总数符合国标规定。考虑到节约能源，尽量使机器照射时间缩短，闪照次数在25 次时即可达到最佳的杀菌效果。

2.1.2 闪照距离对面包表面细菌杀菌效果的影响

图 2 闪照距离对杀菌效果的影响

Fig.2 Effect of flash distance on sterilization efficiency

由图2可以看出，随着闪照距离的增大，杀菌率呈减少趋势。这是因为随着脉冲强光与面包的距离越远，其杀菌效果越弱[19]。根据杀菌率的变化可以看出在闪照距离为9～10 cm时，杀菌效果几乎相同，距离增加会扩大杀菌面积，从而在实际应用中提高杀菌效率，因此闪照距离为10 cm时杀菌效果最好。

2.1.3 闪照能量对面包表面细菌杀菌效果的影响

图 3 闪照能量对杀菌效果的影响

Fig.3 Effect of flash energy on sterilization efficiency

由图3可以看出，随着闪照能量的增加，杀菌率呈增加趋势。在闪照能量为200～300 J时，杀菌率明显提高，而在400～500 J时，杀菌效果相差甚微，杀菌率提升的也不显著。在保证杀菌效果的前提下，降低功率可以节约能源及仪器损耗，因此当闪照能量为400 J时杀菌效果最佳[20]。

2.2 试验模型的建立及显著性检验

应用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken试验设计，以闪照次数、闪照距离、闪照能量为因素，以微生物杀菌率为响应值（Y），进行响应面试验，试验设计及结果如表2所示。

表 2 Box-Behnken试验设计及结果

Table 2 Box-Behnken design with experimental results for
sterilization efficiency

根据表2结果，将试验数据进行逐步回归拟合，得到以杀菌率（Y）为目标函数的二次回归方程模型为：

Y=97.44＋2.26X1＋0.88X2＋1.79X3＋0.23X1X2＋
0.54X1X3＋5×10－3X2X3－0.18X12－0.56X22－0.84X32

对该数学模型进行方差分析，以检验方程的有效性和各因子的偏回归系数。回归模型进行方差分析及可信度分析结果见表3。

表 3 响应面试验结果方差分析

Table 3 Analysis of variance for the fitted mathematical model

注：*.差异显著（P＜0.05）；**.差异极显著（P＜0.01）。

根据表3可知，模型P＜0.000 1，表示模型极显著，说明该模型成立，本试验方法可靠。失拟项不显著（P=0.959 3＞0.05），表明回归方程无失拟因素存在，回归方程拟合较好。进一步说明在试验范围内可以用来解释和预测实验结果。一次项X1、X2、X3的影响都是极显著（P＜0.000 1）；交互项X1X3（P=0.002 8＜0.01）对杀菌率的影响极显著；交互项X1X2（P=0.091 2＞0.05）、X2X3
（P=0.967 6＞0.05）对杀菌率的影响不显著。综上所述，影响因素的主次顺序为：X1（闪照次数）＞X3（闪照能量）＞X2（闪照距离）。模型的校正决定系数（R2Adj）为0.988 6，说明该模型能解释98.86%的响应值的变化，该方程与实际拟合的较好，能有效反应脉冲强光杀菌率与闪照次数、闪照距离和闪照能量之间的关系，因此所得的方程能预测响应值随各参数的变化规律[21-24]。闪照距离、闪照次数、闪照能量之间交互作用对杀菌率的影响见图4。

根据编码公式求出自变量X1、X2、X3的编码值为x1=1，x2=0.579，x3=0.745，对应的真实值为X1=30、X2=9.42、X3=374.52，即闪照次数30 次、闪照距离9.42 cm、闪照能量374.52 J，考虑到实际操作，将最佳条件修正为闪照次数30 次、闪照距离9 cm、闪照能量400 J，为检验响应面的可靠性，在最佳杀菌条件下进行验证实验，3 次平行实验取平均值，脉冲强光杀菌率为99.99%，检测到面包样品表面的细菌残留量几乎为0 CFU/g，远小于国标规定的1 500 CFU/g[25]。与对照样品相比，其菌落总数降低差异较为显著，结果接近预测值，说明回归方程能比较真实地模拟各因素对脉冲强光杀菌率的影响，证明该模型合理有效，具有一定的实际指导意义。

图 4 各因素交互作用对杀菌率影响的响应面

Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of three operating parameters on sterilization efficiency

3 结 论

采用脉冲强光杀菌技术可以有效杀灭面包表面污染的细菌，试验因素对杀菌效果影响主次顺序为：X1（闪照次数）＞X3（闪照能量）＞X2（闪照距离）。在单因素试验基础上，利用响应面法对脉冲强光在面包的杀菌条件进行优化，建立了闪照次数、闪照距离、闪照能量3 个因素对杀菌率的二次回归方程模型。经检验，模型准确率有效，可以用该模型分析预测各因素对脉冲强光杀菌率的影响。通过响应面优化模型确定脉冲强光杀菌的最佳条件为闪照次数30 次、闪照距离9 cm、闪照能量400 J，此条件下脉冲强光对面包表面细菌杀菌率可达到99.99%，检测面包表面的细菌残留量远远小于1 500 CFU/g，符合国标有关规定，因此该模型可为实际生产提供理论依据。

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